一株具有生理活性产胞外多糖植物乳杆菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株具有生理活性产胞外多糖植物乳杆菌及其应用。本发明提供了一株植物乳杆菌Lactobacillus plantarum SKT109，其保藏编号为CGMCC No.10130。上述的植物乳杆菌SKT109在权利要求1所述的植物乳杆菌SKT109和/或其菌悬液和/或其发酵液和/或其代谢产物在制备胞外多糖中的应用。本发明的实验证明，本发明发现了一株新的植物乳杆菌SKT109，其可产胞外多糖，利用其制备发酵酸乳可降低增稠剂和稳定剂的用量，同时赋予产品良好的口感和风味，本发明在发酵食品领域具有广阔的应用前景。
CGMCC No.10130
20141202
【专利说明】一株具有生理活性产胞外多糖植物乳杆菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，涉及乳品加工【技术领域】，尤其涉及一株具有生理活性 产胞外多糖植物乳杆菌及其应用。
【背景技术】
[0002] 乳酸菌胞外多糖（Exopolysaccharides，EPSs)是乳酸菌在生长代谢过程中分泌 到胞外的荚膜多糖或黏液多糖。乳酸菌胞外多糖作为一种新兴的天然食品级添加剂，具有 使用安全的天然优势。在食品加工领域，乳酸菌胞外多糖具有重要的工艺学功能，包括改善 发酵乳、干酪及多数乳制品的流变学特性、质构、口感以及风味等。乳酸菌胞外多糖可以提 高菌体对胃肠道表面的非特异性粘附能力，改善肠道菌群结构，保护菌体抵抗外界不利环 境，促进菌体对金属离子的吸附以及预防噬菌体的侵染等作用。在生物学活性方面，乳酸菌 胞外多糖具有抗肿瘤、抗氧化、免疫调节、降胆固醇、降血压等作用。
[0003] 近年来，部分具有特定生物活性的产胞外多糖嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、双歧 杆菌及乳酸杆菌作为附属发酵剂已成功应用于发酵乳制品生产中，并取得了良好的经济效 益。植物乳杆菌为革兰氏阳性菌，通常作为附属发酵剂与主发酵剂合并制备发酵乳。植物 乳杆菌作为乳酸菌中的一员在我国传统食品中有着广泛的来源。近年来我国学者已从发 酵蔬菜制品、发酵乳制品及肉制品中筛选出多株具有良好益生特性及功能特性的植物乳杆 菌。虽然植物乳杆菌的胞外多糖产量普遍较低，但作为天然的增稠剂，不仅能改善乳制品的 质地，同时还会赋予产品独特的风味，深受消费者的青睐。
[0004] 然而，从目前国内来看，研宄成熟并且能够在实践中推广应用的产胞外多糖植物 乳杆菌菌株并不是很多。因此，开展产胞外多糖植物乳杆菌的研宄，尤其是开展对提高植物 乳杆菌胞外多糖产量方法研宄、胞外多糖理化及生物活性的分析及产胞外多糖植物乳杆菌 在发酵乳中的应用研宄，对于改善发酵乳品质、开发具有特定功能性的乳酸菌发酵乳制品， 具有十分重要的研宄价值和经济价值。
【发明内容】
[0005] 本发明的一个目的是提供一株具有生理活性产胞外多糖植物乳杆菌 Lactobacillus plantarum SKT109。
[0006] 本发明提供的植物乳杆菌Lactobacillus plantarum SKT109,其保藏编号为 CGMCC No. 10130。
[0007] 上述的植物乳杆菌SKT109和/或其菌悬液和/或其发酵液和/或其代谢产物在 制备胞外多糖中的应用也是本发明保护的范围。
[0008] 上述应用中，所述胞外多糖具有如下1)和/或2)的特征：
[0009] 1)所述胞外多糖重均分子量为2. I X IO6Da ;
[0010] 2)所述胞外多糖组分包括果糖和葡萄糖，所述果糖和所述葡萄糖的物质摩尔比为 3 :1〇
[0011] 上述的植物乳杆菌SKT109和/或其菌悬液和/或其发酵液和/或其代谢产物在 制备抑制肿瘤或抑制肿瘤细胞增殖产品中的应用。
[0012] 上述应用中，所述肿瘤为结肠癌；所述肿瘤细胞为结肠癌细胞HT-29。
[0013] 上述的植物乳杆菌SKT109和/或其菌悬液和/或其发酵液和/或其代谢产物在 发酵酸乳中的应用。
[0014] 上述应用中，所述植物乳杆菌SKT109以SKT109发酵剂的形式存在；
[0015] 所述SKT109发酵剂按照如下方法制备：发酵上述的植物乳杆菌SKT109,收集发 酵产物，离心收集沉淀；将所述沉淀与冻干保护剂按照体积比为1:2混匀，冷冻干燥，得到 SKT109发酵剂；
[0016] 所述SKT109发酵剂中植物乳杆菌SKT109的活菌数浓度为101QCfu/g ;
[0017] 所述冻干保护剂由质量百分含量11 %脱脂乳粉、质量百分含量3%甘油、质量百 分含量1 %谷氨酸钠、质量百分含量1 %乳糖及质量百分含量84%水组成。
[0018] 本发明的另一个目的是提供一种制备胞外多糖的方法。
[0019] 本发明提供的方法，包括如下步骤：发酵上述的植物乳杆菌SKT109,收集发酵产 物，即得到胞外多糖。
[0020] 上述方法中，所述发酵的条件为：37°C培养24-36h。
[0021] 上述方法中，在所述收集发酵产物的步骤后，还包括如下步骤：
[0022] 1)用三氯乙酸加入所述发酵产物的上清至其质量体积百分比为6%，混匀，收集 上清液A ;
[0023] 2)用95 %乙醇水溶液加入所述上清液A，混匀，收集沉淀；
[0024] 3)溶解所述沉淀后进行透析，得到胞外多糖。
[0025] 由上述的方法制备的胞外多糖也是本发明保护的范围；所述胞外多糖具体具有如 下1)和/或2)的特征：
[0026] 1)所述胞外多糖重均分子量为2. I X IO6Da ;
[0027] 2)所述胞外多糖组分包括果糖和葡萄糖，所述果糖和所述葡萄糖的物质摩尔比为 3 :1〇
[0028] 菌株SKT109于2014年12月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研宄所， 邮编100101)，保藏号为CGMCC No. 10130,该菌株分类命名为植物乳杆菌（Lactobacillus pIantarum)〇
[0029] 本发明的实验证明，本发明发现了一株新的具有生理活性植物乳杆菌SKT109,其 可产胞外多糖，利用其制备发酵酸乳可降低增稠剂和稳定剂的用量，同时赋予产品良好的 口感和风味，本发明在发酵食品领域具有广阔的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0030] 图1为本发明具有生理活性产胞外多糖植物乳杆菌SKT109的细胞形态
[0031] 图2为本发明具有生理活性产胞外多糖植物乳杆菌SKT109在SDM培养基中37°C 培养56h期间的活菌数、发酵液粘度、pH及胞外多糖产量变化情况
[0032] 图3为本发明植物乳杆菌SKT109胞外多糖粗品分别在DEAE-52阴离子交换柱（A) 和Sepharose CL-6B琼脂糖凝胶柱（B)上的洗脱曲线；
[0033] 其中纵坐标为经过苯酚-硫酸法测得的在490nm处的吸光度值，横坐标为管号
[0034] 图4为本发明植物乳杆菌SKT109胞外多糖纯品的体外抑制结肠癌细胞HT-29增 殖
[0035] 图5为利用具有生理活性产胞外多糖植物乳杆菌SKT109制备的发酵酸乳与对照 组发酵酸乳在4°C冷藏21天期间的活菌数、胞外多糖含量、pH及持水力的变化
[0036] 图6为利用具有生理活性产胞外多糖植物乳杆菌SKT109制备的发酵酸乳（A)与 对照组发酵酸乳（B)在4°C冷藏期第1天时的风味离子图；
[0037] 图中标号与表3中化合物序号相对应
[0038] 图7为葡萄糖为基准物质的多糖标准曲线
【具体实施方式】
[0039] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0040] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0041] 下述实施例中所用培养基的制备方法如下：
[0042] 还原脱脂乳培养基（RSM):将脱脂乳粉按照110g/L用水还原成脱脂乳培养基， 115°C灭菌15min，冷却备用。
[0043] SDM液体培养基（IL):胰蛋白胨10. 0g、YNB (酵母氮源）6. 7g、K2HP042. 0g、无水乙 酸钠 5. 0g、柠檬酸钠 5. 0g、MgS04 ·7Η20 0· 2g、MnS04 ·Η20 0· 05g、葡萄糖 20. 0g、吐温 801mL、 lmol/L乙酸调ρΗ6· 6,121°C灭菌15min，冷却备用。
[0044] 植物乳杆菌选择性琼脂培养基（IL):蛋白胨10. 0g、酵母粉5. 0g、牛肉膏10. 0g、 D-山梨醇20. 0g、无水乙酸钠5. 0g、柠檬酸铵2. 0g、磷酸钾2. 0g、硫酸镁0. lg、硫酸锰 〇. 〇5g、溴甲酚紫0. 02g、环丙沙星0. 004g (过滤除菌）、琼脂粉15. 0g，蒸馏水lOOOmL，Imol/ L乙酸调ρΗ6· 0,121°C灭菌15min，冷却备用。
[0045] 实施例1、菌株的分离和鉴定
[0046] -、菌株的分离
[0047] 本发明从中国传统发酵制品西藏灵菇中分离筛选菌株。将西藏灵菇接种至RSM 中，于42°C培养8h至凝乳凝固。取0. 5mL凝乳加入含4. 5mL灭菌生理盐水的试管中逐级稀 释涂布于SDM培养基平板，37°C培养24?36h。挑取表面光滑、边缘整齐的乳白色单菌落， 将挑选出的菌落进行反复划线培养获得纯化的菌株。将纯化后的菌株依次经过过氧化氢酶 实验、革兰氏染色，筛选出氧化氢酶阴性、革兰氏阳性菌株。将其接种到SDM液体培养基中 培养后，加入20%甘油，-80°C冰箱保存备用。
[0048] 采用苯酚硫酸法测定多株纯培养菌株胞外多糖的产量，筛选出一株胞外多糖产量 高的菌株，将其命名为SKT109。
[0049] 上述苯酚硫酸法测定菌株胞外多糖产量的方法如下：
[0050] 1)葡萄糖标准曲线的绘制
[0051] 取适量分析纯葡萄糖置于鼓风干燥箱中80°C干燥2h，冷却后准确称取葡萄糖 IOOmg于500mL容量瓶中，加水至刻度。反应体系各溶液体积按表1添加，先将标准葡萄糖 溶液加入到具塞刻度试管中，再加入6 %的苯酚溶液，最后加入IOmL浓硫酸混匀静置，待其 冷却后于490nm处测定吸光值，每组做3个平行。以葡萄糖含量（mg/L)为横坐标，吸光度 (A490)为纵坐标绘制标准曲线，见表1。
[0052] 表1为苯酚-硫酸法标准曲线绘制
[0053]
【权利要求】
1. 一 株植物乳杆菌 Lactobacillus plantarum SKT109，其保藏编号为 CGMCC No.10130。
2. 权利要求1所述的植物乳杆菌SKT109和/或其菌悬液和/或其发酵液和/或其代 谢产物在制备胞外多糖中的应用。
3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于： 所述胞外多糖具有如下1)和/或2)的特征： 1) 所述胞外多糖重均分子量为2. 1 X 106Da ; 2) 所述胞外多糖组分包括果糖和葡萄糖，所述果糖和所述葡萄糖的物质摩尔比为3 : 1〇
4. 权利要求1所述的植物乳杆菌SKT109和/或其菌悬液和/或其发酵液和/或其代 谢产物在制备抑制肿瘤或抑制肿瘤细胞增殖产品中的应用。
5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述肿瘤为结肠癌；所述肿瘤细胞为结肠 癌细胞HT-29。
6. 权利要求1所述的植物乳杆菌SKT109和/或其菌悬液和/或其发酵液和/或其代 谢产物在发酵酸乳中的应用。
7. -种制备胞外多糖的方法，包括如下步骤：发酵权利要求1所述的植物乳杆菌 SKT109,收集发酵产物，即得到胞外多糖。
8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述发酵的条件为：37°C培养24-36h。
9. 由权利要求7或8中所述的方法制备的胞外多糖；所述胞外多糖具体具有如下1)和 /或2)的特征： 1) 所述胞外多糖重均分子量为2. 1 X 106Da ; 2) 所述胞外多糖组分包括果糖和葡萄糖，所述果糖和所述葡萄糖的物质摩尔比为3 : 1〇
【文档编号】A23C9/123GK104498402SQ201410797909
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月19日 优先权日:2014年12月19日
【发明者】杨贞耐, 王辑, 田政, 杨亚威, 郑喆 申请人:北京工商大学