专利名称：Pcr显色检测dna序列的方法
技术领域：
本发明涉及分析检测技术领域，尤其涉及了一种PCR显色检测DNA序列的方法。
背景技术：
人类所患的病症有25 % 30 %与基因有关。如人类第二大致死病因肿瘤，与基因 有密切关系。生物体的一切生命活动，从出生成长、到出现疾病、衰老直至死亡都与基因基 因调控着细胞的各种功能，包括生长、分化、衰老和死亡等。人类与疾病相关约有5000多 个，迄今已有三分之一被分离和确认。对于基因突变的检测，对于疾病的早期诊断具有极大 的意义。聚合酶链式反应简称PCR(Polymerase Chain Reaction)，是体外酶促合成特异 DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火及延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使 目的DNA得以迅速扩增。但传统的PCR反应体系始终是无色透明的，要想检测其中有无目 的DNA以及目的DNA含量，必须进行染色。染色方法有两种，一种是将反应产物在琼脂糖凝 胶中电泳后将凝胶泡在含0. 5ug/ml溴化乙锭(EB)溶液中进行染色，EB可以嵌入DNA碱基 中，用302nm紫外光透射仪激发可放射出橙红色信号，由此可判断出所检测DNA片段的有无 及浓度。另一种方法是用核酸电泳染料STOR Green，它与双链DNA有亲和力，可以用作电泳 前染色。电泳后，在紫外光透射仪激发下，与STORGreen结合的双链DNA呈现绿色。EB可以嵌入碱基分子中，导致错配，是强诱变剂，具有高致癌性。EB具有一定毒 性，对含EB的溶液及凝胶进行净化处理增加了实验的时间和成本。这两种染色方法均需在 PCR反应后进行电泳方可以判断实验结果，不够直观。
发明内容
本发明针对现有技术中检测DNA序列必须进行染色，实验过程耗时长且成本高， 需用电泳判断实验结果，不够直观的缺点，提供了一种利用DNA技术和PCR技术对目标DNA 序列的特异性识别，通过溶液紫外可见吸光光谱的显著改变，实现对样品的有效、方便、大 范围实时监测的PCR显色检测DNA序列的方法。为了解决上述技术问题，本发明通过下述技术方案得以解决PCR显色检测DNA序列的方法，包括下列步骤步骤a 先设计巯基修饰的单链DNA引物，DNA引物包括要检测的DNA序列的上游 引物和下游引物，DNA引物序列无重叠部分；步骤b 通过引物链端基的巯基与贵重金属表面的配位键相互作用，将单链DNA引 物修饰到贵重金属表面，使贵重金属表面分别带有单链DNA的上游引物和下游引物；步骤C 将待检测物，PCR缓冲液，DNA聚合酶，dNTP和步骤b中的经单链DNA引物 修饰的贵重金属混合，进行PCR反应；步骤d =PCR反应完毕后，对PCR反应获得的产物进行紫外可见光谱的测量；当被监测目标中没有目标DNA序列时，贵重金属偶联的单链DNA不会通过PCR反应扩增，这些单链DNA引物由于没有互补序列，贵重金属是分散的，溶液的颜色为红色；当被监测目标中含有能与单链DNA引物结合的DNA序列时，单链引物通过PCR反 应扩增，引入了互补序列，贵重金属通过DNA杂交交联在一起，导致贵重金属的紫外可见吸 收光谱发生位移，溶液的颜色变成紫色。作为优选，所述的步骤b中的贵重金属为金纳米颗粒或银纳米颗粒。作为优选，所述的PCR反应条件为①94°C变性anin ；②94°C变性30seC，55°C退 火 30sec，72°C延伸 30sec，循环 25-30 次；③ 72°C延伸 3min。作为优选，所述的DNA聚合酶为rTaq酶。作为优选，所述的PCR缓冲液的组分及用量分别为Tris-HCl :50-300mmol/L、 KCl :50-1000mmol/L、MgCl2 :5-50mmol/L。作为优选，所述的PCR缓冲液的组分及用量分别为Tris-HCl :100mmol/L、KCl 500mmol/L、MgCl2 :15mmol/L0本发明通过DNA技术和PCR技术改变贵重金属的聚集状态，引起溶液紫外可见吸 光光谱的显著改变，从而达到对DNA序列的显色检测。本发明由于采用了以上技术方案，具有显著的技术效果 本发明利用DNA纳米技术和PCR技术，通过对目标DNA序列的特异性识别，改变读 出光信号的峰位置，实现对样品的有效、方便、大范围监测，通过微机电系统的集成，可以实 现该技术方案应用的芯片化，进而为用户提供一种网络化、高通量、高灵敏的实时DNA监测 技术。
图1是本发明经过30个循环的PCR后的反应产物的紫外可见光谱检测结果图。图2是本发明未发生聚集的AuNPs透射电子显微镜图。图3是本发明用DNA引物修饰的AuNPs通过DNA之间的杂交反应发生聚集后的透 射电子显微镜图。
具体实施例方式下面结合附图1至图3与具体实施例对本发明作进一步详细描述实施例1PCR显色检测DNA序列的方法，包括下列步骤先设计巯基修饰的单链DNA引物，单链DNA引物包括要检测的DNA序列的上游引 物和下游引物，单链DNA引物序列无重叠部分，通过引物链端基的巯基与贵重金属表面的 配位键相互作用，将单链DNA引物修饰贵重金属表面，使贵重金属表面分别带有单链DNA的 上游引物和下游引物，取8μ L修饰有上游引物的20pmol金纳米颗粒和8 μ L修饰有下游 引物的20pmol金纳米颗粒在200 μ L PCR管中混合，分5次加入2. 5ul的IOxPCR缓冲液 (Tris-HCl :100mmol/L、KCl :500mmol/L、MgCl2 :15mmol/L)，然后依次加入 5ng 待测样品， 2ul 2mmol/L的dNTP和0. 5ul rTaq聚合酶，加灭菌蒸馏水至25ul，进行PCR反应94°C变 性 2min, 94°C变性 30sec, 55°C退火 30sec, 72°C延伸 30sec 循环 30 次，72°C延伸 3min,溶液 颜色由红色变为蓝紫色；
PCR反应完毕后，对PCR反应获得的产物进行紫外可见光谱的测量结果显示由 519nm 红移至 525nm。实施例2 PCR显色检测DNA序列的方法，包括下列步骤先设计巯基修饰的单链DNA引物，单链DNA引物包括要检测的DNA序列的上游引 物和下游引物，单链DNA引物序列无重叠部分，通过引物链端基的巯基与贵重金属表面的 配位键相互作用，将单链DNA引物修饰贵重金属表面，使贵重金属表面分别带有单链DNA的 上游引物和下游引物，取16 μ L修饰有上游引物的20pmol金纳米颗粒和16 μ L修饰有下 游引物的20pmol金纳米颗粒在200 μ L PCR管中混合，分5次加入2. 5ul的IOxPCR缓冲 液(Tris-HCl :100mmol/L、KCl :500mmol/L,MgCl2 :15mmol/L)，然后依次加入 5ng 待测样品， 2ul 2mmol/L的dNTP和0. 5ul rTaq聚合酶，加灭菌蒸馏水至25ul，进行PCR反应94°C变 性 2min, 94°C变性 30sec, 55°C退火 30sec, 72°C延伸 30sec 循环 30 次，72°C延伸 3min,溶液 颜色由红色变为蓝紫色；PCR反应完毕后，对PCR反应获得的产物进行紫外可见光谱的测量结果显示由 519nm 红移至 528nm。实施例3PCR显色检测DNA序列的方法，包括下列步骤先设计巯基修饰的单链DNA引物，单链DNA引物包括要检测的DNA序列的上游引 物和下游引物，单链DNA引物序列无重叠部分，通过引物链端基的巯基与贵重金属表面的 配位键相互作用，将单链DNA引物修饰贵重金属表面，使贵重金属表面分别带有单链DNA 的上游引物和下游引物，取8μ L修饰有上游引物的20pmol金纳米颗粒和8 μ L修饰有下 游引物的20pmol金纳米颗粒在200 μ LPCR管中混合，分5次加入2. 5ul的IOxPCR缓冲液 (Tris-HCl :100mmol/L、KCl :500mmol/L、MgCl2 :15mmol/L)，然后依次加入 5ng 待测样品， 2ul 2mmol/L的dNTP和0. 5ul rTaq聚合酶，加灭菌蒸馏水至25ul，进行PCR反应94°C变 性 2min，94°C变性 30sec，55°C退火 30sec，72°C延伸 30sec，循环 25 次；72°C延伸 3min，溶 液颜色由红色变为蓝紫色；PCR反应完毕后，对PCR反应获得的产物进行紫外可见光谱的测量结果显示由 519nm 红移至 526nm。实施例4PCR显色检测DNA序列的方法，包括下列步骤先设计巯基修饰的单链DNA引物，单链DNA引物包括要检测的DNA序列的上游引 物和下游引物，单链DNA引物序列无重叠部分，通过引物链端基的巯基与贵重金属表面的 配位键相互作用，将单链DNA引物修饰贵重金属表面，使贵重金属表面分别带有单链DNA的 上游引物和下游引物，取16 μ L修饰有上游引物的20pmol金纳米颗粒和16 μ L修饰有下 游引物的20pmol金纳米颗粒在200 μ L PCR管中混合，分5次加入2. 5ul的IOxPCR缓冲 液(Tris-HCl :100mmol/L、KCl :500mmol/L,MgCl2 :15mmol/L)，然后依次加入 5ng 待测样品， 2ul 2mmol/L的dNTP和0. 5ul rTaq聚合酶，加灭菌蒸馏水至25ul，进行PCR反应94°C变 性 2min, 94°C变性 30sec, 55°C退火 30sec, 72°C延伸 30sec,分别循环 30 次；72°C延伸 3min, 溶液颜色由红色变为蓝紫色；
PCR反应完毕后，对PCR反应获得的产物进行紫外可见光谱的测量结果显示由 519nm 红移至 530nm。实施例5PCR显色检测DNA序列的方法，包括下列步骤先设计巯基修饰的单链DNA引物，单链DNA引物包括要检测的DNA序列的上游引 物和下游引物，单链DNA引物序列无重叠部分，通过引物链端基的巯基与贵重金属表面的 配位键相互作用，将单链DNA引物修饰贵重金属表面，使贵重金属表面分别带有单链DNA的 上游引物和下游引物，取8μ L修饰有上游引物的20pmol金纳米颗粒和8 μ L修饰有下游 引物的20pmol金纳米颗粒在200 μ L PCR管中混合，分5次加入2. 5ul的IOxPCR缓冲液 (Tris-HCl :50mmol/L、KCl :50mmol/L、MgCl2 :5mmol/L)，然后依次加入 5ng 待测样品，2ul 2mmol/L的dNTP和0. 5ul rTaq聚合酶，加灭菌蒸馏水至25ul，进行PCR反应94°C变性 2min，94°C变性 30sec，55°C退火 30sec，72°C延伸 30sec 循环 30 次，72°C延伸 3min，溶液颜 色由红色变为蓝紫色；PCR反应完毕后，对PCR反应获得的产物进行紫外可见光谱的测量结果显示由 519nm 红移至 524nm。实施例6PCR显色检测DNA序列的方法，包括下列步骤先设计巯基修饰的单链DNA引物，单链DNA引物包括要检测的DNA序列的上游引 物和下游引物，单链DNA引物序列无重叠部分，通过引物链端基的巯基与贵重金属表面的 配位键相互作用，将单链DNA引物修饰贵重金属表面，使贵重金属表面分别带有单链DNA的 上游引物和下游引物，取8μ L修饰有上游引物的20pmol金纳米颗粒和8 μ L修饰有下游 引物的20pmol金纳米颗粒在200 μ L PCR管中混合，分5次加入2. 5ul的IOxPCR缓冲液 (Tris-HCl :150mmol/L、KCl :750mmol/L、MgCl2 :50mmol/L)，然后依次加入 5ng 待测样品， 2ul 2mmol/L的dNTP和0. 5ul rTaq聚合酶，加灭菌蒸馏水至25ul，进行PCR反应94°C变 性 2min, 94°C变性 30sec, 55°C退火 30sec, 72°C延伸 30sec 循环 30 次，72°C延伸 3min,溶液 颜色由红色变为蓝紫色；PCR反应完毕后，对PCR反应获得的产物进行紫外可见光谱的测量结果显示由 519nm 红移至 527nm。上述各实施例中所采用的反应设备为Bio-Rad PCR仪。当被监测目标中没有目标DNA序列时，贵重金属偶联的单链DNA不会通过PCR反 应扩增，这些单链DNA引物由于没有互补序列，贵重金属是分散的，溶液的颜色为红色；当被监测目标中含有能与单链DNA引物结合的DNA序列时，单链引物通过PCR反 应扩增，引入了互补序列，贵重金属通过DNA杂交交联在一起，导致贵重金属的紫外可见吸 收光谱发生位移，溶液的颜色变成紫色，从而实现对DNA序列的高灵敏显色监测。本发明利用DNA纳米技术和PCR技术，通过对目标DNA序列的特异性识别，改变读 出光信号的峰位置，实现对样品的有效、方便、大范围监测。通过微机电系统的集成，可以实 现该技术方案应用的芯片化，进而为用户提供一种网络化、高通量、高灵敏的实时DNA监测 技术。总之，以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所作的均等变化与修饰，皆应属本发明专利的涵盖范围。
权利要求
1.PCR显色检测DNA序列的方法，其特征在于，包括下列步骤步骤a 先设计巯基修饰的单链DNA引物，DNA引物包括要检测的DNA序列的上游引物 和下游引物，DNA引物序列无重叠部分；步骤b 通过引物链端基的巯基与贵重金属表面的配位键相互作用，将单链DNA引物修 饰贵重金属表面，使贵重金属表面分别带有单链DNA的上游引物和下游引物；步骤c 将待检测物，PCR缓冲液，DNA聚合酶，dNTP和步骤b中的经单链DNA引物修饰 的贵重金属混合，进行PCR反应；步骤d =PCR反应完毕后，对PCR反应获得的产物进行紫外可见光谱的测量。
2.根据权利要求1所述的PCR显色检测DNA序列的方法，其特征在于所述的步骤b中 的贵重金属为金纳米颗粒或银纳米颗粒。
3.根据权利要求1所述的PCR显色检测DNA序列的方法，其特征在于所述的步骤c中 的PCR反应条件为①94°C变性 2min ；②94°C变性 30sec，55°C退火 30sec, 72°C延伸 30sec，循环 25-30 次； ③72°C延伸3min。
4.根据权利要求1所述的PCR显色检测DNA序列的方法，其特征在于所述的步骤d 的对PCR反应获得的产物进行紫外可见光谱的测量过程中，当被监测目标中没有目标DNA 序列时，贵重金属偶联的单链DNA不会通过PCR反应扩增，这些单链DNA引物由于没有互补 序列，贵金属是分散的，溶液的颜色为红色；当被监测目标中含有能与单链DNA引物结合的 DNA序列时，单链引物通过PCR反应扩增，引入了互补序列，贵重金属通过DNA杂交交联在一 起，导致贵重金属的紫外可见吸收光谱发生位移，溶液的颜色变成紫色。
5.根据权利要求1所述的PCR显色检测DNA序列的方法，其特征在于所述的DNA聚 合酶为rTaq酶。
6.根据权利要求1所述的PCR显色检测DNA序列的方法，其特征在于所述的PCR缓冲 液的组分及用量分别为Tris-HCl :50-300mmol/L、KCl :50-1000mmol/L、MgCl2 :5-50mmol/L0
7.根据权利要求6所述的PCR显色检测DNA序列的方法，其特征在于所述的PCR缓 冲液的组分及用量分别为Tris-HCl :100mmol/L、KCl :500mmol/L、MgCl2 :15mmol/L。
全文摘要
本发明涉及分析检测技术领域，公开了一种PCR显色检测DNA序列的方法，包括下列步骤先设计巯基修饰的单链DNA引物，单链DNA引物包括要检测的DNA序列的上游引物和下游引物，单链DNA引物序列无重叠部分；通过引物链端基的巯基与贵重金属表面的配位键相互作用，将单链DNA引物修饰贵重金属表面，使贵重金属表面分别带有单链DNA的上游引物和下游引物；将待检测物，PCR缓冲液，DNA聚合酶，dNTP和经单链DNA引物修饰的贵重金属混合，进行PCR反应；PCR反应完毕后，对PCR反应获得的产物进行紫外可见光谱的测量。本发明利用DNA纳米技术和PCR技术，通过对目标DNA序列的特异性识别，改变读出光信号的峰位置，实现对样品的有效、方便、大范围监测。
文档编号C12Q1/68GK102102125SQ201010571080
公开日2011年6月22日 申请日期2010年11月29日 优先权日2010年11月29日
发明者孙国凤 申请人:无锡久光纳米生物科技有限公司