一种新型的植酸酶的制作方法
【专利摘要】本发明目的是提供一种新型的植酸酶，即在植酸酶UNK的基础上通过大量的突变筛选，最终获得一种耐热性得到显著提高的植酸酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3。本发明以植酸酶UNK为基础，提供了包含T161P单点突变的新型植酸酶UNK1，包含T161P、D185N和N204C三点突变的植酸酶突变体UNK3和包含T161P、D185N、S189N、N204C和S240P五点突变的植酸酶突变体UNK5。与植酸酶UNK相比，UNK1、UNK3和UNK5的最适作用温度和最适作用pH没有发生改变，最适作用温度均为75℃，最适作用pH均为5.0，但其耐热性得到显著提升。
【专利说明】一种新型的植酸酶
【技术领域】
[0001] 本发明属于酶基因改造【技术领域】，具体涉及一种新型的植酸酶。 技术背景
[0002] 植酸酶（Phytase)即肌醇六磷酸水解酶（EC3. 1. 3. 8)，是催化植酸以及植酸盐水 解成肌醇与磷酸（或磷酸盐）的一类酶的总称。植酸酶作为一种优良的饲料添加剂目前被 广泛地应用于畜牧业生产中，它能够提高动物对磷元素的利用率，以及蛋白质、氨基酸、各 种矿物元素的利用率，解除动物植物性饲料中植酸的抗营养作用，提高植物性饲料的营养 价值，同时降低动物排泄物对环境的污染，在动物生产以及在环境保护中，是极为有效的一 种添加剂，具有重要的应用价值。另外，农业部、环保部联合印发的《全国畜禽养殖污染防 治"十二五"规划》中指出，将重点治理畜禽养殖污染，这也给植酸酶应用提供了更有利的机 遇。
[0003] 现工业化生产的植酸酶主要有来源于黑曲霉的真菌植酸酶和来源于大肠杆菌的 细菌植酸酶两种。其中来源于大肠杆菌的植酸酶APPA具有高比活性及良好的消化道稳定 性等特点。目前主要通过在粉末饲料直接添加或颗粒饲料后喷涂的方法应用在饲料行业。 细菌植酸酶APPA热稳定性较差，使APPA植酸酶在颗粒饲料的应用受到限制。采用饲料制 粒后植酸酶液体喷涂到饲料上的方法不仅增加设备投入，而且对酶制剂的稳定性、饲料中 分布均一性都无法很好的保证。因此，提高植酸酶的热稳定性对目前饲用植酸酶具有重要 意义。
【发明内容】
[0004] 本发明为解决现有技术问题，提供了一种新型的植酸酶及其应用，即在植酸酶UNK 的基础上通过大量的突变筛选，最终获得一种耐热性得到显著提高的植酸酶，为其在饲料 领域的广泛使用奠定了基础。
[0005] 本发明一方面提供了一种新型的植酸酶，是氨基酸序列为SEQ ID NO: 1的植酸酶 的第161位氨基酸由Thr变为Pro。
[0006] 上述新型植酸酶的氨基酸序列为SEQ ID N0:3,其一种编码基因的核酸序列为SEQ ID N0:4。
[0007] 本发明还包括携带有编码序列为SEQ ID NO:4的植酸酶基因的质粒。
[0008] 本发明还提供另一种新型的植酸酶，是氨基酸序列为SEQ ID NO:3的植酸酶的第 185位氨基酸由Asp变为Asn，第204位氨基酸由Asn变为Cys。
[0009] 上述植酸酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:5,其一种编码基因的核酸序列为SEQ ID N0:6。
[0010] 本发明还包括携带有编码序列为SEQ ID NO:6的植酸酶基因的质粒。
[0011] 本发明再提供提供一种植酸酶突变体，是氨基酸序列为SEQ ID NO:5的植酸酶的 第189位氨基酸由Ser变为Asn,第240位氨基酸由Ser变为Pro。
[0012] 上述植酸酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:7,其一种编码基因的核酸序列为SEQ ID N0:8。
[0013] 本发明还包括携带有编码序列为SEQ ID NO:8的植酸酶基因的质粒。
[0014] 本发明还提供了 一种宿主细胞，包含上述重组表达载体。
[0015] 所述宿主细胞为毕赤酵母（Pichia pastoris)。
[0016] 本发明以植酸酶UNK为基础，提供了包含T161P单点突变的新型植酸酶UNK1，包含 T161P、D185N和N204C三点突变的植酸酶突变体UNK3和包含T161P、D185N、S189N、N204C 和S240P五点突变的植酸酶突变体UNK5。与植酸酶UNK相比，UNK1、UNK3和UNK5的最适 作用温度和最适作用PH没有发生改变，最适作用温度均为75°C，最适作用pH均为5. 0,但 其耐热性得到显著提升，80°C处理5min后，植酸酶UNK的残留酶活低于25%，而其突变体 UNK1、UNK3和UNK5的残留酶活比植酸酶UNK分别提高了 10. 00%、24. 06%和39. 75%，从 而有利于其在饲料中的广泛应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0017] 图1为重组质粒图谱；
[0018] 图2为植酸酶UNK及其突变体UNKl、UNK3和UNK5耐热性比较图。
【具体实施方式】
[0019] 以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，可参照《分子克隆实验指南》 (第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。 所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得，而不仅限于具体实施例的记 载。
[0020] 实验材料和试剂：
[0021] 菌株与载体：大肠杆菌DH5a、毕赤酵母GS115、载体pPIC9k、Amp、G418购自 Invitrogen 公司。
[0022] 酶与试剂盒：PCR酶及连接酶购买自Takara公司，限制性内切酶购自Fermentas 公司，质粒提取试剂盒及胶纯化回收试剂盒购自Omega公司，GeneMorph II随机诱变试剂 盒购自北京博迈斯生物科技有限公司。
[0023] 培养基配方：
[0024] 大肠杆菌培养基（LB培养基）：0· 5%酵母提取物，1%蛋白胨，1% NaCL, ρΗ7· 0);
[0025] LB-AMP培养基：LB培养基加 100 μ g/mL氨苄青霉素；
[0026] 酵母培养基（YH)培养基）：1 %酵母提取物、2 %蛋白胨2 %葡萄糖；
[0027] 酵母筛选培养基（MD培养基）：2 %蛋白胨、2 %琼脂糖；
[0028] BMGY培养基：2%蛋白胨，1%酵母提取物，IOOmM磷酸钾缓冲液（pH6. 0),1.34% YNB，4X 10-5生物素，1 %甘油；
[0029] BMMY培养基：2%蛋白胨，1%酵母提取物，IOOmM磷酸钾缓冲液（pH6. 0),1.34% YNB，4X10-5 生物素，0. 5% 甲醇。
[0030] 下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
[0031] 实施例1 :大肠杆菌植酸酶突变体基因的合成与重组质粒的获得
[0032] 以核苷酸序列为SEQ ID NO :2所示植酸酶（命名为UNK)的基因序列为参考，在上 海捷瑞生物工程有限公司人工合成该基因，其编码氨基酸序列为SEQ ID NO :1。
[0033] 根据植酸酶UNK基因的Y端设计PCR引物含有EcoRI内切酶位点，3 ^端设计PCR 引物含NotI内切酶位点，引物序列如下：
[0034] 5 ' 端引物 UNK-F : CGCGAATTCCAGTCAGAACCAGAGTTGAAGTT ;
[0035] 3 ' 端引物：UNK-R : CGCGAATTCCAGTCAGAACCAGAGTTGAAGTT ;
[0036] 以合成的植酸酶基因 UNK为模板，用上述引物进行PCR扩增，PCR扩增体系为：模 板 I. 0 μ L,上游引物UNK-F I. 0 μ L,下游引物UNK-F I. 0 μ L, 5XPS BufferlO. 0 μ L, dNTPs (2. 5mM) 4· 0 μ L, Primer-StarDNA 聚合酶 I. 0 μ L，ddH20 32. 0 μ L，反应总体系为 50 μ L。PCR 循环程序为：94°C预变性 4min，30cycles:94°C 30sec，55°C 40sec，72°C 2min，72°C IOmin ; 胶回收PCR产物，EcoRI、NotI进行酶切处理后与经同样酶切后的pPIC-9k载体16°C过夜连 接并转化大肠杆菌DH5a，涂布于LB+Amp平板，37°C倒置培养，待转化子出现后，菌落PCR(反 应体系：模板挑取的单克隆，rTaqDNA 聚合酶 0· 5ul，10XBuffer2. Ομ L, dNTPs(2. 5mM)2. 0 μ L, 5' AOX 引物（IOM) :0· 5 μ L, 3' AOX 引物：0· 5 μ L，ddH2014. 5 μ L，反应程序：95°C预变性 4min，30cycles:94°C 30sec，55°C 40sec，72°C 2min，72°C 5min)验证阳性克隆子，经测序验 证，最后获得正确的重组质粒，命名为PPIC9K-UNK。
[0037] 实施例2植酸酶突变体全长及重组质粒的获得
[0038] 为了进一步提高植酸酶UNK的热稳定性，对植酸酶UNK的基因进行蛋白结构分析， 该蛋白有两个结构域：N端的134个氨基酸残基与C端的152个氨基酸残基共同组成结构 域1，剩余中间124氨基酸残基组成结构域2,保守序列和活性中心均位于结构域1中，在不 破坏蛋白二级结构与活性中心的前提下，进一步对位点进行突变。
[0039] 设计 PCR 引物 UNK-Fl、UNK-Rl :
[0040] UNK-Fl :GGCGAATTC CAGTCAGAACCAGAGTTGAAGTT(下划线为限制性内切酶EcoRI 识 别位点），
[0041] UNK-Rl :ATAGCGGCCGC TTACAAGGAACAAGCAGGGAT(下划线为限制性内切酶 NotI 识 别位点），
[0042] 以植酸酶UNK的基因为模板，以上述引物用GeneMorph II随机突变PCR试剂盒 (Stratagene)进行PCR扩增，胶回收PCR产物，EcoRI、NotI进行酶切处理后与经同样酶切 后的pET21a载体连接，转化至大肠杆菌BL21 (DE3)中，涂布于LB+Amp平板，37°C倒置培养， 待转化子出现后，用牙签逐个挑至96孔板，每个孔中加入150ul含有0. ImM IPTG的LB+Amp 培养基，37 °C 220rpm培养6h左右，离心弃上清，菌体用缓冲液重悬，反复冻融破壁，获得含 有植酸酶UNK的大肠杆菌细胞裂解液。
[0043] 分别取出40ul裂解液至两块新的96孔板,其中一块板于80°C处理IOmin后，两 块96孔板都加入80ul底物，于37°C反应30min后加入80ul终止液（钒酸铵：钥酸铵：硝 酸=1:1:2)测定生成的无机磷含量，不同的突变子高温处理后保持的活性不同。
[0044] 实验结果表明，有些突变对植酸酶UNK的耐热性没有影响，有些突变甚至使其耐 热性或酶活变得更差了；另外还有些突变，虽然能提高植酸酶UNK对温度的耐受性，但突变 后其酶学性质发生了显著的变化，这些均不符合要求。最终， 申请人:筛选得到既能显著提高 植酸酶UNK的耐热性，又不会影响其酶活及原有酶学性质的突变位点及位点的组合：T161P 单点突变，T161P、D185N 和 N204C 三点突变，以及 T161P、D185N、S189N、N204C 和 S240P 五 点突变。
[0045] 将上述含T161P单点突变的植酸酶突变体命名为UNK1，其氨基酸序列为SEQ ID N0:3,参照该序列得到一个编码核苷酸序列为SEQ ID N0:4。
[0046] 将上述含T161P、D185N和N204C三点突变的植酸酶突变体命名为UNK3,其氨基酸 序列为SEQ ID N0:5,参照该序列得到一个编码核苷酸序列为SEQ ID N0:6。
[0047] 将上述含T161P、D185N、S189N、N204C和S240P五点突变的植酸酶突变体命名 为UNK35,其氨基酸序列为SEQ ID NO: 7,参照该序列得到一个编码核苷酸序列为SEQ ID N0:8。
[0048] 2. 1突变体基因的合成及扩增
[0049] 由上海捷瑞生物工程有限公司依照毕赤酵母的密码偏爱性分别优化合成SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8这三条突变体的基因序列，并且在合成序列5'和3'两 端分别加上EcoRI和NotI两个酶切位点。
[0050] 2. 3突变体基因表达载体的构建
[0051] 将2. 1合成的3条基因序列分别进行EcoRI和NotI双酶切，然后与经同样酶切后 的pPIC-9k载体16°C过夜连接，并转化大肠杆菌DH5a，涂布于LB+Amp平板，37°C倒置培养， 待转化子出现后，菌落PCR(反应体系及程序同实施例1)验证阳性克隆子，经测序验证后最 后获得了正确的重组表达质粒，3个重组表达质粒分别命名为pPIC9K-UNKl、pPIC9K-UNK3 和 PPIC9K-UNK5。
[0052] 实施例3毕赤酵母工程菌株的构建
[0053] 3. 1酵母感受态制备
[0054] 将毕赤酵母GSl 15菌株进行YPD平板活化，30°C培养48h后接种活化的GSl 15单克 隆于6mL YH)液体培养基中，30°C、220rpm，培养约12h后转接菌液于装有30πι1ΥΗ)液体培养 基的三角瓶中，30°C、220rpm培养约5h经紫外分光光度计检测其菌体密度，待其0D600值在 I. I - 1. 3范围后，4°C 9, OOOrpm离心2min分别收集4ml菌体至灭菌EP管中，轻轻弃上清， 用灭菌的滤纸吸干残留的上清后用预冷的ImL灭菌水重悬菌体，4°C、9, OOOrpm离心2min， 轻轻弃上清，重复用Iml灭菌水洗一遍后4°C、9, OOOrpm离心2min，轻轻弃上清，预冷的ImL 山梨醇（lmol/L)重悬菌体；4°C、9,000rpm离心2min，轻轻弃上清，预冷的100-150μ 1山梨 醇（lmol/L)轻柔重悬菌体。
[0055] 3. 2转化和筛选
[0056] 分别将上述表达质粒 pPIC9K-UNK、pPIC9K-UNKl、pPIC9K-UNK3 和 pPIC9K-UNK5 用 Sac I进行线性化，线性化片段纯化回收后通过电穿孔法分别转化毕赤酵母GSl 15,在MD平 板上筛选得到毕赤酵母重组菌株 GSl 15/pPIC9K-UNK、GSl 15/pPIC9K-UNKl、pPIC9K-UNK3 和 GS115/pPIC9K-UNK5,然后在含不同浓度遗传霉素的YPD平板（0. 5mg/mL-8mg/mL)上筛选多 拷贝的阳性转化子。
[0057] 将毕赤酵母重组菌株GS115/pPIC9K_UNK的一个阳性转化子命名为毕赤酵母 UNK(Pichia pastoris UNK)，重组菌株GS115/pPIC9K-UNKl的一个阳性转化子命名为毕赤 酵母^1(1(?丨(*丨3口38如1^8^1(1)，重组菌株65115^^1091^疆3的一个阳性转化子命名 为毕赤酵母UNK3 (Pichia pastoris UNK3)，重组菌株GS115/pPIC9K-UNK5的一个阳性转化 子命名为毕赤酵母UNK5(Pichia pastoris UNK5)。然后将毕赤酵母UNK、UNK1、UNK3和UNK5 分别转接于BMGY培养基中，30°C、250rpm振荡培养Id ;再转入BMMY培养基中，30°C、250rpm 振荡培养；每天添加〇. 5%的甲醇，诱导表达4d ;9000rpm离心IOmin去除菌体，即得到分别 含植酸酶UNK、UNK1、UNK3和UNK5的发酵上清液。（1)植酸酶酶活单位的定义
[0058] 在温度为37°C、pH为5. 0的条件下，每分钟从浓度为5. Ommol/L植酸钠中释放 1 μ mol无机磷，即为一个植酸酶活性单位，以U表示。
[0059] (2)植酸酶酶活测定方法
[0060] 取甲、乙两支25mL比色管，各加入1.8mL乙酸缓冲液（PH 5. 0)、0. 2mL样品反应 液，混匀，37°C预热5min。在甲管中加入4mL底物溶液，乙管中加入4mL终止液，混匀，37°C反 应30min，反应结束后甲管中加入4mL终止液，乙管中加入4mL底物溶液，混匀。静置lOmin， 分别在415nm波长处测定吸光值。每种样品作3个平行，取吸光值的平均值，通过标准曲线 用回归直线方程计算植酸酶活性。
[0061] 酶活 X = FX(V(mX30)
[0062] 其中：X-酶活力单位，U/g(mL);
[0063] F--试样溶液反应前的总稀释倍数；
[0064] C--根据实际样液的吸光值由直线回归方程计算出的酶活性，U ;
[0065] m-试样质量或体积，g/mL ;
[0066] 30--反应时间；
[0067] 按照上述方法测定毕赤酵母UNK、UNK1、UNK3和UNK5发酵上清液的酶活分别为 166U/ml、145U/mL、205U/mL、195U/mL，从而表明本发明构建得到的上述四株工程菌株均能 高效重组表达对应的植酸酶。
[0068] 3. 2发酵验证
[0069] 在10升发酵罐上分别进行毕赤酵母UNK、UNK1、UNK3和UNK5的发酵，发酵使用的 培养基配方为：硫酸钙I. lg/L、磷酸二氢钾5. 5g/L、磷酸二氢铵55g/L、硫酸镁16. 4g/L、硫 酸钾20. 3g/L、氢氧化钾L 65g/L、消泡剂(λ 05%。
[0070] 发酵生产工艺：ρΗ5· 0、温度30°C、搅拌速率300rpm、通风量I. O-L 5 (ν/ν)、溶氧控 制在20%以上。
[0071] 整个发酵过程分为三个阶段：第一阶段为菌体培养阶段，按7%比例接入种子， 30°C培养24-26h，以补完葡萄糖为标志；第二阶段为饥饿阶段，当葡萄糖补完之后，不流加 任何碳源，当溶氧上升至80%以上表明该阶段结束，为期约30-60min ;第三阶段为诱导表 达阶段，流加甲醇诱导，并且保持溶氧在20%以上，培养时间在150-180h之间；发酵结束 后，发酵液通过板框过滤机处理后获得粗酶液。
[0072] 采用实施例3中3. 1所述植酸酶酶活测定方法对上述粗酶液进行检测，毕赤酵母 UNK最终的发酵酶活为10317U/mL，毕赤酵母UNKl最终的发酵酶活为10401U/mL，毕赤酵母 UNK3最终的发酵酶活为11013U/mL，毕赤酵母UNK5最终的发酵酶活为10913U/mL。
[0073] 实施例4酶学特性分析
[0074] 4. 1最适作用温度
[0075] 分别在 30 °C、35 °C、40 °C、45 °C、50 °C、55 °C、60 °C、65 °C、70 °C、75 °C、80 °C、85 ?， pH5. 5条件下测定上述毕赤酵母UNK、UNK1、UNK3和UNK5发酵所得粗酶液的酶活，以最高酶 活力为100%，计算相对酶活。结果显示，植酸酶UNK及其突变体UNKl、UNK3和UNK5的最 适作用温度均为75°C。
[0076] 4. 2最适作用pH值
[0077] 分别用 ρΗ2· 0、2· 5、3· 0、3· 5、4· 0、4· 5、5· 0、5· 5、6· 0、6· 5、7. 0 的 0· IM 乙酸-乙酸 钠缓冲液对上述毕赤酵母UNK、UNKl、UNK3和UNK5发酵所得粗酶液进行稀释，在37 °C条件下 测定酶活，以最高酶活力为100%，计算相对酶活。结果显示：植酸酶UNK及其突变体UNK1、 UNK3和UNK5的最适作用pH均为5. 0。
[0078] 4. 3耐热性分析
[0079] 用预热IOmin的pH 0. 25M乙酸钠缓冲液分别将上述毕赤酵母UNK、UNK1、UNK3和 UNK5发酵所得粗酶液稀释10倍，混合均匀，80°C处理5min，结束时取样并冷却至室温，然后 测定稀释后的酶活，以未处理样品的酶活计100%，计算残留酶活。
[0080] 结果如图2所示：80°C处理5min后，植酸酶UNK的残留酶活低于25%，而其突变 体UNKl、UNK3和UNK5的残留酶活比植酸酶UNK分别提高了 10. 00%、24. 06%和39. 75%， 从而说明突变导致植酸酶的耐热性得到显著提高。
[0081] 综上所述，本发明以植酸酶UNK为基础，提供了包含T161P单点突变的植酸酶突变 体UNK1，包含T161P、D185N和N204C三点突变的植酸酶突变体UNK3和包含T161P、D185N、 S189N、N204C和S240P五点突变的植酸酶突变体UNK5。与UNK相比，UNK1、UNK3和UNK5的 最适作用温度和最适作用PH没有发生改变，但其耐热性得到显著提升，从而有利于植酸酶 在饲料中的广泛应用。
【权利要求】
1. 一种新型的植酸酶，其特征在于，所述的植酸酶是氨基酸序列为SEQ IDN0:1的植酸 酶的第161位氨基酸由Thr变为Pro。
2. 如权利要求1所述的植酸酶，其特征在于，所述的植酸酶的氨基酸序列为SEQ ID N0:3。
3. -种基因，其特征在于，所述的基因用于编码权利要求1所述的植酸酶。
4. 如权利要求1所述的基因，其特征在于，所述的基因的核酸序列为SEQ IDN0:4。
5. -种植酸酶，其特征在于，所述的植酸酶是权利要求1所述的植酸酶的第185位氨基 酸由Asp变为Asn，第204位氨基酸由Asn变为Cys ;其氨基酸序列为SEQ ID N0:5。
6. 编码权利要求5所述的植酸酶的基因，其特征在于，所述的基因的核酸序列为SEQ ID N0:6。
7. -种植酸酶，其特征在于，所述的植酸酶是权利要求5所述的植酸酶的第189位氨基 酸由Ser变为Asn,第240位氨基酸由Ser变为Pro ;其氨基酸序列为SEQ ID NO:7。
8. 编码权利要求7所述的植酸酶的基因，其特征在于，所述的基因的核酸序列为SEQ ID N0:8。
9. 一种重组宿主细胞，其特征在于，所述的重组宿主细胞为转化/转染有携带权利要 求3、6、8任一项所述的植酸酶基因的质粒的宿主细胞。
10. 如权利要求9所述的重组宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞为毕赤酵母 (Pichia pastoris)〇
【文档编号】C12N9/16GK104404012SQ201410797424
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年12月19日 优先权日:2014年12月19日
【发明者】吴秀秀, 王坤, 王华明 申请人:青岛蔚蓝生物集团有限公司