专利名称：一种提高农作物对土壤植酸磷利用能力的方法
技术领域：
本发明涉及一种提高植物利用土壤闭蓄态磷素能力的方法，尤其涉及一种利用转基因技术提高农作物对土壤植酸磷利用能力的方法，属于基因工程领域。
背景技术：
磷是植物生长所必需的大量元素之一，为了满足作物生长的营养需求，达到高产目的，每年在作物生长季节施加大量磷肥。但大量研究表明，磷肥施入土壤后，能很快地被吸附到土壤颗粒表面或与土壤一些物质(Fe、Al、Ca等)生成难溶的磷酸盐，从而在很大程度上影响磷的释放和对植物的有效性。磷的吸附大大降低了磷酸养分的有效性，因此，缺磷是作物生长的障碍因子。在我国，近14.9亿亩耕地中，缺磷(速效磷在10ppm以下)土壤约有10.9亿亩，占总耕地的74％，其中严重缺磷(速效磷在5ppm以下)土壤占总耕地的40％。
长期以来，我国农村广泛使用化肥，化肥可以增加土壤肥力，但连续施用则肥效日减，不得不加大化肥用量。而过量施用化肥，则造成土壤板结，地力减弱，还影响农作物品质。热带、亚热带地区的土壤含有大量的氧化铁和氧化铝等化合物，铁铝物质的积聚，对土壤中的磷有很强的固定作用。我国当季磷肥利用率仅在10％-20％左右。
目前，我国氮、磷化肥用量已占全世界用量的30％。过量的化学肥料投入，使我国成为世界上单位化肥投入粮食产出最低的国家之一，化肥成本增长超过粮食增产效益，增产不增收，加重了农民负担。而且，我国有机肥资源丰富，随着畜禽养殖业的迅速发展，我国畜禽粪便年产生量约为17.3亿吨，大量的有机磷随畜禽粪便排放到土壤中，全国畜禽粪便年排放量超过全国工业废渣和城市生活废弃物排放量之和，已对周围环境造成严重污染。
磷化肥的低效利用，使土壤中积累的磷量逐年增加。畜禽排泄的磷是水质污染和湖泊等地表水超营养的原因之一，使农业面源污染成为水系富营养化、土壤酸化与重金属污染最重要因素，威胁生态安全与可持续发展。由于不合理施肥、动物高磷粪便、水土流失等原因引起的江河、湖泊等水体富养化问题也日益加重，我国85％的国控湖泊富营养化问题严重，从内陆小水库到大湖泊以至海湾水域主要污染指标，都毫无例外是总磷和总氮。
磷矿是不可再生资源。磷矿在世界范围内濒临枯竭，全球低成本的磷肥资源预计到2050年将耗尽。我国又是缺磷大国，仅有27亿吨磷矿储量，仅够维持使用70年左右。我国耕地土壤70％以上是对磷具强烈化学固定的酸性与石灰性土壤。由于长期施用磷肥，土壤中已经积累了一个较大的潜在磷库，包括化学固定态磷与家畜粪便中的高机态磷。高效活化、利用土壤磷是可以作为替代资源的。农田土壤总磷含量高而有效磷缺乏是世界范围内农业生产的限制性因素。如我国有效磷缺乏的土壤中全磷含量一般在0.04-0.25％(按P2O5计)之间，高的可达0.4％以上。
植酸酶(Phytase)在植物和微生物中广泛存在，它是催化植酸(肌醇六磷酸)水解成肌醇与磷酸(或磷酸盐)一类酶的总称，属磷酸单酯水解酶。主要有二种类型，即源于微生物的肌醇六磷酸3-磷酸水解酶(E.C.3.1.3.8)和源于植物的肌醇六磷酸6-磷酸水解酶(E.C.3.1.3.26)。
不同来源的植酸酶的最适pH不同。大多数纯化了的植酸酶的最适pH在2～6之间。微生物植酸酶的最适pH范围较宽，一般在2.5～6.0。植物来源的植酸酶的最适pH范围较窄，一般在4.8～6.0，在pH3.0时活性显著下降甚至失活(Hayes JE，R.A.，Simpson RJ(2000).″Components of organic phosphorusin soil extracts that are hydrolysed by phytase and acid phosphatase.″Biol.Fertil.Soils(32)279-286.)。
植酸酶能将肌醇六磷酸(植酸)的六个磷逐一分解生成无机磷酸。1g植酸完全分解理论上可释放出无机磷281.6mg。多数纯的植酸酶对底物的专一性不强，除能够水解植酸及植酸盐外，还能水解其它磷酸酯键。
到目前为止，共有十余个植酸酶编码基因得到了分离克隆，几乎所有分离到的植酸酶基因都申请了专利。植酸酶基因主要从微生物中分离克隆。目前唯一报导的植物来源的植酸酶基因是Maugenest等于1997年从萌发的玉米种子中克隆的。国内，姚斌、范云六等(B.Yao 1998)从产植酸酶的黑曲霉菌株A.niger 963中分离克隆出植酸酶phyA基因，其DNA全序列长1506个核苷酸，编码467个氨基酸。
通过研究低磷胁迫条件下，植物根系的生理生化的变化，发现根系分泌物种类和数量以及分泌的磷酸酯酶活性增加(Richardson，A.E.，P.A.Hadobas，et al.(2001).″Extracellular secretion of Aspergillus phytase from Arabidopsisroots enables plants to obtain phosphorus from phytate.″Plant J 25(6)641-9.)。研究表明，自然条件下，植物根系能分泌有机酸和少量磷酸酯酶(主要是植酸酶)，降低根围土壤pH，促使土壤难溶性矿物磷酸盐的溶解和水解土壤中的植酸和其它有机磷，释放出无机磷供植株吸收利用。但植物通过这两种方式吸收利用土壤中植物难利用磷的能力很弱。据此，人们正尝试通过以下两个途径来提高植物吸收利用土壤中闭蓄态磷的能力。
一、提高植株根系分泌物中植酸酶的活性。由于土壤中总有机磷含量的20-50％是植酸磷，但植物吸收利用植酸磷的能力很弱。Richardson等在拟南芥植株中转入黑曲霉植酸酶基因，使其在拟南芥植株根系组成型表达并分泌到胞外。转基因植株根部的植酸酶活性显著提高，且分泌胞外，使根系分泌物中植酸酶的活性也显著提高。转基因拟南芥植株在含Na2HPO4和植酸磷的培养基上长势相同，但非转基因植株在以植酸为磷营养的培养基上生长明显受阻。这表明植株根系表达并分泌高活性植酸酶可大大提高植株从植酸中获取磷的能力。
二、提高植株根系分泌有机酸的能力。国外不同的研究小组尝试将不同来源的柠檬酸合成酶(CS citrate synthase)基因分别转入烟草和拟南芥中(López-Bucio，et al，2000；Koyama，et al，2000)，研究表明，表达CS能促进植物柠檬酸的合成，与对照相比，转基因烟草和拟南芥的根部柠檬酸分泌量增加，植株能更加有效地吸收利用磷。
如何利用土壤中丰富的磷源，一直是土壤学家和植物营养学家所关注的焦点问题之一。通过转基因技术提高植物对磷素的吸收利用能力，迄今为止，目前的研究还仅停留在以模式植物烟草和拟南芥为研究对象的水平，尚缺乏一种行之有效的提高农作物高效吸收利用植酸磷能力的方法。提高农作物对土壤中磷的利用能力和效率，对于提高作物产量，降低生产成本，节约磷资源、保护生态环境乃至提高农业生产的经济效益等方面都具有重要的意义，所以提供一种提高农作物利用土壤植酸磷能力的方法具有深远的现实意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种提高农作物对土壤植酸磷利用能力的方法。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术途径来实现的一种提高农作物对土壤植酸磷利用能力的方法，包括以下步骤将SEQ ID NO.1所示的融合有植酸酶基因和引导基因产物分泌和定位的信号肽的核苷酸序列可操作的连接到启动子之后，构建单子叶植物或双子叶植物重组表达载体；将该植物重组表达载体转化受体农作物即可。
上述方法中，其中所述的启动子为植物组织特异性启动子，优选为Ubi启动子或CaMV35S启动子；所述的植物重组表达载体可通过将SEQ ID NO.1所示的核苷酸和信号肽序列可操作的连接到植物组织特异性启动子之后制备而成，作为本发明的一个优选实施方案，所述的植物重组表达载体优选为单子叶植物表达载体pGA1161EAO或双子叶植物表达载体pBINPLUSEAO。
所述的植物重组表达载体转化受体农作物的方法可为本领域的常规转化方法，例如可以是农杆菌侵染法、基因枪法、PEG介导法、种质系统介导法、电击穿孔法或微注射法，本发明优选为农杆菌侵染法或基因枪法；所述的受体农作物优选为油菜、玉米、大豆或小麦，更优选为油菜或玉米。
为了便于筛选成功转化的作物同时为了更好的符合安全性要求，上述方法中还包括构建植物选择标记基因表达载体，将植物重组表达载体与植物选择标记基因表达载体共同转化受体作物，选育得到表达植酸酶而不含筛选标记基因的转基因作物。
所述的植物选择标记基因表达载体的构建可按照常规方法进行，所述的选择标记基因可选自Bar基因(除草剂抗性的选择性标记)、Npt-II基因(新霉素磷酸转移酶基因)、DHFR基因(二氢叶酸还原酶基因)、Gent基因(庆大霉素抗性基因)等，优选为Bar基因。作为本发明的一个最优的实施方案，所述的选择标记基因表达载体为用于单子叶植物转化的选择标记基因表达载体PHP17042Bar或用于双叶植物转化的选择标记基因表达载体pBINPLUSBa。
更优选为将选择标记基因表达载体PHP17042Bar和单子叶植物表达载体pGA1161EAO用基因枪法共同转化玉米或将选择标记基因表达载体pBINPLUSBar和双子叶植物表达载体pBINPLUSEAO用农杆菌侵染法共同转化油菜。
本发明将来源于微生物的植酸酶基因[优选采用专利号为ZL 97121731.9中的来源于Aspergillus sp.98(曲霉)的植酸酶基因]置于启动子驱动之下，加上引导基因产物分泌和定位的信号肽序列，控制基因产物的定位(该信号肽序列可以引导植酸酶分泌到细胞外)，构建包含有植酸酶核苷酸序列的植物重组表达载体，将该植物重组表达载体转移到植物尤其是重要的农作物中，所得到的转基因植物可以在根部高效表达植酸酶，在植物的整个生长过程中持续产生植酸酶，并向根外分泌，以降解土壤中大量存在的植酸磷，使其分解为植物可以利用的无机磷源，从而满足作物对磷的需求。
本发明方法可以有效提高作物对土壤闭蓄态磷素尤其是植酸磷的利用能力，从而大大减少对土壤中矿物磷肥的需求，有效缓解磷源匮乏的局面，同时可分解消耗土壤中形成的潜在磷库，减轻由此带来的水质污染和湖泊、地表水超营养等一系列威胁生态安全与可持续性发展的问题。
本发明所要解决的另外一个技术问题是提供一种检测转植酸酶基因农作物利用植酸磷能力的方法。
本发明所要解决的该技术问题是通过以下技术途径来实现的一种检测转植酸酶基因农作物利用植酸磷能力的方法，包括以下步骤将固体或液体MS培养基中的无机磷全部替换为等量的植酸磷，将转植酸酶基因农作物的后代种子表面消毒、萌发后置于MS固体或液体培养基上培养一段时间；向生长有转植酸酶基因农作物的培养基中加入由FeCl3.6H2O和磺基水杨酸所配制成的染色剂；如染色剂颜色无明显变化，表明转基因农作物利用植酸磷能力高，如果染色剂颜色变为浅红色至无色，表明转植酸酶基因农作物利用植酸磷能力低。
上述方法中，优选的，向生长有转植酸酶基因农作物的固体MS培养基中加入的染色剂由以下重量百分比的组分组成FeCl3.6H2O 0.03％、磺基水杨酸0.3％、余者为水；向生长有转植酸酶基因农作物的液体MS培养基中加入为液体培养基1/7体积的染色剂，其中该染色剂以下重量百分比的组分组成FeCl3.6H2O 0.12％、磺基水杨酸1.2％、余者为水。
本发明检测方法能够准确的检测出转基因农作物对植酸磷利用能力的高低，具有结果准确、步骤简捷、重现性好等优点。
图1为植酸酶基因单子叶植物表达载体PGA1161EAO的酶切电泳图；11Kb Ladder；2pGA1161EAO质粒；3pGA1161EAO经BamHI酶切。
图2为表达载体PHP17042的物理示意图；图3为选择标记基因表达载体PHP17042Bar的酶切电泳图；1PHP17042Bar经PstI酶切；21Kb Ladder。
图4为转植酸酶基因玉米基因组DNA的PCR结果；1-15转基因再生玉米植株(其中4，5，7PCR扩增结果为阴性)；16100bp分子量标准；17阳性对照；18阴性对照。
图5为转基因玉米植株的Southern-blot结果；11Kb分子量标准；2阳性对照；13阴性非转基因玉米对照3；4植株1的基因组DNA分别用EcoRV，BamHI酶切；5，6植株2的基因组DNA分别用EcoRV，BamHI酶切；7，8植株3的基因组DNA分别用EcoRV，BamHI酶切；9，10植株4的基因组DNA分别用EcoRV，BamHI酶切；11，12植株5的基因组DNA分别用EcoRV，BamHI酶切。
图6为转基因玉米植株的SDS-PAGE结果；1蛋白质分子量标准；2，3不同稀释倍数的阳性对照；4，5，6株系C83，C43，C76；7阴性对照(黄早四)；8，9，10株系C47，C36，C84。
图7为转基因玉米植株的Western-blot结果；1蛋白质分子量标准；2，3不同稀释倍数的阳性对照；4，5，6株系C83，C43，C76；7阴性对照(黄早四)；8，9，10株系C47，C36，C84。
图8为固体培养基上测定转基因玉米对植酸利用能力；图9为液体培养基上测定转基因玉米对植酸利用能力；图10为玉米根部组织中植酸酶活性测定结果；1、阴性对照；2、事件C83W；3、事件C83Y。
图11为植酸酶基因双子叶植物表达载体的电泳图；1pBINPLUSEAO经HindIII和Eco R I酶切；2.1Kb Ladder。
图12为Bar基因双子叶植物表达载体的电泳图；1pBINPLUSBar经HindIII和Eco R I酶切；2.1Kb Ladder。
图13为转基因油菜T1植株的PCR扩增植酸酶基因；M为DNA Marker，1-7为转基因T1植株DNA扩增片段。
图14为转基因油菜T2植株的Southern-blot结果；1-3为转基因T1植株，CK+为阳性对照，CK-为阴性对照，M为分子量标准，Phytase基因500bp片段为探针。
图15为固体培养基上测定转基因油菜对植酸利用能力；图16为液体培养基上测定转基因油菜对植酸利用能力；图17为油菜根部组织中植酸酶活性测定结果；1阴性对照；2转基因油菜株系04p1602；3转基因油菜株系04p4906。
以下通过实施例来进一步描述本发明的制备方法及有益效果，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。
具体实施例方式
试验材料及来源工具酶和修饰酶各种限制性内切酶、修饰酶、pGEM5Zf质粒和T-载体分别购自Promega公司，New England Biolabs公司和Gibco公司。
化学试剂酵母浸膏和胰蛋白胨购自OXOID公司，CHU(N6)大量盐购自Gibco公司，组织培养用的其它试剂和激素购自Sigma公司。其它化学试剂均为国产分析纯。
引物合成由北京奥科生物工程公司和上海博亚生物技术有限公司合成。
测序由上海博亚生物技术有限公司完成。
说明以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆试验手册》(Sambrook等编著，科学出版社，1992年版)一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
1、构建含有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的中间载体1.1合成信号肽序列上游片段5’端加XbaI位点，下游片段5’端加SnaBI位点，两片段序列如下，酶切位点用下划线标出上游片段5’tccccgcggtctagacccgggatatcatgggaagaattgctagaggctcaaaaatgagttctctcattgtgttct3’(SEQ ID NO.2)，下游片段5’ccggaattctacgtaagctgtggtttcggaagccaaattgagtgacacaatactacaagcaaagacacaatga 3’(SEQ ID NO.3)，反应体系上下游片段(0.5μg/μl)， 各6.0μl10X PCR buffer5.0μldNTP(1.5mM each) 2.8μlTaq Polymerase(5U/μl)0.2μlMgCl2(25mM) 5.0μlH2O 24.2μl反应条件94℃，30Sec；30℃，1Min；72℃，20Min。
反应结束取1μl，电泳检测150bp大小的条带清晰。回收反应体系中的片段连接于T-载体。用XbaI，SnaBI酶切该中间载体得到信号肽序列备用。
1.2扩增植酸酶基因上游引物依次加HindIII，XbaI，SnaBI位点，(5’aagcttctagatacgtaatgctggcagtcc 3’，下划线或斜体为酶切位点(SEQ ID NO.4)，下游引物加HpaI位点(5’gttaacctaagcaaaacactccgcccaat 3’下划线为酶切位点，SEQ ID NO.5)。PCR模板为质粒PIC9A2(B.Yao，C.Y.Z.1998，Science inChina，SeriesC，41(3)330-3360)，PCR扩增条件94℃，4Min；52℃，1Min；72℃，1Min 30Sec；34Cycles；72℃，10Min。产物加尾按照常规方法进行，加尾后的产物连接到T-easy载体。XbaI，SnaBI酶切该中间载体后，回收的植酸酶基因与步骤1.1中所制备的信号肽片段连接，即得。
2、构建玉米转化用植物重组表达载体2.1用于玉米转化的植酸酶基因表达载体用HindIII和HpaI分别酶切消化上述步骤1中所构建的中间载体及表达载体pGA1161(构建过程见Kim S-R，Lee S，Kang H-G，Jeon J-S，Kim K-M，An G，2003.J Plant Biol 46211-214.)，连接后，使其受载体pGA1161上Ubi启动子的驱动控制，得到单子叶植物表达载体pGA1161EAO，该表达载体经酶切鉴定(见图1)，结果表明SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列已成功的插入到表达载体pGA1161中。
2.2用于玉米转化的筛选标记基因表达载体Bar基因从载体pAHC25(Christensen AH and Quail HP(1996)TransgenicRes 5213-218.)上用酶切得到，pGEM5Zf经PstI酶切后，脱磷酸化，与Bar基因片段连接，连接产物转化E.coli感受态细胞，提取质粒，酶切鉴定测序后得到pGEM5ZfBar；BamHI和EcoRV酶切pGEM5ZfBar，BamHI和SmaI酶切PHP17042(构建示意图见附图2，分别含有H2B(Histone B)启动子，来自于玉米Ubi基因的5端非翻译区和内含子，PIN II(Proteinase Inhibitor II)终止子)，按常规方法分别回收目的片段，将两片断按照常规方法连接。连接产物转化E.coli感受态细胞，提取质粒，酶切鉴定后得到选择标记基因表达载体PHP17042Bar(酶切鉴定结果见图3)。
3、转化玉米授粉9-12天的玉米幼穗，剥离幼胚，置于N6培养基上，28℃，黑暗培养三天后用于基因枪转化。
愈伤系授粉9-12天的玉米幼胚，置于N6培养基上经过6-8周继代培养后得到胚性愈伤系，培养条件同上。
上述玉米幼胚和胚性愈伤均可作为转化起始材料，培养基的配制参照《植物细胞，组织和器官培养基本方法》(Plant Cell，Tissue and Organ Culturefundamental methods/O.L.Gamborg，G.C.Phillips eds.，Springer)一书中第16章中的方法进行。
玉米基因枪转化方法参照上述书中的方法进行。转化前将玉米幼胚或胚性愈伤置于含120g蔗糖的高渗培养基上4-6小时后，用于微弹轰击。使用Bio-Rad公司的PSD/1000 Hellium基因枪，氦气压力为1000Psi，真空度为28inch Hg。轰击结束后，被转化的材料在高渗培养基上保持1-4小时，然后转移到保持愈伤的培养基上恢复培养3-4天。
选择培养保持愈伤的培养基中加入3mg/L的BASTA作为选择压力，对被转化的材料进行筛选培养，每两周继代一次。
再生经过两个月的选择培养后，抗性愈伤在选择性培养基上生长迅速，颜色新鲜。将抗性愈伤转到再生培养基上，两到三周后，即可得到成熟的胚状体。
将胚状体放到MS培养基上生根，即得到再生玉米苗。植酸酶表达盒PCR阳性的植物转到土壤中，于温室内生长。
4、转基因玉米的分子检测4.1 PCR检测正向引物AATTGCTAGAGGCTCAAAAATGA(SEQ ID NO.6)反向引物CTAAGCAAAACACTCCGCCCAA(SEQ ID NO.7)反应体系(20μL)再生玉米植株DNA 1μL(20-50ng)；10×缓冲液2μL；MgCl2(2.5mM)2μL；dNTP(2.5mM)2μL；Taq酶0.2μL；引物10μM；加无菌水至20μL。反应条件94℃，5分钟；94℃，45秒；55℃，45秒；72℃，1分钟；35个循环；72℃延伸5分钟。
图4显示的是转基因玉米植株PCR检测结果，从图中可以看出扩增片段大小与植酸酶全基因大小一致，约为1.3Kb。
4.2 Southern-blot检测Southern-blot参照Sambrook J，等编著的《分子克隆试验手册》(科学出版社，1992年版)中的方法进行。具体检测方法如下1)对PCR检测植酸酶基因的为阳性的玉米植株，选取0.5-0.8g叶片组织，液氮研磨后提取基因组DNA，提取方法同PCR检测中所用。
2)得到的DNA经RNase和Proteinase K处理后，再用等体积的酚∶氯仿(1∶1)，氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提，用紫外分光光度计测定DNA的量。
3)每个样品取15μg DNA酶切过夜，50V，琼脂糖凝胶电泳6小时后转移至尼龙膜。
4)预杂交6小时后，以植酸酶基因的片段作模板，经放射性同位素P32标记探针，进行杂交。
5)洗膜完成后，尼龙膜压X光片，所得结果见图5。
图5显示的是玉米T2代植株的杂交结果，探针为植酸酶基因的500bp片段，从图中可以看出转基因玉米植株基因组DNA经BamHI单切后杂交，出现分子量约为6Kb和8Kb的两条带，经EcoRV单切后杂交，出现分子量约为4Kb的一条带。从该杂交结果和其它转化体的杂交结果来看，植酸酶基因已经整合到玉米基因组中，植酸酶基因在转基因植株中的拷贝数不高，不超过两个。
5、转基因玉米的Western-blot检测5.1SDS-PAGE方法1)称取10mg转基因玉米种子粉磨，放入有螺旋帽的离心管中；2)加入200ul抽提缓冲液(60mMTris，pH 6.8；100mM DTT，2％(w/v)SDS)，涡旋振荡使粉末充分悬浮；3)100℃加热4min；4)14,000rpm离心10min取上清进行SDS-PAGE；5)电泳按照常规方法进行，分离胶浓度为12％；6)电泳结束后，用考马斯亮蓝对胶进行染色，然后再用脱色液脱色。
5.2 Western-blot方法1)量好胶的大小，按此大小裁剪滤纸和膜(硝酸纤维素膜)，膜、胶、滤纸在Transfer Buffer中浸泡处理30min。
2)在Bio-Rad半干态电转仪上(盖子为-，底为+)依次(+→-)放置四张滤纸、膜、胶、另外4张滤纸，每放一层，用玻璃棒赶走气泡，放好盖子。稳压10V-20V，电流不超过1.00，2-3小时。
3)将已转有蛋白质的膜标记上下，浸泡在20ml封闭液中(以完全浸泡膜为宜)，RT，轻摇1小时或O/N。
4)回收封闭液，加入一抗，RT，轻摇2h。
5)回收一抗，洗膜4次，20-30ml/次，4min/次。
6)加入碱性磷酸酯酶标记的二抗，轻摇1h。
7)回收二抗，洗膜3次，20-30ml/次，4min/次。
8)1×TBS洗膜1次，20-30ml/次，3min/次。
9)加入NBT/BCIP显色液，适当时取出膜，大量水洗。
图6和图7显示的是转基因玉米进行SDS-PAGE和Western-blot的结果，从图中可以看出植酸酶基因以在转基因玉米中得到表达。
6、转基因玉米植株的转基因玉米植株的植酸利用能力测定转基因玉米和油菜的后代种子，经表面消毒，萌发后置于MS培养基上，培养基以植酸为唯一磷源，在培养基上生长一段时间后，向培养基中加入染色剂，根据染色剂的颜色变化即可以判断该转基因玉米植株的利用植酸能力的高低，凡培养基中植酸被分解利用后，染色剂颜色无明显变化，反之，颜色变为浅红色至无色。
6.1固体培养基上测定转基因玉米对植酸利用能力将植物MS培养基中的无机磷替换为等量的植酸磷，转基因玉米植株在该培养基上生长一段时间后，用0.03％FeCl3.6H2O和0.3％磺基水杨酸溶液处理30分钟后，观察颜色变化，结果见图8。
图8a加入到固体培养基中的染色剂的颜色无明显变化，说明生长于该培养基上的转基因玉米利用植酸能力高；图8b染色剂；图8c加入到固体培养基中的染色剂颜色变为浅红色，说明生长于该培养基上的非转基因玉米利用植酸能力低；6.2液体培养基(无琼脂等固化物)上测定转基因玉米对植酸利用能力将植物再生培养基中的无机磷替换为等量的植酸磷，配制4倍的染色剂母液，即0.12％FeCl3.6H2O和1.2％磺基水杨酸，植物在35毫升液体培养基上生长一段时间(长于3天)后，加入5毫升上述染色剂母液，并轻柔混匀，静置后观察颜色变化，结果见图9。
图9a-b加入到液体培养基中的染色剂的颜色无明显变化，说明生长于该培养基上的转基因玉米利用植酸能力高；图9c染色剂；图9d未加入染色剂的含植酸磷液体培养基；图9e-f加入到液体培养基中的染色剂的颜色变为浅红色，说明生长于该培养基上的非转基因玉米利用植酸能力低。
通过分子检测和植酸利用能力检测，获得根部表达植酸酶的转基因玉米15个株系。
7、转基因玉米根部组织中酶活性的测定(选部分转基因玉米株系进行测定)7.1植酸酶活性定义一个单位(U)的植酸酶为在pH5.5，37℃的条件下，每分钟从底物植酸钾、镁(肌醇六磷酸钾、镁)释放出1μmol无机磷酸所需要的酶量。
7.2试剂提取缓冲液(Extraction buffer)0.4M pH5.5的NaAc缓冲液；50mM植酸钠；15％TCA。
显色液(O.6M H2SO4-2％Vc-0.5％钼酸铵)。
7.3测定方法参考Wyss M.et.al.(1999)，将酶液与50mM的植酸二钾混合于37℃孵育60分钟，其中植酸二钾溶于0.2M pH5.5的NaAc缓冲液中。标准曲线制作配制9mM KH2PO4贮液，用不同稀释度的KH2PO4溶液作标准曲线。
7.4将转基因玉米的种子用Spex 2000 Geno/Grinder粉碎成超细微粒，100mg粉末中加入1ml提取缓冲液，室温振荡1小时后离心，取上清为酶液。
种子中酶活性检测以内源植酸酶活性较高的小麦作为阳性对照，野生型玉米作为阴性对照进行酶活测定，检测结果见表1。
表1 转基因玉米种子酶活性检测结果
注C36、C43、C47、C83、C84、C76、为本发明转植酸酶基因玉米的6个株系。
表1显示的是6个转基因玉米株系的种子植酸酶活性，最高的株系C47可以达到5732.5U/Kg种子，最低的株系为539.1U/Kg种子。
7.5根据种子酶活性检测的结果，选择酶活性高的C47和C83两个株系，用Hoagland’水培体系液体培养玉米，水培两周后，将单株植株移入盛有300ml蒸馏水的培养瓶中收集根分泌物48小时，将收集的玉米根系分泌物使用Satoris公司的vivaspin超滤离心管浓缩40倍后，取20μl收集物浓缩液进行植酸酶活性测定。
根分泌物的测定结果进行水培并测定根分泌物的酶活性，结果见图10，结果表明，转基因玉米根部酶活性大约是非转基因对照的14-44倍。
1、构建含有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的中间载体(同实施例1)。
2、构建油菜转化用植物重组表达载体2.1植酸酶基因表达载体的构建用HindIII和EcoR I酶切pBI525’(pBI525载体构建过程见Pang，S.-Z.，Nagpala，P.，Wang，M.，Slightom，J.L.& Gonsalves，D.(1992)Phytopathology，82，1223-1229.，本发明用NcoI酶切质粒pBI525后，用Mungbean修饰酶处理削去位点后自连接，酶切连接等方法按常规方法进行，自连后的质粒经测序证实NcoI位点已破坏，命名为pBI525’)和pBINPLUS(FredA.Van Engelenet al.，Transgenic Research 4，288-290)，将含表达盒元件双35S启动子、Ω增强子和NOS终止子的约900bp的片段连入pBINPLUS，将所得到的载体先用BamHI酶切后补平，再用XbaI酶切该载体。用XbaI，MluI酶切实施例1中所制备的连有融合信号肽和植酸酶基因的中间载体，将得到的片段与上述酶切后的载体连接即得到由CaMV35S启动子的驱动控制的植酸酶基因双子叶植物表达载体pBINPLUSEAO，该表达载体的酶切鉴定结果见图11。
2.2油菜用选择标记基因表达载体构建XbaI和EcoR V酶切pGEM5ZfBar，BamHI酶切pBI525’(同前)后补平，再用XbaI酶切，分别回收目的片段，连接，再用HindIII，EcoR I酶切该中间载体得到带有标记基因的表达盒，用HindIII，EcoR I酶切双元载体pBINPLUS，将表达盒插入pBINPLUS上CaMV35S启动子后即得到pBINPLUSBar，该选择标记基因表达载体的酶切鉴定结果见图12。
3、转化油菜选择饱满完好的油菜种子，用75％的酒精浸泡3-5分钟，然后用1％的DICA消毒8-15min，再用无菌水冲洗3遍，均匀植入固体1/2MS培养基，25℃，光照16小时/天，培养3-5天。
切下具柄子叶(茎节上约1mm)，作为外植体用于被农杆菌侵染。
侵染所用农杆菌的培养转化前2-3天划平板(YEB培养基)活化农杆菌，转化当天用1/2MS液体培养基从平板上洗下菌体并使菌体重悬，转化时农杆菌浓度OD为0.08左右。
外植体与农杆菌共培养5-10min，取出外植体用无菌吸水纸吸干，均匀植入预培养基(MS+BA0.2mg/L+2，4-D1mg/L)上暗培养。
2-3天后将外植体转入选择培养基MS+BA4.5mg/L+Ag5mg/L+Cb500mg/L+PPT5-7mg/L，25℃，光照16h/d，培养。
3周后将外植体转入选择压增大的选择培养基MS+BA4.5mg/L+Ag5mg/L+Cb500mg/L+PPT7-10mg/L，25℃，光照16h/d，培养。
从分化的外植体上切下芽植入芽增生培养基，MS+BA2mg/L+NAA0.2mg/L+Ag5mg/L+Cb250mg/L+PPT5-10mg/L，25℃，光照16h/d，培养。
切下有生长点的芽植入生根培养基，MS+NAA0.2mg/L+Cb250mg/L+PPT5-10mg/L25℃，光照16h/d，培养。
植酸酶表达盒PCR阳性的油菜植物转到土壤中，于温室内生长。
4、转基因油菜的分子检测4.1 PCR检测PCR检测方法同玉米检测，图13显示的是转基因油菜T1代植株PCR检测的结果。
4.2 Southern-blot检测杂交方法同实施例1。图14显示的是油菜T2代植株Southern-blot检测的结果，油菜基因组DNA经BamHI酶切后，探针为植酸酶基因的500bp片段，转基因油菜杂交后在9Kb处有条带显示。阴性对照无杂交信号。杂交结果说明植酸酶基因已整合到油菜植株中。
5、转基因油菜植株的植酸利用能力测定方法同实施例1，结果见图15和图16。图15a加入到固体培养基中的染色剂的颜色无明显变化，说明生长于该培养基上的转基因油菜利用植酸能力高；图15b加入到固体培养基中的染色剂的颜色变为浅红色，说明生长于该培养基上的非转基因油菜利用植酸能力低；图16a-b加入到液体培养基中的染色剂的颜色无明显变化，说明生长于该培养基上的转基因油菜利用植酸能力高；。图15c加入到液体培养基中的染色剂的颜色变为浅红色，说明生长于该培养基上的非转基因油菜利用植酸能力低。
通过分子检测和植酸利用能力检测，获得表达植酸酶的转基因油菜25个株系。
6、转基因油菜的植酸酶活性的测定6.1油菜种子的植酸酶活性的测定转基因油菜种子粉末100mg经500μl乙醚和石油醚(1∶1)去脂后，测定方法同实施例1，测定结果见表2表2 转基因油菜种子酶活性检测结果
注04p1602、04p5506、04p1606、04p4906本发明转植酸酶基因油菜种子。
6.2根部组织植酸酶活性的测定测定方法及试剂同实施例1，选择种子酶活性较低的株系04p1602和最高的株系04p4906。测定结果见图17，从图17可见，转基因油菜根部的植酸酶活性大约是非转基因对照的12-45倍。
序列表.txtSEQUENCE LISTING<110>中国农业科学研究院生物技术研究所<120>一种提高农作物对土壤植酸磷利用能力的方法<130>008<160>7<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>1452<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>
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<223>
<400>7ctaagcaaaa cactccgccc aa 2权利要求
1.一种提高农作物对土壤植酸磷利用能力的方法，包括以下步骤将SEQID NO.1所示的融合有植酸酶基因和信号肽基因的核苷酸序列可操作的连接到启动子之后，构建单子叶或双子叶植物重组表达载体；将该植物重组表达载体转化受体农作物即可。
2.按照权利要求1的方法，其特征是所述的启动子为Ubi启动子或CaMV35S启动子。
3.按照权利要求1的方法，其特征是所述的植物重组表达载体是单子叶植物表达载体pGA1161EAO或双子叶植物表达载体pBINPLUSEAO。
4.按照权利要求1的方法，其特征是植物重组表达载体转化受体农作物的方法为农杆菌侵染法或基因枪法。
5.按照权利要求1的方法，其特征是所述的受体农作物为玉米或油菜。
6.按照权利要求1的方法，其特征是还包括构建植物选择标记基因表达载体，将所构建的植物选择标记基因表达载体和植物重组表达载体共同转化受体农作物，选育得到表达植酸酶而不含筛选标记基因的转基因作物。
7.按照权利要求6的方法，其特征是所述的植物选择标记基因表达载体为用于单子叶植物转化的选择标记基因表达载体PHP17042Bar或用于双叶植物转化的选择标记基因表达载体pBINPLUSBar。
8.按照权利要求6的方法，其特征是将选择标记基因表达载体PHP17042Bar和单子叶植物表达载体pGA1161EAO用基因枪法共同转化玉米或将选择标记基因表达载体pBINPLUSBar和双子叶植物表达载体pBINPLUSEAO用农杆菌侵染法共同转化油菜。
9.一种检测权利要求1中的转植酸酶基因农作物利用植酸磷能力的方法，包括以下步骤将固体或液体MS培养基中的无机磷全部替换为等量的植酸磷；将转植酸酶基因农作物的后代种子表面消毒、萌发后置于上述MS固体或液体培养基上培养一段时间；向生长有转植酸酶基因农作物的固体或液体MS培养基中加入由FeCl3.6H2O和磺基水杨酸组成的染色剂；如染色剂颜色无明显变化，表明转基因农作物利用植酸磷能力高，如果染色剂颜色变为浅红色至无色，表明转基因农作物利用植酸磷能力低。
10.按照权利要求9的方法，其特征是向生长有转植酸酶基因农作物的固体MS培养基中加入的染色剂由以下重量百分比的组分组成FeCl3.6H2O0.03％、磺基水杨酸0.3％、余者为水；向生长有转植酸酶基因农作物的液体MS培养基中加入为液体培养基1/7体积的染色剂，其中该染色剂由以下重量百分比的组分组成FeCl3.6H2O 0.12％、磺基水杨酸1.2％、余者为水。
全文摘要
本发明提供了一种提高农作物对土壤闭蓄态磷素尤其是植酸磷的利用能力的方法，该方法包括将SEQ ID NO.1所示的融合有植酸酶基因和信号肽基因的核苷酸序列可操作的连接到启动子之后，构建植物重组表达载体；将该植物重组表达载体转化受体农作物。为了安全的需要，本发明方法还包括构建植物选择标记基因表达载体并将其与植物重组表达载体共同转化受体农作物，选育得到表达植酸酶而不含筛选标记基因的转基因作物。本发明通过转基因技术将植酸酶基因转入农作物中，在作物根部高效表达植酸酶，在其整个生长过程中持续表达植酸酶，并向根外分泌，降解土壤中大量存在的植酸磷，将其分解为作物可以吸收利用的无机磷源，从而满足作物对磷的需求。
文档编号C12N15/82GK1766116SQ20051010554
公开日2006年5月3日 申请日期2005年9月27日 优先权日2005年9月27日
发明者陈茹梅, 范云六, 薛光行, 方小平 申请人:中国农业科学院生物技术研究所