专利名称：转植酸酶基因玉米籽粒中植酸酶的提取与检测方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种转基因作物植酸酶的提取与检测方法优 化，具体是一种适用于转植酸酶基因玉米籽粒中植酸酶的提取与检测方法。
背景技术：
自1990年，美国孟山都公司和迪卡公司首次获得转基因玉米以来，转基因玉米产 业取得了巨大的成功。2009年，全球转基因玉米种植面积1. 58亿公顷，占全球转基因作物 种植面积的26%。2009年，转植酸酶基因玉米获得农业部正式颁发的农业转基因生物生产 应用安全证书。植酸酶(Phytase)属于磷酸水解酶，是将植物中的植酸及其盐类水解为可 以利用的无机磷酸和肌醇的酶的统称。植酸酶有3种类型肌醇六磷酸-3-磷酸水解酶、肌 醇六磷酸-6-磷酸水解酶和非特性的正磷酸盐单酯磷酸水解酶。植酸酶的生物功能主要表现在(1)植酸酶能够催化分解植酸，提高植酸磷的利 用率，减少环境磷污染；(2)消除植酸对矿物元素、蛋白质、营养作用，提高植物的营养价值。磷是动物体内不可缺少的营养元素，磷的缺乏会影响动物生长，导致动物的生产 性能下降。由于单胃动物(如猪，家禽和鱼类等)消化道缺乏分解植酸这种有机磷的酶类， 几乎不能利用饲料中丰富的植酸。因此需要在饲料中添加价格昂贵的磷酸氢钙等无机磷来 满足动物的需要。这样既造成磷源浪费，又导致未被利用的植酸随动物粪便排泄造成严重 的环境污染。因此，将植酸酶基因转入到植物中，可以获得植酸酶含量较高的饲料原料，减 轻浪费和环境污染。目前饲料中植酸酶活性测定已有国家标准，但是植物中植酸酶活性测 定方法尚无国家规定的方法。本发明对植物中植酸酶活性测定中的提取方法与检测方法进 行研究，目的是优化提取条件与检测条件，为测定结果的准确性提供保证。经过查阅文献资料发现，从2009年10月1日起，由国家质检总局(CN-GB)发布的 GB/T 18634-2009《饲用植酸酶活性的测定一分光光度法》标准正式实施。然而，在对现有 专利和文献的分析中发现，还没有任何转植酸酶基因玉米籽粒中植酸酶的提取与检测方法 的专利和文献报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种转植酸酶基因玉米籽粒中植酸酶提取的最佳条件，本发 明的另一个目是研究优化植酸酶的最佳检测方法，以克服在测定植酸酶活性的过程中发生 的酶活性变化较大，数值不稳定的弊端，为进一步测定植酸酶活性结果准确性提供保障。为实现上述目的，本发明提供一种转植酸酶基因玉米籽粒中植酸酶的提取方法， 其特征在于提取液PH为5. 50，料液比为1 4，提取时间为15min。一种转植酸酶基因玉米籽粒中植酸酶的检测方法，其特征在于将上述提取物与 浓度为0. lmmol/L的底物应用液在pH为5. 50的乙酸缓冲溶液中反应30min。酶的化学本质是蛋白质，在提取和检测过程中容易受到多种因素的影响和制约。本发明采用正交试验法对转基因玉米中植酸酶的提取方法和检测方法进行优化，主要研究 了 PH值、料液比和提取时间等因素对植酸酶提取的影响，以及反应时间、底物应用液浓度、 PH值等因素对植酸酶测定的影响。本发明的有益效果是优化转植酸酶基因玉米籽粒中植酸酶的提取方法，在《饲用 植酸酶活性的测定--分光光度法》标准的基础上，进行优化实验，最终确定转植酸酶基因玉 米籽粒中植酸酶提取与测定的最佳方法，为构建转植酸酶基因玉米安全评价体系提供相关 数据。
图1为本发明的磷标准曲线示意图。横坐标为无机磷的量，纵坐标为吸光度值。直 线回归方程为 y = 0. 366X+0. 0054，R2 = 0. 9999。图2为本发明的不同料液比对植酸酶活性的影响示意图。横坐标为不同料液比， 纵坐标为植酸酶活性。图3为本发明的不同提取时间对植酸酶活性的影响示意图。横坐标为提取时间， 纵坐标为植酸酶活性。图4为本发明的不同PH值对植酸酶活性的影响示意图。横坐标为不同pH值，纵 坐标为植酸酶活性。图5为本发明的反应时间比对植酸酶活性检测的影响示意图。横坐标为不同反应 时间，纵坐标为植酸酶活性。图6为本发明的不同底物应用液浓度对植酸酶活性检测的影响示意图。横坐标为 底物浓度，纵坐标为植酸酶活性。图7为本发明的不同pH值对植酸酶活性检测的影响示意图。横坐标为不同pH值， 纵坐标为植酸酶活性。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。此实施例仅用于说明本发明而不用于 限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件操作。一实验材料转植酸酶基因玉米及其受体玉米种植在国家转基因植物中试与产业化基地(公 主岭)，玉米籽粒采集成熟期的转植酸酶基因玉米及其受体玉米，粉碎机粉碎，放于_70°C 冰箱中保存。二试剂植酸酶标准品(30U/g)，购于sigma公司，植酸钠、无水乙酸钠、钼酸铵、偏钒酸铵 均购于BBI公司。磷酸二氢钾GBW13104购于中国计量科学研究院。三主要仪器设备1457A MP8-2 电子分析天平，SARTORIUS GMBH G0TTINGEN ；HZS-H超级水浴恒温振荡器，哈尔滨东联电子技术开发有限公司；KQ-500VDV型双频数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；UV-754型紫外可见分光光度计，山东高密彩虹分析仪器有限公司。
四实验方法和过程1标准曲线的绘制准确称取0. 6804g在105°C恒重的基准磷酸二氢钾于IOOml容量瓶中，用pH5. 50 的乙酸缓冲溶液溶解，并定容至刻度，浓度为50.0mmol/L。用提取液倍比稀释成浓度为 25. 0mmol/L、12. 5mmol/L、6. 25mmol/L、3. 125mmol/L、l. 5625mmol/L 的标准系列溶液。在试管中分别加入上述标准系列溶液0. Iml, 0. 9ml乙酸缓冲溶液，37 °C保温 5min,加入底物应用液2. 0ml，准确计时30min，最后加入显色剂2. 0ml，充分混勻，IOmin后 在415nm波长下测定吸光度值。以无机磷的量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲 线，列出直线回归方程。2正交试验法优化植酸酶的提取方法(1)料液比对植酸酶活性的影响准确称取5. Og的玉米籽粒样品6份，按料液比1 1、1 2、1 3、1 4、1 5、 1 6的比例向6份样品中分别加入5ml、10ml、15ml、20ml、25ml、30mlpH5. 50的提取液，超 声提取15min，水浴震荡15min，得提取物备用；在试管中依次加入0. 9ml乙酸缓冲溶液，0. Iml提取物，37°C保温5min，加入底物 应用液2. 0ml，准确计时30min，最后加入显色剂2. 0ml，充分混勻，IOmin后在415nm波长下 测定吸光度值，同时做样品空白，即先加入显色剂2. 0ml，然后再加入底物应用液2. Oml0(2)提取时间对植酸酶活性的影响准确称取5. Og玉米籽粒样品6份，加入pH5. 50的提取液20. 0ml，超声提取时间分 别为5min、10min、15min、30min、45min、60min，水浴震荡相同的时间。检测籽粒中植酸酶活 性。检测方法同2(1)。(3) pH值对植酸酶活性的影响准确称取5. Og玉米籽粒样品6份，分别加入pH为4. 00,4. 50,5. 00,5. 50,6. 00、 6. 50的提取液20. 0ml，超声提取15min，水浴震荡15min。检测籽粒中植酸酶活性。检测方 法同2⑴。(4)正交试验根据影响植酸酶活性的单因素分析结果确定正交试验的实验因素水平，采用 L9(33)正交表优化提取条件。3正交试验法优化植酸酶的检测方法(1)反应时间对植酸酶活性检测的影响准确称取5. Og玉米籽粒样品1份，加入提取液20. Oml。超声提取时间15min，水 浴震荡15min，得提取物备用；分光光度法检测籽粒中植酸酶活性。取0. Iml提取物，加到 0. 9mlpH为5. 50的乙酸缓冲溶液中，保温5min后，加入底物应用液2. 0ml，37 °C水浴中准 确反应10min、20min、30min、40min、50min，反应结束后加入显色剂2. Oml0充分混勻，静置 IOmin后，在415nm波长下测定吸光度值。同时做样品空白，即先加入显色剂，然后再加入底 物应用液。(2)底物反应液浓度对植酸酶活性检测的影响提取方法同3(1)。取0. Iml提取物，加到0. 9ml pH值为5. 50的乙酸缓冲溶液中， 保温5min后，加入0. 05mM、0. lmM、0. 15mM、0. 2mM的底物应用液2. 0ml，37°C水浴中准确反应
530min，反应结束后加入显色剂2. Oml0充分混勻，静置IOmin后，在415nm波长下测定吸光 度值。同时做样品空白即先加入显色剂，然后再分别加入上述浓度的底物应用液。(3) pH值对植酸酶活性检测的影响提取方法同3(1)。取0. Iml提取物，加到0. 9mlpH值分别为6. 50、6. 00、5. 50、 5. 00,4. 50,4. 00乙酸缓冲溶液中，保温5min后，加入底物应用液2. 0ml，37°C水浴中准确反 应30min，反应结束后加入显色剂2. 0ml。充分混勻，静置IOmin后，在415nm波长下测定吸 光度值。同时做样品空白即先加入显色剂，然后再加入底物应用液。(4)正交试验根据影响植酸酶活性的单因素分析结果确定正交试验的实验因素水平，采用 L9(33)正交表优化植酸酶活性的检测方法。五实验结果及分析1标准曲线的绘制以无机磷的量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。直线回归方程为y = 0. 366x+0. 0054，R2 = 0. 9999 (见附图 1)。2正交试验法优化植酸酶的提取方法(1)不同料液比对植酸酶活性的影响料液比对植酸酶活性的影响见图2。从图2中可以看出，当料液比是1 3、1 4、 1 5时，植酸酶的活性较高。故选择料液比为1 3、1 4、1 5作为正交试验的实验因 素水平(见附图2)。(2)不同提取时间对植酸酶活性的影响提取时间对植酸酶活性的影响见图3。从图3中可以看出，当提取时间是15min、 30min、45min时，植酸酶的活性较高。故选择提取时间是15min、30min、45min作为正交试验 的实验因素水平(见附图3)。(3)不同pH值对植酸酶活性的影响pH值对植酸酶活性的影响见图4。从图4中可以看出，pH对植酸酶活性的影响的 变化不大，参照文献的方法，选择PH5. 00,5. 50,6. 00最为正交试验的实验因素水平(见附 图4)。(4)正交试验L9(33)实验因素水平表见表1，L9 (33)正交试验试验结果见表2，方差分析结果见 表3。对表2进行直观分析可见，最佳的超声提取条件是A2B2C3，即在提取液pH为5. 50， 料液比为1 4，提取15min时植酸酶活性最高。影响植酸酶的活性的主次因素为C > A >B，即料液比 > 提取时间> !1值。由表3的方差分析结果可知，三个因素的P值均大于 0. 05，表明其对植酸酶提取效率的影响均无显著差异。表IL9 (33)实验因素水平表
权利要求
1.一种转植酸酶基因玉米籽粒中植酸酶的提取方法，其特征在于提取液PH为5. 50， 料液比为1 4，提取时间为15min。
2.根据权利要求1所述的转植酸酶基因玉米籽粒中植酸酶的提取方法涉及的提取物 中植酸酶的检测方法，其特征在于将提取物与浓度为0. lmmol/L的底物在pH为5. 50的乙 酸缓冲溶液中反应30min。
全文摘要
一种转植酸酶基因玉米籽粒中植酸酶的提取与检测方法，其特征在于提取液pH为5.50，料液比为1∶4，提取时间为15min；将上述提取物与浓度为0.1mmol/L的底物应用液在pH为5.50的乙酸缓冲溶液中反应30min。本发明的有益效果是优化转植酸酶基因玉米籽粒中植酸酶的提取方法，在《饲用植酸酶活性的测定--分光光度法》标准的基础上，进行优化实验，最终确定转植酸酶基因玉米籽粒中植酸酶提取与测定的最佳方法，为构建转植酸酶基因玉米安全评价体系提供相关数据。
文档编号C12N9/16GK102127527SQ20101057175
公开日2011年7月20日 申请日期2010年12月3日 优先权日2010年12月3日
发明者于壮, 刘娜, 夏蔚, 宋新元, 康岭生, 张明, 张欣芳, 李葱葱, 李静, 李飞武, 董立明, 赵宁, 邢珍娟, 邵改革 申请人:吉林省农业科学院