专利名称：信息化核酸与使用其的信息化核酸组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及信息化核酸和使用该信息化核酸的信息化核酸组合物的改进，更具体地，涉及可用于个体认证(individualauthentication)的信息化核酸及信息化核酸组合物。
背景技术：
为了认证物品的个体(individuality)，至今已利用了牌照、用于纸币的水印、IC芯片、用于信用卡的面部肖像及类似物作为个体认证的手段。
然而，这些个体认证手段具有这样的缺点，以致于能够从产品上除去，例如，通过撕下、切割、擦掉除去。因此，已经希望发展不能从产品中除去或擦掉的认证信息。
在这方面，在每种生物体中内在含有的DNA是包含生物体全部遗传信息的信息化生物聚合物。大部分DNA对应蛋白质的许多氨基酸序列。DNA包含化合物，例如脱氧腺苷(dA)、脱氧鸟苷(dG)、脱氧胞苷(dC)和胸苷(dT)，这些化合物通过磷酸酯键，以特定的方向结合。假设DNA的碱基数为n，将存在4n种DNA。相应地，设想会有大约43亿种不同的DNA存在，即使由仅仅16种碱基产生。目前，在合成具有几十个碱基序列的DNA时，可以任意合成具有任何碱基的任何DNA。此外，对于具有超过一定水平的量的DNA，可以用自动序列读取装置或测序仪自动确定其碱基序列。
在这样的背景下，已经做了下述建议，如在日本特开2004-159502中公开的，在该公报中，产品具有由含有DNA的非水溶性介质制成的防伪标签。产品的真实性可根据DNA的存在或不存在来检查。
发明内容
然而，在日本特开2004-159502中公开的技术，基本上涉及将DNA与非水溶性介质混合的方法。作为检查产品真实性的方法，该公报公开，含有核糖核酸的目标产品通过检测利用PCR的方法，核糖核酸是否被扩增而鉴定。此外，公报没有公开利用DNA的存在或不存在作为检验指标的个体认证数据，也没有公开涉及个体认证，以及使每个产品、甚至同类产品的个体认证成为可能的数据。
顺便提一句，在物品例如车辆被偷，或者被攻击者破坏，而攻击者潜逃的情况下，需要根据遗留在犯罪现场的物品的油漆或材料片来尽快详细确定目标物品。
考虑到上述问题，本发明的一个目的是提供一种改进的信息化核酸和信息化核酸组合物，其能有效克服在相似性质的常规信息化核酸和信息化核酸组合物中遇到的缺点。
本发明的另一个目的是提供一种改进的信息化核酸和信息化核酸组合物，用这种信息化核酸和信息化核酸组合物可以详细说明产品的来源或经历，从而具体而个别地认证产品，这借助于使信息化核酸和/或信息化核酸组合物在工业产品或类似物中已经含有。
本发明的一方面在于一种信息化核酸，它包含具有任意且已知碱基序列的碱基序列部分或位点。
本发明的另一方面在于一种信息化核酸组合物，其包含信息化核酸，该信息化核酸包含具有任意且已知碱基序列的碱基序列部分；添加剂，包含选自于油脂增溶剂、热稳定剂、光稳定剂、核酸水解酶抑制剂和分散剂所组成的组中的至少一种。
图1A是天然型DNA的结构式；图1B是一个结构式，其中，在图1A DNA的5’位的羟基基团经衍生化；以及图2是显示单链DNA碱基序列的示意图，该单链DNA的识别信息位点在其两端具有引物结合位点。
具体实施例方式
现在参考附图的图1A、图1B和图2，将讨论根据本发明的信息化核酸的实施方式。在本说明书中，所有的百分比(％)是以重量计，除非另外说明。
根据本发明的信息化核酸包含具有任意且已知碱基序列的部分或位点，该部分在下文中称为碱基序列部分。信息化核酸可以容易地包含于产品和产品的材料中，而适用作难以从产品中除去的个体认证手段。
该信息化核酸包含DNA(脱氧核糖核酸)、RNA(核糖核酸)以及DNA和RNA的衍生物。虽然天然型核酸或人造型核酸都可以使用，但是考虑到使核酸包含于在严峻条件下使用的产品中，优选使用结构稳定的人造型核酸。在人造型核酸中，可形成具有在天然型核酸中不存在的结合模式的碱基序列。在该结合模式中，核苷与核苷之间的结合不仅是磷酸酯键，还有非天然型结合例如硫代磷酸酯键。
此外，信息化核酸的任意碱基序列是指碱基序列可任意选择，只要它能够被检测到或读出即可。已知的碱基序列是指用于个体认证的碱基序列以前已经被掌握或确定了。
关于信息化核酸的大小，优选在整个信息化核酸中的碱基数量不大于200。在碱基数量大于200的情况下，在合成阶段，不反应的部分是一点一点制出的，这样其碱基丢失的核酸的含量易于增加。更优选碱基的数量是大约100。
而且，优选在上述碱基序列中，胸腺嘧啶与胸腺嘧啶彼此不相邻。这防止胸腺嘧啶的二聚化。进一步地，在信息化核酸与能与羟基基团反应的化合物一起使用、以及在严峻条件下使用的情况下，从改善稳定性的角度，优选信息化核酸用保护基团衍生。具体地，在3’和5’位的羟基基团中的至少一个可用磷酸酯基团、酰基基团、烷氧羰基基团、苯基基团、取代苯基基团、烯丙基基团及其类似物衍生。图1A显示了天然型DNA的结构式，以及图1B显示了一个结构式，其中在图1A中图示的DNA的5’位的羟基基团经衍生化。在图1B中，分别地，在X是氧原子以及Y是硫原子的情况下，图示DNA是硫代磷酸酯型；并且在X和Y都是硫原子的情况下，图示DNA是二硫代磷酸酯型。
从改善分离和提纯信息化核酸的便利性的观点考虑，进一步优选在5’位的羟基基团用生物素或荧光分子衍生。具体地，使用生物素来衍生信息化核酸的一部分，便于信息化核酸选择性吸收至结合有抗生物素蛋白(一种蛋白质)的柱子上。另一方面，使用荧光分子例如荧光素便于信息化核酸的提纯及类似操作，因为核酸本身变得发荧光而可被灵敏地检测到。这样，在分离和提纯信息化核酸方面改进的便利性，在很大程度上使个体认证更容易。
将被理解，当RNA用作信息化核酸时，从改善稳定性的角度，在2’位的羟基基团可用上述保护基团衍生。
而且，当个体认证在信息化核酸上进行时，其中该信息化核酸处于在产品中包含的状态，从获得有效检测、即使是低含量的信息化核酸的角度，优选用于扩增信息化核酸的部分是上述碱基序列部分。作为扩增低含量信息化核酸的方法，可以适宜地使用聚合酶链式反应(PCR)，通过该方法DNA被增效地扩增。
典型地，优选使用PCR的方法，通过该方法即使很少量的信息化核酸也能被高度扩增。利于这种PCR方法，例如，在与原始DNA的几十个碱基互补的碱基或引物的存在下，在温度控制下，通过使耐热DNA聚合酶在原始DNA上作用，原始的DNA可被扩增。当这种扩增操作重复30次时，原始DNA可被扩增几亿次。这种扩增能够提供足够量的DNA来确定碱基序列。结果，包含原始DNA的产品的特性能够由对应碱基序列的信息而认证。
此外，与上述有关，优选原始DNA在其两端具有对应引物的部分(引物结合位点)，作为用于上述扩增的上述部分。可以使用没有引物的信息化核酸；但是，提供引物能够使在短时间内认证原始DNA成为可能。
关于引物结合位点，优选碱基的数量不小于5，而且更优选碱基的数量不小于10。如果碱基的数量小于5，可区分的核酸的数量减少，因此，需要大量时间来个别地区别大量的目标产品。进一步优选碱基的数量不大于100。如果碱基的数量大于100，在任何位置丢失碱基的副产品的比例不可避免地增加。因此，将花费大量时间和努力来提纯，而在某些情况下，提纯将变得难以进行。
当RNA被用作信息化核酸时，首先通过使用反转录酶获得在碱基序列上与RNA互补的DNA，然后进行PCR法以完成信息化核酸的扩增。
此外，优选该信息化核酸除上述碱基序列部分外，还具有识别信息位点。以该识别信息位点，可以确定更详细的信息，因此达到更高级的个体认证。这由，例如，参考图2说明。如图2所示，在信息化DNA在其两端具有引物结合位点的情况下，m个(数量)碱基序列(B1至Bm)位于中间，其中这m个碱基序列的序列信息对应于识别信息位点。该引物结合位点连接在两端，具有1个(数量)和n个(数量)碱基序列(X1至X1)和(P1至Pn)，分别互补于1和n引物。因为该互补碱基序列的存在，使利用PCR的方法第一次成为可能。单链或双链信息化DNA都可用作信息组分。该双链信息化DNA是单链信息化DNA与互补DNA的复合物。该引物结合位点的碱基序列可以这样安排，使得对互补碱基序列的结合尽可能地稳定，并且通过PCR方法进行的扩增能够顺利进行。
接着，将讨论根据本发明的信息化核酸组合物的具体细节。
根据本发明的信息化核酸组合物是通过混合上述信息化核酸与添加剂例如脂溶赋予剂、热稳定剂、光稳定剂、核酸水解酶抑制剂和/或分散剂，和/或这些添加剂的组合而形成的。添加剂可被加工成超细颗粒，使得向其中吸收信息化核酸或通过共价键结合至信息化核酸。使用这样形成的信息化核酸组合物，信息化核酸能够在产品中分散。
此外，该信息化核酸组合物能够在各种情况或性质下使用，典型地，包含在涂料、树脂、油脂、纤维和粘合剂中。在这些情况下，该信息化核酸组合物可在制造过程中被加到产品的原材料中。该信息化核酸组合物可以包含于纤维、皮革、木材、纸张及其类似物的产品中，其中该产品，例如，被掺入或被覆该信息化核酸组合物。
实施例参考以下实施例，将使本发明更容易明了；但是，这些实施例是用以阐明本发明，不被解释为限制本发明的范围。
实施例1
(1)合成信息化核酸为合成下面显示的信息化DNA(引物结合位点1-识别信息位点-引物结合位点2)，利用亚磷酰胺的方法，核苷按顺序彼此结合。
5’-TGCACGCACCGTGTACTC-GGGATTAATTGGAGG-AGTGGACACGTTGGTCGG-3’(序列1)(2)制备信息化核酸组合物上述合成的成形的信息化核酸被吸收至具有平均粒径0.02μm的氧化锌，以获得含有DNA的细粒。然后，含有DNA的细粒与树脂(塑料)以164μg含有DNA的细粒对100g树脂的比例混合，这样得到信息化核酸组合物。
(3)用包含下列步骤的程序进行检测的方法(a)上述信息化核酸组合物的试样用切割机进行细微破碎。
(b)向经破碎的试样中加入5mL灭菌蒸馏水，然后用磁力搅拌器搅拌，由此将DNA提取至水层中。
(c)用离心分离机将水层从破碎的试样中分离，然后在离心蒸发器中浓缩，以获得经浓缩的DNA溶液。
(d)将经浓缩的DNA溶液(5μL)、PCR缓冲液(5μL)、Taq聚合酶(0.25μL)、灭菌蒸馏水(24.75μL)、引物1(5μL)、引物2(5μL)和2mM dNTP(5μL)混合在一起，以获得混合溶液。引物1和2具有以下碱基序列引物1…5’-TGCACGCACCGTGTACTC-3’(序列2)引物2…5’-CCGACCAACGTGTCCACT-3’(序列3)(e)将混合溶液在94℃加热5分钟，然后进行30个循环温度控制的重复，该温度控制包括94℃加热30秒，40℃冷却30秒和72℃加热30秒，按所述顺序。
(f)混合溶液在72℃加热7分钟，然后在4℃保存。
(g)通过使用单链DNA裂解酶(S1核酸酶)，过量的引物被裂解或分解。然后，进行凝胶过滤，以去除裂解的引物，从而提纯目标双链信息化DNA。
(g)将具有荧光的2，3-双脱氧核苷三磷酸以及一种引物(上述引物1)混合至提纯的信息化DNA中，以获得混合物信息化DNA。
(h)将混合物信息化DNA在94℃加热5分钟，然后进行与在步骤(e)中相同的30个循环的温度控制重复。
(i)混合物信息化DNA用凝胶过滤提纯，然后供给自动测序仪，以确定信息化DNA的碱基序列。
实施例2重复实施例1的步骤来确定信息化DNA的碱基序列，不同的是使用下面显示的信息化DNA来获得信息化核酸组合物，并且用下面显示的引物替换在步骤(d)中的引物2。
信息化DNA5’-TGCACGCACCGTGTACTC-GGGATCACAAGGAGG-AGTGGACACGAAGGTCGG-3’(序列4)在步骤(d)中的引物25’-CCGACCTTCGTGTCCACT-3’(序列5)正如从上述评价，根据本发明，目标产品可以通过确定在其中含有的信息化核酸的碱基序列而被个别地认证，即使目标产品是大量生产的产品例如工业产品。
日本特愿2004-286704(2004年9月30日提交)的全部内容引入此处，作为参考。
虽然通过参考本发明的特定实施方式和实施例已对本发明描述如上，然而，本发明并不局限于上述实施方式和实施例。本领域的技术人员，根据上述教导，可对上述实施方式和实施例进行改进和变化。本发明的范围根据权利要求书限定。
序列表<110>日产自动车株式会社(NISSAN MOTOR CO.，LTD.)樋口恒彦(Tsunehiko HIGUCHI)<120>信息化核酸与使用其的信息化核酸组合物<140>200510105188.7<141>2005-09-30<150>JP2004-286704<151>2004-09-30<160>5<210>1<211>51<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<221>
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<400>1tgcacgcacc gtgtactcgg gattaattgg aggagtggac acgttggtcg g 51<210>2<211>18<212>DNA<213>人工合成序列<220>
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<223>引物
<400>5ccgaccttcg tgtccact 18
权利要求
1.一种信息化核酸，其包含具有任意且已知碱基序列的碱基序列部分。
2.根据权利要求1所述的信息化核酸，其中，该碱基序列是用于扩增核酸的部分。
3.根据权利要求1所述的信息化核酸，其进一步包含用于改进信息化核酸的个体认证的识别信息位点。
4.根据权利要求1所述的信息化核酸，其中，该碱基序列通过合成得到。
5.根据权利要求2所述的信息化核酸，其中，用于扩增的部分在该碱基序列部分的两端都具有聚合酶链式反应所需要的引物结合位点。
6.根据权利要求5所述的信息化核酸，其中，在每个引物结合位点中的碱基数量不小于5。
7.根据权利要求5所述的信息化核酸，其中，在每个引物结合位点中的碱基数量不大于100。
8.根据权利要求1所述的信息化核酸，其中，整个信息化核酸的碱基数量不大于200。
9.根据权利要求1所述的信息化核酸，其中，该碱基序列具有多个胸腺嘧啶，其中一个胸腺嘧啶与另一个胸腺嘧啶在碱基序列上彼此不相邻。
10.根据权利要求1所述的信息化核酸，其进一步包含用于稳定信息化核酸的保护基团。
11.根据权利要求10所述的信息化核酸，其中，该信息化核酸在5’和3’位中的至少一个位置上具有基团，该基团用保护基团衍生。
12.根据权利要求10所述的信息化核酸，其中，该保护基团是选自于由磷酸酯基团、酰基基团、烷氧羰基基团、苯基基团、取代苯基基团和烯丙基基团所组成的组中的至少一种。
13.根据权利要求10所述的信息化核酸，其中，该信息化核酸在5’位上具有羟基基团，该羟基基团用生物素或荧光分子衍生。
14.一种信息化核酸组合物，其包含信息化核酸，其包含具有任意且已知碱基序列的碱基序列部分；以及添加剂，其包含选自于由脂溶赋予剂、热稳定剂、光稳定剂、核酸水解酶抑制剂和分散剂所组成的组中的至少一种。
全文摘要
一种信息化核酸，其包含具有任意且已知碱基序列的碱基序列部分。该信息化核酸与添加剂例如油脂增溶剂、热稳定剂、光稳定剂、核酸水解酶抑制剂和/或分散剂混合，以形成信息化核酸组合物。
文档编号C12N15/09GK1765914SQ200510105188
公开日2006年5月3日 申请日期2005年9月30日 优先权日2004年9月30日
发明者横山博志, 山中雅彦, 渡边健太郎, 樋口恒彦, 林秀敏 申请人:日产自动车株式会社, 樋口恒彦