治疗性肽和方法

专利名称：治疗性肽和方法
技术领域：
本发明涉及免疫学领域。更具体的，本发明涉及炎症以及包含TREM-1蛋白的某些序列的蛋白质和肽及其功能等同体(文中称之为TREM1-肽)在治疗疾病如败血症和脓毒性休克中的用途。
背景技术：
败血症构成了对重症护理资源的显著消耗并仍旧是重症护理单位中经常存在的问题。据估计，每年在美国和欧洲都有400000至500000个患者受到了这样的感染。尽管支持性疗法和抗菌疗法均取得了进步，但发病率和死亡率仍旧居高不下。在那些患有脓毒性休克和多器官障碍的患者中，死亡率从无并发症的败血症的40％变动到了80％。现在条件发病机理正变得日益明确。更多地了解免疫、炎症和血液介质的复杂网络就可以开发合理和新的疗法。
感染后，先天和识别免疫应答相继形成，这两个阶段特异性和复杂性逐步增强，最终导致清除感染因子并恢复内稳态。先天免疫应答作为第一道防线，并且是经由模式识别受体如Toll样受体(TLR)的活化，通过各种病原相关的微生物模式(PAMP)(3)而起始(1，2)的。TLR的活化触发了大量诸如TNF-α和IL-1β的细胞因子的释放，这在诸如败血症的重大感染的情况下，能加速组织损伤和致命的休克(4，5)。尽管TNF-α和IL-1β拮抗剂作为可能感兴趣的败血症治疗剂在此环境下出现，但不幸的是，它们在临床试验中显示出有限的功效(6-8)。这可能归因于这样的事实，即这些细胞因子对于清除感染来说是必需的，而去除它们会造成致命的细菌生长(9-11)。
其中，参与感染应答的另一种受体，即表达在髓样细胞-1上的触发受体(TREM-1)，是最近发现的受体家族TREM家族的成员，其在嗜中性粒细胞和单核细胞亚型的表面表达。TREM受体通过与适配分子DAP12的结合而活化髓样细胞。业已报道在微生物产物的存在下，TREM-1的结合触发了前炎性细胞因子的合成。
表达在髓样细胞-1上的触发受体(TREM)-1是最近发现的细胞表面分子，其在人和鼠分叶核嗜中性粒细胞和成熟单核细胞上均已被鉴定出(12)。它属于免疫球蛋白超家族并在称之为DAP12的适配蛋白的辅助下，激活下游信号转导路径(12-15)。Bouchon和同事们证明，在诸如铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的细菌的存在下，在细胞培养物和来自感染患者的组织样品中的嗜中性粒细胞和单核细胞上TREM-1的表达都被极大地上调(16)。与之惊人地相反，在来自非感染性炎性疾病如由免疫复合物造成的牛皮癣、溃疡性结肠炎或脉管炎的患者的样品中，TREM-1并不上调(16)。另外，当TREM-1与其配体结合时，存在着LPS和前炎性细胞因子TNF-α和GM-CSF的扩大合成的协同效应，连同IL-10产量的抑制(17)。在LPS诱导的脓毒性休克的鼠模型中，阻断TREM-1信号转导防止动物死亡，这进一步凸显出该分子的关键作用(13，16)。
最近的研究证实TREM-1在针对感染的炎症反应中起了关键的作用(参见BOUCHON等(2000)《免疫学杂志》(J.Immunol.)1644991-4995)。在髓样细胞上TREM-1表达增加以应答人的细菌和真菌感染。相似的，在小鼠中，由脂多糖(LPS)诱导的休克与TREM-1表达增加相关。另外，用可溶TREM-1/Ig融合蛋白作为“诱骗”受体处理小鼠，会防止鼠死于LPS或大肠杆菌(E.Coli)。
名称为“186个分泌蛋白质”的US6,420,526要求保护未指明而且未加例证的分离的TREM-1片段，其包含人TREM-1至少30个连续的氨基酸。没有提供与这些片段相关的生物学数据。
如US2003165875A中所述，人IgG1恒定区和小鼠TREM-1胞外结构域或人TREM-1胞外结构域之间的融合蛋白在小鼠中显示出抗内毒素血症的效果。
本发明人令人惊讶地发现，某些衍生自TREM-1蛋白的肽能作为TREM-1蛋白的拮抗剂起作用，因此在治疗败血症和脓毒性休克中具有应用。本发明人进一步证实了该肽也能在体内调节感染触发的前炎性级联反应，从而在败血症动物模型中抑制高反应性及死亡。
以前，本发明人鉴定出了可溶形式的TREM-1(sTREM-1)，并观察到其在脓毒性休克患者血清样品中的显著水平，但对照组中没有。如本文所述，本发明人研究了其在败血症中调节炎症的假定性的作用(参见Gibot等(2004)《国际医学年报》(Ann.Intern.Med.)141(1)9-15和Gibot等(2004)《新英格兰医学杂志》(N.Engl.J.Med.)350(5)451-8)。
如本文所述，本发明人发现可溶形式的TREM-1(sTREM-1)在鼠的感染侵入期间释放到外周血中。本发明人也证实了单核细胞为sTREM的主要来源，并证明模拟TREM-1胞外结构域部分的合成肽能在体外调节活化单核细胞的细胞因子产量。
本发明人观察到了sTREM-1是由LPS体外活化的单核细胞以及脓毒性休克实验模型所涉及的动物血清中的单核细胞分泌的。在体外和体内，模拟TREM-1短的高度保守结构域的合成肽都削弱人单核细胞的细胞因子产量，并防止败血病动物的高反应性及死亡。这些肽不仅在预防而且在下调前炎性细胞因子有害效果方面都是有效的。这些数据证实，对于治疗感染如败血症或脓毒性休克，或对于治疗败血症样病情，TREM-1肽对TREM-1的体内调节是一种有价值的治疗工具。

发明内容
由此，本发明提供了用于治疗感染性疾病，尤其是败血症和脓毒性休克，或用于治疗败血症样病情的方法和组合物。
如本文所述，本发明人确定，若干TREM-1蛋白胞外部分的肽(参见表1)，并入了来自“CDR2”和“CDR3”的序列，它们令人惊讶的具有与前述败血症模型中IgG1恒定区和TREM-1胞外结构域融合蛋白相似的活性。这些肽也具有超过蛋白质的优点，尤其在生产的成本上。
因此，本发明提供了这样的多肽，其包含源自TREM-1蛋白CDR2或CDR3的一个或多个序列。优选所述多肽包含所述TREM-1蛋白的少于30个的连续氨基酸。
如表1所示，例如，这种肽或多肽的例子含有或包含来自TREM-1蛋白的15-25个氨基酸(“AA”)的肽，并含有或包含为来自该蛋白质的天然序列所侧接的受体的全部或部分CDR结构域(3-6AAs)，其长度可以变化，只要该CDR样结构域的功能不丧失即可。比如，该肽衍生自TREM-1受体蛋白氨基酸序列，如表2(人)和表3(小鼠)所示。
表1显示了衍生自鼠TREM-1“mPX”(NCBI参照序列(RefSeq)NP_067381)或人TREM-1“hPX”(NCBI参照序列(RefSeq)NP_061113)的肽。下划线标出的氨基酸跨越人TREM-1互补决定区(CDR)，如Radaev等2003Structure(Camb.)11(12)，1527-1535(2003)所述。
表2显示了人TREM-1氨基酸序列NP_061113。下划线标出的氨基酸跨越人TREM-1互补决定区(CDR)2(RPSKNS；[SEQ ID NO20])和3(QPPKE[SEQ ID NO21])，如Radaev等2003 Structure(Camb.)11(12)，1527-1535(2003)所述。
表3显示了小鼠TREM-1氨基酸序列NP_067381。下划线标出的氨基酸跨越小鼠TREM-1互补决定区(CDR)2(RPFTRP；[SEQ ID NO22])和3(HPPND[SEQ ID NO23])。
表1.包括来自人和小鼠TREM-1CDR2和CDR3的序列的肽

表2.人TREM-1氨基酸序列NP_061113

表3.小鼠TREM-1氨基酸序列NP_067381

由此，本发明提供了分离或重组制备的基本上包含或由源自TREM-1蛋白CDR2或CDR3的一个或多个序列组成的多肽或肽，或如本文所定义的此类多肽的片段、同源物、衍生物、融合蛋白或变体，其在本文中统称为“本发明的多肽或肽”或“TREM-1肽或TREM-1多肽”，优选这些实体包含TREM-1蛋白的少于30个的连续氨基酸，例如，如表2或表3所示。通常当本发明的多肽或蛋白质或其片段、同源物、衍生物、或变体旨在用于(如治疗)特定的物种时，则TREM-1蛋白CDR2或CDR3序列选自于该物种的TREM-1蛋白氨基酸序列，或者如果序列未知，则选自于类似物种。例如，用于治疗人类疾病，尤其是败血症、脓毒性休克或败血症样病情的本发明的多肽或蛋白质，将包含包括人TREM-1蛋白CDR2或CDR3的全部或部分的一个或多个序列。
此外，本发明提供了分离的包含以下氨基酸序列的多肽或蛋白质，或其片断、同源物、衍生物或变体，所述氨基酸序列与氨基酸序列SEQ ID NO20、21、22、23具有至少约60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％同一性。本发明还提供了分离的包含以下氨基酸序列的肽、多肽或蛋白质，或其片段、同源物、衍生物或变体，所述氨基酸序列包含或由TREM-1蛋白的至少约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29或更多个连续氨基酸组成，其中3个或以上的连续氨基酸源自SEQ ID NO20、21、22、23的序列(换句话说，代表TREM-1蛋白CDR2或CDR3全部或部分的序列存在于所述肽、多肽或蛋白质之中)。在优选的实施方案中，这样的肽、多肽或蛋白质，或其片段、同源物、衍生物或变体具有TREM-1全长蛋白的生物学活性，如抗原性、免疫原性、触发前炎性趋化因子和细胞因子、动员胞质Ca2+、蛋白质的酪氨酸磷酸化、介质释放、以及其他能容易检测的活性。通常，这样的肽、多肽或蛋白质，或其片段、同源物、衍生物或变体能治疗败血症、脓毒性休克或败血症样病情，或在败血症、脓毒性休克或败血症样病情的实验模型中有活性，例如通过作为TREM-1受体活性拮抗剂来起作用。这样的肽、多肽或蛋白质，或其片段、同源物、衍生物或变体特征在于能治疗、改善、或减轻败血症、脓毒性休克或败血症样病情的症状。
尤其，本发明提供了具有抗败血症、脓毒性休克或败血症样病情的TREM-1多肽，其由(i)对应于天然TREM-1蛋白序列的5至29，如15-25个氨基酸的连续序列，该序列包括来自CDR2或CDR3序列的至少3个氨基酸；或(ii)其中一个或多个氨基酸由其他提供的氨基酸保守取代，可来自CDR2或CDR3序列的至少3个氨基酸不被取代的这样的序列；或(iii)在其N和C末端之一或两端都连上异源多肽的(i)或(ii)的序列组成。例如，在一种多肽中，其中天然TREM-1蛋白序列是标识为[SEQ ID NO1]的人类序列，CDR2和CDR3序列分别是RPSKNS和QPPKE。在此类多肽中，来自CDR2或CDR3序列的至少3个氨基酸可以是QPP、PPK、PKE、RPS、PSK、SKN或KNS。此类多肽可以包含序列QPPK、QPPKE或RPSKNS。例如，在其中天然TREM-1蛋白序列是标识为[SEQ ID NO2]的小鼠序列的多肽中，CDR2和CDR3序列分别是RPFTRP和HPPND。在此类多肽中，来自CDR2或CDR3序列的至少3个氨基酸可以是HPP、PPN、PND、RPF、PFT、FTR或TRP。此类多肽可以包含序列HPP、HPPN、HPPND或RPFTRP。
在某些实施方案中，本发明的多肽是或包含SEQ ID No.7，其公开在Gibot等(2004)J Exp Med200，1419-1426中。
在某些实施方案中，本发明的多肽不是也不包含SEQ ID No.7。
在某些实施方案中，本发明的多肽是或包含选自SEQ ID No.3、4和6的序列。
在某些实施方案中，本发明的多肽是或包含选自SEQ ID No.16、17、18和19的序列。
在某些实施方案中，本发明的多肽是或包含源自CDR2的序列。
在某些实施方案中，本发明的多肽是或包含源自CDR3的序列。
提供了本发明的多肽或肽用于治疗，尤其治疗败血症、脓毒性休克或败血症样病情，并用于制备治疗败血症、脓毒性休克或败血症样病情的药物。本发明进一步提供了包含本发明的多肽或肽的组合物和药物组合物，以及利用本发明的多肽或肽治疗败血症、脓毒性休克或败血症样病情的方法。另外，提供了本发明的多肽或肽用于治疗以恢复败血症、脓毒性休克或败血症样病情中的血液动力学参数，并用于制备治疗败血症、脓毒性休克或败血症样病情中的异常血液动力学参数的药物。
术语“在髓样细胞上表达的触发受体”或“TREM”指一组活化受体，其在不同类型的髓样细胞上选择性地表达，如肥大细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞(DCs)和嗜中性粒细胞，并可以在免疫和炎症应答中发挥决定性的作用。TREM基本上是跨膜糖蛋白，在它们的胞外结构域具有Ig型折叠，并因此属于Ig-SF。这些受体含有短的胞外结构域，但缺少信号转导介质的停泊基序，并需要适配蛋白如DAP12进行细胞活化。
如本文所用的术语“髓样细胞”指一系列骨髓来源的细胞系，包括粒细胞(嗜中性粒细胞、嗜曙红细胞和嗜碱性粒细胞)、单核细胞、巨噬细胞和肥大细胞。另外，也包括髓样起源的外周血树突细胞，以及体外在适宜培养条件下来源于单核细胞的树突细胞和巨噬细胞。
如本文所定义的术语“败血症、脓毒性休克”或“败血症或脓毒性休克”指全身性炎症应答综合症(SIRS)的亚型。当怀疑或证实感染时，术语“败血症”通常是SIRS的保留用法。在非常病重的患者中已显示出针对系列损伤的生理学变量模式，所述损伤包括外伤、烧伤、胰腺炎和感染。这些模式包括炎症反应、白细胞增多或严重白血球减少症、高热症或低温症、心动过速或呼吸急促，并统称全身性炎症应答综合症(SIRS)。该定义强调在这些状况中的炎症过程的重要性，而无论存在感染与否。在出现器官灌注不足的证据时，败血症进一步演变成了严重败血症，这通过器官功能障碍的迹象显示出来，如血氧过少、尿过少、乳酸酸中毒或脑功能改变。“脓毒性休克”是通常并发低血压的严重的败血症，在人体中定义为即使有充足的体液复苏，心脏收缩血压也低于90mmHg。因为器官灌注和充氧失调，败血症和SIRS可能并发两个或多个器官衰竭，这称作多器官衰竭(MOF)。除了感染的全身效应，全身炎症反应可以发生在严重炎症状况下，如胰腺炎和烧伤。继外伤损害出现的炎症反应迹象没有太好的定义。在重症护理单位中，革兰氏阴性菌牵涉到50至60％的败血症病例，而革兰氏阳性菌占另外35至40％的病例。剩下的病例归因于较不常见的真菌、病毒和原生动物。
如本文使用的术语“败血症样病情”指那些状态，其中患者呈现出与败血症或脓毒性休克相似的症状，但是感染因子并非如在败血症中所见的那样，是相似炎症介质级联反应和/或血液动力学参数改变的基本或起始成因，例如在急性或慢性肝衰竭患者中(参见Wasmuth HE等《肝脏病学杂志》(J Hepatol.)2005年2月；42(2)195-201)，在心搏动停止后的复苏后疾病的病例中(参见AdrieC等Curr Opin Crit Care.2004年6月；10(3)208-12)，在癌症化疗后治疗败血症样病情的治疗中(参见Tsuji E等《国际癌症杂志》(Int J Cancer.)2003年11月1日；107(2)303-8)，在用重组TNF-alpha或相似疗法进行高热分离肢体灌输的患者中(参见Zwaveling JH等Crit Care Med.1996年5月；24(5)765-70)或者新生儿中的败血症样病患(参见Griffin MP等《儿科研究》(Pediatr Res.)2003年6月；53(6)920-6)。
本文使用的术语“抗败血症、脓毒性休克或败血症样病情的活性”指分子如肽、多肽或工程抗体治疗败血症、脓毒性休克或败血症样病情的能力，或在败血症、脓毒性休克或败血症样病情的实验模型中有活性，如通过作为TREM-1受体活性拮抗剂来起作用。
典型的，本发明多肽的适应症是抗败血症或脓毒性休克。
术语“基本上的序列同一性”，在与肽/氨基酸序列联用时，指在序列上基本相同或相似的肽/氨基酸序列，引起构型上的类似从而造成相似的生物活性。该术语并不旨在暗示共同的序列进化。
典型的，具有“基本上的序列同一性”的肽/氨基酸序列是在序列上至少50％、更优选至少80％相同的序列，其至少涵盖已知参与期望活性的任何区域。最优选的，除了在末端，不超过5个残基不同。优选的，至少在前述区域中，序列区别为“保守修饰”的形式。
为确定两条肽/氨基酸序列或两条核酸序列的序列同一性百分比，为最佳比较目的而将序列进行比对(如，可在第一和第二氨基酸或核酸序列之一或两者中都引入空位以进行最佳比对，而且为比较目的可忽略非同源序列)。例如，为比较目的进行比对的参照序列的长度是参照序列长度的至少30％，优选至少40％，更优选至少50％，甚至更优选至少60％，并且甚至更优选至少70％、80％、或90％(如，当将第二序列与具有如100个氨基酸残基的第一氨基酸序列进行比对时，将比对至少30，优选至少40，更优选至少50，甚至更优选至少60，并且甚至更优选至少70、80、或90个氨基酸残基)。然后比较在相应氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置为第二序列相应位置上的相同氨基酸残基或核苷酸所占据时，则那个位置上分子是相同的(如文中所用，氨基酸或核酸“同一性”等同于氨基酸或核酸“同源性”)。两序列间的同一性百分比是序列共享的相同位置数的函数，其中将空位数和每个空位的长度考虑在内，它们是为最佳比对两序列而需要引入的。序列比较和两序列间的同一性百分比的确定可利用数学算法来完成。在一个实施方案中，两氨基酸序列间的同一性百分比利用Needleman和Wunsch算法(J.Mol.Biol.(48)444-453(1970))来确定，其被整合进了GCG软件包的GAP程序中(可在http//www.gcg.com中获得)，其使用Blossom 62矩阵或PAM250矩阵，且空位权重为16、14、12、10、8、6或4，而长度权重为1、2、3、4、5或6。在另一个实施方案中，两核苷酸序列间的同一性百分比利用GCG软件包的GAP程序(可在http//www.gcg.com中获得)来确定，使用了NWSgapdna.CMP矩阵，且空位权重为40、50、60、70或80，而长度权重为1、2、3、4、5或6。在另一个实施方案中，两氨基酸或核苷酸序列间的同一性百分比利用E.Meyers和W.Miller算法(CABIOS，411-17(1989))来确定，其被整合进了ALIGN程序(2.0版)中，其使用了PAM120权重残基表，空位长度罚分为12，空位罚分为4。本发明的核酸和蛋白质序列能进一步用作“查询序列”来对公共数据库进行检索以鉴定诸如其他家族成员或相关序列。这样的检索可利用Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215403-10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)进行。BLAST核苷酸检索可用NBLAST程序进行，得分＝100，字长＝12，从而获得与本发明NIP2b、NIP2cL和NIP2cS核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质检索可用XBLAST程序进行，得分＝50，字长＝3，从而获得与本发明NIP2b、NIP2cL和NIP2cS蛋白质分子同源的氨基酸序列。要获得用于比较目的的空位比对，如Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25(17)3389-3402所述，可利用空位BLAST。当利用BLAST和空位BLAST程序时，可使用各自程序(如NBLAST和XBLAST)的默认参数。参见http//www.ncbi.nlm.nih.gov。
术语“蛋白质”和“多肽”在文中可互换使用。本文使用的术语“肽”指具有两个或更多氨基酸或氨基酸类似物(包括非天然产生的氨基酸)的链，相邻氨基酸由肽(-NHCO-)键连接。因而，本发明的肽包括寡肽、多肽、蛋白质、拟位(mimetopes)和拟肽。制备拟位和拟肽的方法是本领域公知的。
术语“拟位”和“拟肽”在文中可互换使用。化合物X的“拟位”指一种化合物，其中对于X的功能活性所必需的X的化学结构为其他模拟X构型的化学结构所代替。拟肽的实例包括肽化合物，其中肽主链为一个或多个苯二氮分子(参见如，James，G.L.等(1993)《科学》(Science)2601937-1942)和“回-反”肽(参见Sisto的美国专利No.4,522,752)所取代。术语“拟位”和“拟肽”也指除了自然形成的氨基酸之外的部分，其构型和功能可用作含肽化合物中特定氨基酸的替代物而不会显著程度地不利地干扰肽的功能。氨基酸模拟物的实例包括D-氨基酸。用一个或多个D-氨基酸取代的肽可用众所周知的肽合成操作制备。其他取代包括具有带官能团的变体侧链的氨基酸类似物，如b-氰丙氨酸、刀豆氨酸、黎豆氨酸、正亮氨酸、3-磷酸丝氨酸、高丝氨酸、二羟苯丙氨酸、5-羟色氨酸、1-甲基组氨酸、或3-甲基组氨酸。
如文中所用的化合物X的“类似物”指一种化合物，其保留了对于X的功能活性所必需的X的化学结构，还包含某些不同于X的某些化学结构。自然产生的肽的类似物的例子是包括一个或多个非天然产生的氨基酸的肽。术语“类似物”也旨在包括修饰的拟位和/或拟肽、修饰的肽和多肽，以及肽和多肽的等位变体。所以肽的类似物将产生基本上同源的肽类似物，或换句话说，其与原始肽具有基本上的序列同一性。术语“氨基酸”包括本领域公认的含义并广义上涵盖式I的化合物 优选的氨基酸包括天然产生的氨基酸、以及合成衍生物、和衍生自蛋白质的氨基酸，如，诸如酪蛋白的蛋白质，即酪蛋白氨基酸(casamino acids)，或如酵母、动物制品、如肉水解液、或植物制品、如大豆蛋白、棉子蛋白、或玉米浆的酶或化学水解液(参见如，Traders’Guide to Fermentation Media，TradersProtein，Mephis，TN(1988)，《生物技术工业微生物学教科书》(BiotechnologyA Textbook of Industrial Microbiogy)，Sinauer Associates，Sunderland，MA(1989)，和《玉米浆产品数据表》(Product Data Sheet for Corn Steep Liquor)，GrainProcessing Corp.，IO)。
术语“天然产生的氨基酸”包括生物系统中通常构成大多数多肽的20种氨基酸残基的任何一种、见于纤维蛋白的稀有氨基酸(如，4-羟脯氨酸、5-羟赖氨酸、N-甲基赖氨酸、3-甲基组氨酸、锁链赖氨酸、异锁链赖氨酸)，以及在蛋白质中未发现的天然产生的氨基酸(如，氨基丁酸、高半胱氨酸、高丝氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸、刀豆氨酸、黎豆氨酸和-氰丙氨酸)。
术语“天然产生的氨基酸的侧链”旨在包括任何天然产生的氨基酸的侧链，如式I中R所代表的。所属领域技术人员会理解式I的结构旨在涵盖诸如脯氨酸的氨基酸，其中侧链为环或杂环结构(如，脯氨酸中的R基团和氨基形成5元杂环)。
文中使用的术语“同源物”指一系列具有共同生物活性和/或结构域、并具有足够的如本文所定义的氨基酸同一性的肽或多肽的任何成员，，所述生物活性包括抗原性/免疫原性和炎症调节活性。这样的同源物可以来自相同或不同的动物物种。
文中使用的术语“变体”指给定肽的天然产生的等位变异体或给定肽或蛋白质的重组制备的变异体，其中一个或多个氨基酸残基通过氨基酸取代、添加或缺失而修饰。
本文中使用的术语“衍生物”指以其他方式修饰的给定肽或蛋白质的变异体，即通过任何类型的分子共价连接于肽或蛋白质，优选具有生物活性，其包括非天然产生的氨基酸。
优选的，这样的同源物、变体和衍生物能治疗败血症、脓毒性休克或败血症样病情，或在败血症、脓毒性休克或败血症样病情的实验模型中有活性，如作为TREM-1受体活性拮抗剂来起作用。
“分离”或“纯化”的肽或蛋白质是基本没有来自获得蛋白质的细胞或组织来源的细胞材料或其他污染蛋白，或在化学合成时基本没有化学前体或其他化学物质。
用语“基本上没有细胞材料”包括多肽/蛋白制品，其中多肽/蛋白质是从分离或重组产生它的细胞的细胞成份中分离。因此，基本上没有细胞材料的多肽/蛋白质包括具有少于约30％、20％、10％、5％、2.5％或1％(以干重计)的污染蛋白的多肽/蛋白制品。当重组产生多肽/蛋白质时，也优选基本上没有培养基，即培养基相当于少于约20％、10％或5％的蛋白制品的体积。当通过化学合成产生多肽/蛋白质时，优选基本没有化学前体或其他化学物质，即从参与蛋白质合成的化学前体或其他化学物质中分离出来。由此，这样的多肽/蛋白质制品具有少于约30％、20％、10％、5％(以干重计)的化学前体或目的多肽/蛋白质片段以外的化合物。在本发明的优选实施方案中，多肽/蛋白质是分离或纯化的。
除了上述多肽，本发明的多肽也包括那些多肽，其具有共同生物活性和/或结构域，并具有如本文定义的足够的氨基酸同一性(同源性)。这些同源物可以来自相同或不同的动物物种，优选来自哺乳动物，更优选来自啮齿动物，如小鼠和大鼠，并且最优选来自人。优选的，它们显示出TREM-1的至少一个结构和/或功能特征，并优选能治疗败血症、脓毒性休克或败血症样病情，如作为TREM-1受体活性拮抗剂来起作用。这样的修饰包括氨基酸取代、缺失和/或插入。氨基酸修饰能通过任何本领域已知方法来制备，各种方法对于所属领域技术人员来说是可以获得的并且是常规的。
另外，在进行氨基酸取代时，通常待取代的氨基酸残基是保守的氨基酸取代(即“保守性取代”)，如极性残基用极性残基取代，亲水残基用亲水残基取代，疏水残基用疏水残基取代，带正电荷的残基用带正电荷的残基取代，或带负电荷的残基用带负电荷的残基取代。另外，待修饰的氨基酸残基一般不是种间高度或完全保守的，和/或对保持其源自的肽和/或蛋白质的生物学活性来说是关键的。
本发明的肽可用任何方便的方式直接合成。通常在整个合成期间要保护存在着的反应基团(如氨基、巯基和/或羧基)。一部分本发明的肽，即其中所包含的氨基酸是遗传编码的氨基酸的那些，通过所属领域技术人员公知的表达系统，将能在原核和真核宿主中表达。分离纯化诸如微生物表达肽的方法也是公知的。编码这些本发明的肽的多核苷酸构成了本发明的另一方面。本文所用的“多核苷酸”指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚体，为分离片段的形式或作为更大构建体的组分，如诸如质粒的表达载体。本发明的多核苷酸序列包括DNA、RNA和cDNA序列。由于遗传密码子的简并性，当然不止一个多核苷酸能编码根据本发明的特定肽。当选择细菌宿主表达肽时，可能需要采取步骤保护宿主免受表达的抗菌肽影响。这样的技术是本领域已知的，并包括使用抗特定表达肽的细菌菌株，或表达这样的融合肽，其在一端或两端具有能使根据本发明肽的抗生素活性失效的部分。在后一种情况下，肽可在收获后裂解以产生活性肽。如果肽掺入了化学修饰，则表达肽的活性/稳定性可能低，并仅受合成后化的学修饰调节。
另外，本发明也包括本发明多肽的衍生物。例如，但并非限制性地，衍生物可包括修饰的肽或蛋白质，如通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/封闭基团衍生化、蛋白酶水解切割、与细胞配体或其他蛋白质连接等进行。各种化学修饰可通过已知技术进行，包括但不限于，特异性化学裂解、乙酰化、甲酰化等。另外，衍生物可包含一个或多个非经典氨基酸。所属领域技术人员会知道各种修饰肽的方法以增加效力、延长活性和/或提高半衰期。在一个例子(WO0210195)中，通过在肽的N端、肽的C端、或肽链的游离氨基或羧基上通过酰胺键与至少一个刚性构型的取代基偶联来进行修饰。具有相似效果的肽修饰的其他例子在如WO2004029081、WO03086444、WO03049684、WO0145746、WO0103723和WO9101743中描述。
本发明进一步提供了抗体，其包含本发明的肽或多肽，或模拟本发明的肽或多肽的活性。这样的抗体包括但不仅限于多克隆、单克隆、双特异性、多特异性、人、人源化、嵌合抗体、单链抗体、Fab片段、F(ab’)2片段、二硫键相连的Fv，以及包含VL或VH结构域或者甚至互补决定区(CDR)的能特异结合本发明多肽的片段。在另一个实施方案中，也可以用本领域公知的各种噬菌体展示方法来产生抗体。利用本领域已知方法也可采用重组产生Fab、Fab’和F(ab’)2片段的技术，如PCT公开WO 92/22324；Mullinax等《生物技术》(BioTechniques)，12(6)864-869，1992；和Sawai等，1995，AJRJ 3426-34；和Better等，1988，《科学》(Science)2401041-1043所述(特此将其中每篇都全文纳入作为参考)。可用于生产单链Fv和抗体的技术例子包括那些如美国专利No.4,946,778和5,258,498；Huston等，1991，《酶学方法》(Methods in Enzymology)20346-88；Shu等，1993，《美国国家科学院进展》(Proc.Natl. Acad.Sci.USA)907995-7999；和Skerra等，1988，《科学》(Science)2401038-1040中所述的。对于一些应用，包括抗体在人体中的体内应用和体外检测试验，优选使用嵌合、人源化或人抗体。嵌合抗体是一种分子，其中抗体的不同部分来源于不同的动物物种，如具有来源于鼠单克隆抗体可变区和来源于人免疫球蛋白恒定区的抗体。产生嵌合抗体的方法是本领域已知的，如参见Morrison，1985，《科学》(Science)2291202；Oi等，1986，《生物技术》(Biotechniques)4214；Gillies等，1989，《免疫学方法杂志》(J.Immunol.Methods)125191-202；美国专利No.5,807,715、4,816,567和4,816,397；特此将它们都全文纳入作为参考。人源化抗体是来自非人物种的抗体分子，其将来自非人物种的具有一个或多个互补决定区(CDR)的期望抗原和来自人免疫球蛋白分子的框架区(或在本发明的情况下，一个或多个源自TREM-1蛋白的CDR)结合在一起。如本领域已知的，人框架区中的框架残基能用来自CDR供体抗体的相应残基替换以改变、优选增强抗原结合。这些框架替代通过本领域公知的方法来鉴定，如通过CDR和框架残基相互作用的建模从而鉴定出对抗原结合重要的框架残基，并通过序列比较来鉴定特定位置上不寻常框架残基。参见如，Queen等，美国专利No.5,585,089；Riechmann等，1988，《自然》(Nature)332323，1988，特此将它们都全文纳入作为参考。抗体可利用各种本领域已知技术来人源化，包括诸如，CDR移植(EP239,400；PCT公开文件WO91/09967；美国专利No.5,225,539、5,530,101和5,585,089)、表面重塑(veneering or resurfacing)(EP 592,106；EP 519,596；Padlan，1991，《分子免疫学》(Molecular Immunology)，28(4/5)489-498；Studnicka等，1994，《蛋白质工程》(Protein Engineering)，7(6)805-814；Roguska等，1994，《美国国家科学院进展》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)91969-973，和链改组(美国专利No.5,565,332)，特此将它们都全文纳入作为参考。
全人抗体对于治疗人类患者特别理想。人抗体可通过各种本领域已知技术制备，包括上述噬菌体展示方法，其使用来源于人免疫球蛋白序列的抗体库。参见美国专利No.4,444,887和4,716,111；以及PCT公开WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735和WO 91/10741，特此将其中每篇都全文纳入作为参考。也可用转基因小鼠生产人抗体(参见Lonberg和Huszar(1995)，《国际免疫学综述》(Int.Rev.Immunol.)1365-93)。例如，生产人抗体和人单克隆抗体的详细技术讨论和生产这些抗体的方案，参见PCT公开WO 98/24893、WO 92/01047、WO 96/34096、WO 96/33735；欧洲专利No.0598877；美国专利No.5,413,923、5,625,126、5,633,425、5,569,825、5,661,016、5,545,806、5,814,318、5,885,793、5,916,771和5.939.598；特此将它们都全文纳入作为参考。另外，诸如Abgenix公司(Freemont，CA)、Medarex(NJ)和Genpharm(San Jose，CA)的公司利用与上述相似的技术，可致力于提供直接抗所选抗原的人抗体。识别所选表位的全人抗体可用称之为“导向选择”的技术来产生。在该方法中，选择的非人单克隆抗体如小鼠抗体，被用于指导选择识别相同表位的全人抗体(Jespers等，1988，《生物技术》(Bio/technology)12899-903)。与异源多肽融合或缀合的抗体可用于本领域公知的体外免疫测试和纯化方法(如亲合层析)中。参见诸如PCT公开WO 93/21232；EP 439,095；Naramura等，1994，《免疫学通讯》(Immunol.Lett.)3991-99；美国专利No.5,474,981；Gillies等，1992《美国国家科学院进展》(Proc Natl.Acad.Sci.USA)891428-1432；和Fell等，1991，《免疫学杂志》(J.Immunol.)1462446-2452，特此将它们都全文纳入作为参考。
在另一方面，本发明提供了鉴定结合或调节本发明多肽活性的化合物或配体的方法。此方法包括在测试化合物存在或不存在下测量多肽生物学活性，并鉴定改变(提高或降低)多肽生物活性的测试化合物。
在一个实施方案中，本发明提供了一种融合蛋白，其包含生物活性分子和本发明多肽的一个或多个结构域或其片段。尤其是，本发明提供了这样的融合蛋白，其包含与本发明多肽的一个或多个结构域或其片段重组融合或化学缀合(包括共价和非共价缀合)的生物活性分子。
本发明进一步包括融合蛋白，其中本发明多肽或其片段与异源多肽(即无关多肽或其部分，优选该多肽的至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90或至少100个氨基酸)重组融合或化学缀合(包括共价和非共价缀合)以产生融合蛋白。融合不必是直接的，但可以通过接头序列进行。
在一个例子中，融合蛋白中本发明多肽或其片段可与来源于各种类型的免疫球蛋白的序列融合。例如，本发明多肽可与人IgG1或IgM分子的恒定区(如，铰链、CH2和CH3结构域)融合，(如，如Hudson & Souriquso(2003)《自然医学》(Nature Medcine)9(1)129-134所述)，从而使得融合多肽或其片段在体内更加可溶和稳定。抗体片段的短半衰期也可通过“聚乙二醇化”而延长，即与聚乙二醇融合(参见Leong，S.R.等(2001)《细胞因子》(Cytokine)16106-119)。在这类融合的一个例子中，如WO 0183525所述，Fc结构域与生物学活性肽融合。通过共价将Fc结构域与所选肽的至少一个氨基酸连接来生产药理学活性化合物。连接到载体会增加肽的半衰期，否则其会在体内迅速降解。
可选的，非经典的备选蛋白支架(如参见Nygren & Skerra(2004)《免疫学方法杂志》(J Immunol Methods)209(1-2)3-28或WO03049684)能用于掺入和复制本发明肽的性质，如通过将源于TREM-1CDR2或CDR3的肽序列插入到蛋白框架中以支持与在固定空间排列中的CDR2或CDR3具有结构/功能相似性的构型可变的环。
此类融合蛋白或基于框架的蛋白质可用作免疫原以产生识别本发明多肽或其片段的特异性抗体。在另一个优选实施方案中，此类融合蛋白或基于框架的蛋白质可向个体给药从而在体内抑制配体和其受体间的相互作用。这种相互作用的抑制会阻断或阻遏某些参与败血症和脓毒性休克细胞应答。
在一个方面，融合蛋白包含本发明的多肽，所述多肽在其N端与异源信号序列融合。大量信号序列可商业获得。例如，蜂毒肽和人胎盘碱性磷酸酶(Stratagene；La Jolla，CA)的分泌序列可作为真核异源信号序列获得。对于原核异源信号序列的例子，可列出phoA分泌信号(Sambrook等，同上；和《现代分子生物学方案》(Current Protocols in Molecular Biology)，1992，Ausubel等编，John Wiley & Sons)和蛋白A分泌信号(Pharmacia Biotech；Piscataway，NJ)。另一个例子是杆状病毒被膜蛋白的gp67分泌序列(《现代分子生物学方案》(CurrentProtocols in Molecular Biology)，1992，Ausubel等编，John Wiley & Sons)。
在另一个实施方案中，本发明的多肽可与标签序列融合，如六组氨酸肽，如在pQE载体中提供的标签(QIAGEN公司，9259Eton大街，Chatsworth，CA，91311)，其中许多都可由商业上获得。如Gentz等1989，《美国国家科学院进展》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86821-824所述，六组氨酸方便了融合蛋白的纯化，肽标签的其他例子是血球凝集素“HA”标签，其对应于源自流感病毒血球凝集素蛋白的表位(Wilson等，1984，《细胞》(Cell)37767)和“flag”标签(Knappik等，1994，《生物技术》(Biotechniques)17(4)754-761)。这些标签尤其适用于纯化重组产生的本发明的多肽。
融合蛋白可通过标准的重组DNA技术或通过蛋白质合成技术来制备，如使用肽合成仪。例如，编码融合蛋白的核酸分子可通过包括自动化DNA合成仪的常规技术来合成。可选的，可利用锚定引物来进行基因片段的PCR扩增，引物在两个连续基因片断间产生互补的突出端，其随后能退火并再扩增从而产生嵌合基因序列(参见如，《现代分子生物学方案》(Current Protocols in MolecularBiology)，1992，Ausubel等编，John Wiley & Sons)。编码融合蛋白的核酸序列能插入合适的表达载体中，即包含转录和翻译插入蛋白质编码序列的必要元件的载体。已知有大量宿主-载体系统和选择系统。在具体的实施方案中，融合蛋白的表达受组成型启动子的调控。在另一个实施方案中，融合蛋白的表达受诱导型启动子的调控。根据这些实施方案，启动子可以是组织特异性的启动子。包含插入编码融合蛋白的基因插入子的表达载体可通过三种常规方法鉴定(a)核酸杂交，(b)“标记”基因功能的存在或缺失，以及(c)插入序列的表达。在第一种方法中，出现在表达载体中的编码融合蛋白的基因能通过核酸杂交来检测，其中使用了包含与编码融合蛋白的插入基因同源的序列的探针。在第二种方法中，重组载体/宿主系统能根据某些“标记”基因功能(如，胸苷激酶活性、抗生素抗性、转化表型、杆状病毒中包含体的形成，等)的存在或缺失来鉴定和选择，这是由在载体中编码融合蛋白的核酸序列造成的。例如，如果将编码融合蛋白的核酸序列插入到载体的标记基因序列中，则包含编码融合蛋白的基因插入子的重组子能通过标记基因功能的缺失来鉴定。在第三种方法中，重组表达载体能通过检测重组子表达的基因产物(即，融合蛋白)来鉴定。例如，这些测试可基于体外测试系统中的融合蛋白的物理或功能性质，如与抗融合蛋白抗体结合。对于长期、高产的重组蛋白生产，优选稳定的表达。例如，可工程化稳定表达融合蛋白的细胞系。除了利用包含病毒复制起点的表达载体，可用受合适表达调节元件(如，启动子、增强子序列、转录终止子、多聚腺苷酸位点等)调节的DNA和选择标记转化宿主细胞。在引入外源DNA后，可使工程细胞在富集培养基中生长1-2天，然后转入选择性培养基。重组质粒中的选择标记赋予选择抗性，并使细胞稳定地将质粒整合入它们的染色体中，且生长形成集落，其依次可被克隆并扩展到细胞系中。该方法可有利地用于改造细胞系表达差异表达或路径基因蛋白。一旦本发明的融合蛋白通过重组表达而产生，则可通过任何本领域已知的纯化蛋白质的技术来纯化，如，通过层析(如，离子交换，亲和，尤其通过特异抗体的亲和性，和大小筛柱层析)、离心、差异溶解，或通过其他标准纯化蛋白质技术。
本发明也提供了通过给药本发明的肽或多肽来治疗患有败血症、脓毒性休克或败血症样病情的患者的方法。在另一个实施方案中，调节分子可以是模拟本发明多肽活性的抗体。尤其，本发明提供了治疗或改善个体败血症、脓毒性休克或败血症样病情的方法，其包括向所述个体给药治疗有效量的前述权利要求之任一的肽或多肽。在该方法中，给药的肽或多肽可以与序列SEQ ID NO3、4、6、7、16、17、18或19具有基本上的序列同一性，是SEQ ID NO3、4、6、7、16、17、18或19，或SEQ ID NO3、4、6、7、16、17、18或19的活性片段、类似物或衍生物，或与SEQ ID NO3、4、6、7、16、17、18或19具有至少80％的序列同一性。
在一个方面，本发明提供了通过给药本发明的肽或多肽来预防败血症、脓毒性休克或败血症样病情的方法。有败血症或脓毒性休克危险的个体可以通过本领域已知的诸如诊断或预后试验来鉴定(对于特别适合的诊断方法，参见WO 2004081233，Gibot等(2004)《国际医学年报》(Ann Intern Med.)141(1)9-15和Gibot等(2004)《新英格兰医学杂志》(N Engl J Med.)350(5)451-8。如，在本中所述的预后试剂可用于治疗处于诸如前述疾病危险的个体。本发明的方法适用于哺乳动物，如人、非人灵长类、羊、猪、牛、马、山羊、狗、猫和啮齿动物，如小鼠和大鼠。通常，本发明的方法将用于人个体。
另外，本发明提供了药物细合物，其包含本发明的多肽或模拟本发明的多肽的抗体或其片段。本发明的肽、多肽和抗体(本文中也称为“活性化合物”)可掺入适于给药的药物组合物。该组合物一般包含肽、蛋白质、或抗体和药学上可接受载体。
本文中使用的用语“药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂”旨在包括任何和所有与药物给药相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂，等等。这些介质和试剂用作药物活性物质的用途是本领域公知的。除了任何常规的不与活性化合物相容的介质和试剂范围之外，都可考虑其在组合物中应用。辅助的活性化合物也可掺进该组合物中。
本发明包括制备包含本发明肽或多肽的药物组合物的方法。该组合物可进一步包括附加的活性剂。因此，本发明进一步包括通过将本发明肽或多肽和一种或多种附加的活性剂与药学上可接受载体配伍来制备药物组合物的方法。
本发明的药物组合物配成适于其目的给药途径。给药途径的例子包括肠胃外，如静脉内、皮内、皮下、经皮(局部)、经粘膜、关节内、腹膜内和胸膜内，以及口服、吸入和直肠给药。用于肠胃外、皮内、或皮下应用的溶液或悬液可包括以下成分无菌稀释剂，如注射用水、盐溶液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成容剂；抗细菌剂，如苯甲醇或甲基对羟基苯甲酸酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲液，如醋酸、柠檬酸或磷酸盐以及调节渗透压的试剂，如氯化钠或葡萄糖。可用酸或碱调节pH，如盐酸或氢氧化钠。肠胃外制剂可封装在安瓿、一次性注射器或玻璃或塑料制的多剂量瓶中。
适于注射的药物组合物包括无菌水溶液(水溶性情况下)或分散剂和用于临时制备无菌注射液或分散剂的无菌粉末。对于静脉内给药，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF；Parsippany，NJ)或磷酸缓冲盐液(PBS)。在所有的情况下，组合物必须是无菌的，其其流动性程度应为方便用注射器注射。在制备和储存的条件下必须是稳定的，并必须保存防止诸如细菌和真菌的微生物的污染。载体可以是溶剂或分散介质，比如其包含水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)及其合适的混合物。例如，可通过使用诸如卵磷脂的包衣、在分散剂的情况下通过保持所需的粒径、以及通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。通过大量抗细菌和抗真菌剂可实现防止微生物作用，如用对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等。在许多情况下，组合物中优选纳入等渗剂，如糖、诸如甘露醇、山梨醇的多元醇、氯化钠。可在组合物中纳入诸如单硬脂酸铝和明胶的延缓吸收的试剂，以此延迟注射组合物的吸收。
无菌注射液可通过将所需量的活性化合物(如多肽或抗体)掺入到合适的溶剂中来制备，所述溶剂视需要具有以上列举的成份之一或其组合，接着进行过滤灭菌。通常分散剂通过将活性化合物掺入到无菌载体中来制备，所述载休包含基本的分散介质和以上列举的其他所需成份。在用于制备无菌注射液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法为真空干燥和冷冻干燥，这产生活性成分加上其前面无菌过滤液中任何所需的附加成分的粉末。
口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用载体。它们可封装于明胶胶囊中或压成片剂。对于口服治疗性给药的目的，活性化合物可与赋形剂合并，制成片剂、锭剂或胶囊的形式。可包括药学上相容的粘结剂和/或佐剂材料以作为组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可包含任何以下成分或相似性质的化合物粘结剂，如微晶体纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂，如淀粉或乳糖；崩解剂，如褐藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂，如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂，如二氧化硅胶；增甜剂，如蔗糖或糖精；或风味剂，如薄荷、水杨酸甲酯、或橙味香料。
对于吸入给药，化合物以气雾喷剂的形式从压力容器或分配器或喷雾器中递送出来，所述压力容器或分配器含有合适的推进剂，如诸如二氧化碳的气体。
也可通过经粘粘膜或经皮方式全身给药。对于经粘膜或经皮给药，在制剂中使用了适于穿透屏障的渗透剂。这样的渗透剂通常是本领域已知的，并包括诸如用于经皮给药的去污剂、胆汁盐和梭链孢酸衍生物。可通过使用鼻喷剂或栓剂实现经粘膜给药。对于经皮给药，将活性化合物配制到本领域公知的油膏、药膏、胶或乳油中。化合物也可制成栓剂的形式(如，用常规栓剂基质，如可可油和其他甘油酯)或用于直肠递送的留置灌肠剂。
在一个实施方案中，活性化合物用载体制造，所述载体会使化合物抵抗体内的迅速降解，如控释制剂，包括植入和微胶囊递送系统。可食用、生物降解、生物相容的多聚物，如醋酸乙烯、聚酸酐、聚羟基乙酸、胶原质、聚原酸酯和聚乳酸。制备这些制剂的方法对所属领域技术人员来说是显而易见的。原料也可由商业途径从Alza公司和Nova制药公司获得。脂质体悬液(包括带有针对病毒抗原的单抗、靶向感染细胞的脂质体)也可用作药学上可接受的载体。可根据所属领域技术人员已知的方法来制备这些材料，如美国专利No.4,522,811所述。
将口服或肠胃外组合物配制成剂量单位形式以方便给药和剂量统一是特别有利的。文中所用的剂量单位形式指物理上离散的单位，其适于作为待治疗个体的单位剂量；每个单位包含预定量的活性化合物和所需的药物载体，所述活性化合物经计算能产生期望的治疗效果。本发明剂量单位形式的规格是由活性化合物的特性和欲达的特定治疗效果、以及本领域配伍该活性化合物治疗个体中所固有的局限性决定的且直接取决于此。
如本文所定义的，治疗有效量的蛋白质或多肽(即，有效剂量)约为0.001至30mg/kg体重，优选约0.01至25mg/kg体重，更优选约0.1至20mg/kg体重，并且甚至更优选约1至10mg/kg、2至9mg/kg、3至8mg/kg、4至7mg/kg或5至6mg/kg体重。
对于抗体，优选剂量是0.1mg/kg至100mg/kg体重(通常10mg/kg至20mg/kg)。如果抗体作用于大脑，通常适合的剂量是50mg/kg至100mg/kg。通常，部分人抗体和完全人抗体在人体内比其他抗体有更长的半衰期。由此，通常可能使用较低的剂量和较低的给药频率。诸如脂化的修饰可用于稳定抗体并增强摄取和组织渗透(如透入大脑)。脂化抗体的方法由Cruikshank等，1997，《过继性免疫缺陷综合症和人类逆转录病毒学杂志》(J.Acquired Immune DeficiencySyndromes and Human Retrovirology)14193)所述。
药物组合物可以和给药说明一起装在容器、包裹或分配器中。
本发明进一步提供了一种试剂盒，其包含本发明的肽或多肽或模拟本发明多肽的抗体或其片段，优选和使用说明一起例如用于治疗败血症、脓毒性休克或败血症样病情。
本发明提供了鉴定(或筛选)调节分子即候选或测试化合物或试剂(如，肽、拟肽、小分子或其他药物)的方法，它们模拟本发明的多肽或具有刺激或抑制例如本发明多肽活性的效果。尤其，本发明提供了一种筛选治疗败血症、脓毒性休克或败血症样病情的化合物或组合物的方法，其包括提供TREM-1肽；在盲肠结扎穿孔模型(或使用文中描述的或本领域已知的其他试验或模型)中使动物与TREM-1肽接触；确定是否存在对败血症的调节作用，例如其中存活率的增加显示出TREM-1肽可用于治疗败血症、脓毒性休克或败血症样病情。
本发明进一步和上述筛选试验鉴定的新试剂及其用于文中所述治疗的用途有关。
特此将本说明书引用的所有公开文献，包括但不限于专利和专利申请，都纳入本文作为参考，就如同每一篇公开文献从一开始就各自明确且分别地纳入本文最为参考一样。
本发明每一方面的优选特征可作必要的修证而相互适用。
本发明现在将参照以下非限制性的实施例、参照附图而描述，其中


图1A显示TREM-1和TREM-2家族成员的序列比对。用1.74版CLUSTALW将人TREM-1与小鼠TREM-1以及人和小鼠TREM-2进行了比对。二级结构分配与公开的人TREM-1结构相符(箭头指β折叠，圆柱体指α螺旋)(Radaev等(2003)Structure(Camb).12月；11(12)1527-35)。参与同型-杂二聚体形成的残基如黑色背景中的白色所示。形成V型Ig折叠保守的二硫键的半胱氨酸如粗体所示。空位用(-)，相同的残基用(*)，相似的用(或.)表示。人和小鼠TREM1序列间相似的扩展区如灰背景上的盒所示。本文实施例中使用的TREM-1肽序列以下划线表示。
图1B显示了公开的TREM-1同型二聚体结构的带状图(Kelker等(2004)《分子生物学杂志》(J Mol Biol.)9月24日；342(4)1237-48)。推测的包含抗体等价互补决定区(CDR)的结合位点以红色显示。
图2显示了在LPS前1小时给药TREM-1肽减少了内毒素血症诱导的死亡。用200μg LPS腹膜内注射BALB/c小鼠(每组10只)。在LPS前1小时腹膜内注射TREM-1肽P1、P2、P3或P5(每只小鼠200μl 300μM溶液)。每天两次监测小鼠的生存能力，进行7天。用Logrank测验进行统计学分析。对照小鼠的数据代表在相同条件下进行的两个独立实验的累积存活曲线。
图3显示在LPS后4小时注射TREM-1肽P1能有效减少内毒素血症诱导的死亡。用200μg LPS腹膜内注射BALB/c小鼠(每组10只)。在LPS前1小时或后4小时腹膜内注射TREM-1肽P1，每只小鼠200μl 300μM溶液。每天两次监测小鼠的生存能力，进行7天。用Logrank测验进行统计学分析。对照小鼠的数据代表在相同条件下进行的两个独立实验的累积存活曲线。
图4显示了在LPS后4小时给药TREM-1肽减少了内毒素血症诱导的死亡。用200μg LPS腹膜内注射BALB/c小鼠(每组10只)。在LPS后4小时腹膜内注射P1肽，每只小鼠200μl 150、300和600μM溶液(点)，或注射P3，每只小鼠200μl 600μM溶液(实心方块)。每天两次监测小鼠的生存能力，进行7天。用Logrank测验进行统计学分析。
图5显示了TREM-1肽P1防御盲肠结扎穿孔(CLP)。如材料和方法所述，在C57BL/6小鼠(每组15只)中诱导CLP。在CLP诱导后5和24小时腹膜内注射P1肽(空心点)或P3肽(实心方块)(每只小鼠200μl 600μM溶液)。每天两次监测小鼠的生存能力，进行10天。用Logrank测验进行统计学分析。
图6显示了P1、P2和P5肽能抑制可溶性TREM-1/IgG1与TREM-1配体阳性的腹膜渗出细胞的结合，而P3肽不能。在存在每只小鼠500μM溶液(细线)、每只小鼠100μM溶液(点线)或不存在肽(粗线)的情况下，显示了用2μg/ml小鼠TREM-1/hIgG进行的腹膜渗出细胞的细胞荧光分析。灰色柱状图代表用人IgG1作对照的免疫印迹。
图7A显示了有和没有蛋白酶抑制剂的情况下用LPS刺激后从培养的单核细胞中释放的sTREM-1。LPS刺激诱导出现了27-kD蛋白质，其为抗TREM-1mAb(插图)所特异性识别。条件培养基中的sTREM-1由免疫斑点反射率来衡量。数据显示为平均值±SD(n＝3)。
图7B显示了单核细胞中TREM-1mRNA的表达。如图所示，用LPS(1μg/mL)刺激培养的单核细胞0、1和16小时。LPS在1小时内诱导产生TREM-1mRNA。
图8A显示了培养的单核细胞中释放的细胞因子和sTREM-1。对于细胞活化，在LPS(1μg/mL)存在的情况下，在24孔平底组织培养板中培养初级单核细胞。在一些实验中，刺激物和P5(10至100ng/mL)、对照肽(10至100ng/mL)或rIL-10(500U/mL)一起使用。如图所示，为通过TREM-1活化单核细胞，加入了激动剂抗TREM-1mAb(10μg/mL)。通过ELISA或免疫斑点来分析无细胞的上清液中TNF-α、IL-1β和sTREM-1的产生。所有实验进行三次，数据用平均值(SEM)表示。
a培养基bP510ng/mLc抗TREM-1dLPSeLPS+抗TREM-1fLPS+P510ng/mL
gLPS+P550ng/mLhLPS+P5100ng/mLiLPS+IL 10图8B显示了P5对NFκB活化的影响。如图所示，在大肠杆菌LPS(O111B4，1μg/mL)、抗TREM-1mAb(10μg/mL)和/或P5(100ng/mL)存在的情况下，培养单核细胞24小时，用利用ELISA试验确定NFκB p50和p65的水平。实验进行三次，数据用光密度平均值(SEM)表示。
图9显示了LPS处理的小鼠血清中sTREM-1的积累。用LPS(LD50，腹膜内)处理雄性Balb/C小鼠(20至23g)。通过免疫斑点测试血清的sTREM-1。血清sTREM-1在LPS给药后1小时可容易地检测，其在4至6小时间保持在平台水平。
图10A显示了P5预处理能防御小鼠的LPS致命性。随机分组(每组10只小鼠)雄性Balb/C小鼠(20至23g)并用LD100的LPS处理。P5(50μg或100μg)或对照载体在LPS前60分钟给药。
图10B显示了P5的延迟给药能防止小鼠中的LPS致命性。随机分组(每组8只小鼠)雄性Balb/C小鼠(20至23g)并用LD100的LPS处理。P5(75μg)或对照载体在LPS后4或6小时给药。
图10C显示了TREM-1mAb激动剂的给药对小鼠是致命的。如图所示，随机分组(每组8只小鼠)雄性Balb/C小鼠(20至23g)并用LD50的LPS+对照载体、LD50的LPS+抗TREM-1mAb(5μg)或LD100的LPS+对照载体组合处理。对照载体和抗TREM-1mAb在LPS注射后1小时给药。
图11A显示了P5部分地防止小鼠CLP诱导的致死。随机分组雄性Balb/C小鼠(20至23g)并用生理盐水(n＝14)或对照肽(n＝14，100μg)或用P5(100μg)在H0(n＝18)、H+4(n＝18)或H+24(n＝18)时单次注射处理。最后一组小鼠(n＝18)用P5(100μg)在H+4、H+8和H+24时重复注射处理。
图11B显示了P5对存活的剂量效应。CLP后，小鼠(每组n＝15)用生理盐水或10μg、20μg、50μg、100μg或200μg的P5在H0时单次注射处理并监测存活情况。
图12显示了P5在CLP期间对细菌数没有影响。CLP后24小时麻醉杀死小鼠(每组5只)。确定腹膜灌洗液和血中的细菌数，结果用每mL血的CFU或每只小鼠腹膜灌洗液的CFU表示。
图13显示了大鼠给药LPS(15mg/kg)后TNF-α和IL-1β血浆浓度的发展。
*p＜0.05P5处理的vs对照动物§p＜0.05P5处理的vs P1处理的动物图14显示了大鼠给药LPS(15mg/kg)后亚硝酸盐/硝酸盐浓度的发展。*p＜0.05P5处理的vs对照动物和P1处理的动物图15显示了大鼠在盲肠结扎穿孔诱导的腹膜炎期间的平均动脉压的发展。
*p＜0.05vs对照动物图16显示了大鼠在盲肠结扎穿孔诱导的腹膜炎期间的TNF-α血浆浓度的发展。
*p＜0.05P5处理的vs对照动物§p＜0.05P1处理的vs对照动物$p＜0.05P5vs P1处理的动物图17显示了大鼠在盲肠结扎穿孔诱导的腹膜炎期间的亚硝酸盐/硝酸盐浓度的发展。
*p＜0.05P5和P1处理的vs对照动物实施例1TREM-1肽防止小鼠死于脓毒性休克TREM-1肽按照以下标准合成i)在人和小鼠TREM-1间有最高的同源性而与TREM-2有最低同源性。ii)肽跨越TREM-1的互补决定区(CDR)。根据公开的TREM-1的晶体结构，与抗体类似，这些残基可能参与同源配体识别(Radaev等2003Structure(Camb.)12月11(12)1527-35&Kelker等(2004)《分子生物学杂志》(J Mol Biol.)9月24日；342(4)1237-48)(参见图1)。在CDR2区中设计一个肽(P1)，而在CDR3区中设计三个肽(P2、P3和P5)。在连接V型免疫球蛋白(Ig)样结构域(Ig-V)与跨膜结构域的颈状区中设计第四个肽(P3)。由于CDR1区TREM-1和TREM-2间的高序列同源性，没有在此区设计肽。
因此，如下TREM-1蛋白的肽由洛桑大学生物化学研究所的蛋白质和肽化学研究室定购、合成并纯化P1(CDR267-89) LVVTQRPFTRPSEVHMGKFTLKH [SEQ ID NO3]P2(CDR3114-136) VIYHPPNDPVVLFHPVRLVVTKG [SEQ ID NO4]P3(颈状区168-184) TTTRSLPKPTAVVSSPG[SEQ ID NO5]P4(CDR3103-123) LQVTDSGLYRCVIYHPPNDPV[SEQ ID NO6]P5(CDR3103-119) LQVTDSGLYRCVIYHPP[SEQ ID NO7]P1sc*(P1杂乱序列) LTPKHGQRSTHVTKFRVFEPVML [SEQ ID NO8]P5sc*(P5杂乱序列) TDSRCVIGLYHPPLQVY [SEQ ID NO9]*这是对照肽，事实上并不起保护作用在该实施例的实验中，以200μl体积的所示摩尔量的溶液给药所述肽。为了评估TREM-1肽防止小鼠LPS诱导的内毒素血症的能力，在使用致死剂量的脂多糖(LPS)前1小时，本发明人给药了肽P1、P2、P3和P5(300μM)(图2)。随时监测致死率并与只接受载体对照注射的动物做比较。P5注射赋予了最大的保护，相对于对照小鼠的10％，有90％的动物在LPS注射后7天仍活着(p＜0.0001)。相对于对照小鼠的10％，60％P1处理的小鼠和50％P2处理的小鼠在内毒素血症中活了下来(分别为p＜0.01和p＜0.05)。有趣的是，所有P3处理的小鼠在LPS注射后4天内都死了。这些结果显示含有对应于推测的配体结合位点(CDR2和CDR3)的TREM-1胞外部分序列的肽能防止小鼠死于休克。
为了研究TREM-1肽治疗是否能推迟到给药LPS后，本发明人在LPS注射后4小时注射了肽。仅仅在P1的情况下，这种延迟治疗赋予了显著的抗致死剂量LPS的保护作用(图3)。相对于在LPS前1小时处理的60％的小鼠和只用载体处理的10％的小鼠，在LPS后4小时有80％的注射了P1的小鼠在内毒素血症中活了下来(分别为p＜0.001和p＜0.01)。因此，P1即使在内毒素血症爆发后注射也是有效的。过了一周没有再发生死亡，这显示P1不仅仅延缓了LPS致死的发生，而且提供了持久的保护作用。相对于对照小鼠的20％，以600μM给药时，P1给药赋予了最大的保护作用(80％)(p＜0.01)，而在300μM时则保护水平降到了50％(p＜0.05)并在150μM时进一步降到了30％，这显示P1的剂量依赖性效应(图4)。然后本发明人研究了P1是否在“CLP”模型(盲肠结扎穿孔被广泛用作败血症的实验模型)中防止脓毒性休克。相对于对照处理的小鼠，在CLP后5和24小时用2剂量的P1处理的小鼠免于死亡(p＝0.0791)，尽管所述差异不具有统计学意义。相对于用P3肽处理小鼠的5％，在CLP后5天用P1注射的小鼠有40％仍旧活着。在CLP后10天，所处理的小鼠仍旧活着，这显示P1不仅仅延缓了死亡，而且提供了持久的保护作用(图5)。
实施例2TREM-1肽P1抑制了可溶性小鼠TREM-1/IgG与TREM-1配体阳性细胞的结合在CLP中测试的TREM-1衍生肽中，肽P1、P2和P5证实有保护活性。该作用的可能机理可能是TREM-1衍生肽干扰TREM-1/TREM-1配体相互作用的能力。为了澄清该问题，本发明人对TREM-1配体阳性细胞来自CLP处理的小鼠的PEC(腹膜渗出细胞)进行了竞争性试验。
来自患有盲肠结扎穿孔(CLP)所诱导的腹膜炎的小鼠的腹膜渗出细胞(PEC)在与PE缀合的抗人IgG1(Jackson Immunoresearch，Bar Harbor，美国)一起孵育后进行流式细胞仪分析。在加入mTREM-1-IgG1之前，通过将细胞与所示浓度的肽在冰上一起预孵育45分钟，由此进行与TREM-1肽的竞争。
如图6所示，衍生自mTREM-1的CDR2区的P1肽和跨越CDR3区的P2和P5肽以剂量依赖性的方式抑制了TREM-1与其配体的相互作用。相反，衍生自连接IgG样部分和跨膜结构域的TREM-1的颈状区的P3肽，却是无效的。
实施例3其他有关TREM-1肽P5调节鼠败血症中炎症反应的研究方法从外周血中制备单核细胞从5位实验室员工的健康志愿供者中收集10ml外周血样品于EDTA-K上。用RPMI(LifeTechnologies，Grand Island，NY)v/v稀释后，于室温以水溶性聚蔗糖(Ficoll)(Amershan Phamacia，Uppsala，瑞典)梯度离心血30分钟从而分离PBMC。洗涤梯度上获得的细胞并计数。然后为了去除淋巴细胞悬液，将浓度为5×106/ml的细胞涂布于24孔平底细胞培养板(Corning，Corning，NY)中，使之在37℃贴壁2小时。弃去所得的淋巴细胞悬液，并于37℃在5％CO2温箱中，将贴壁的单核细胞保持在添加了10％FCS(Invitrogen，Cergy，法国)的完全培养基(RPMI 1640，0.1mM丙酮酸钠，2mM青霉素，50μg/ml链霉素；LifeTechnologies)中。
TREM-1肽利用Gen-Bank中登录号#AF287008的人TREM-1序列和#AF241219的小鼠TREM-1序列，将肽“P5”(LQVTDSGLYRCVIYHPP；[SEQ ID NO7]；化学合成为C末端酰胺化的肽(Pepscan System，Lelystad，荷兰)。以大于99％的产率获得正确的肽，如用质谱和解析反相高效液相色谱所确证的那样，测得的质量为1961Da，而计算的质量为1962Da，经制备纯化后是均质的。肽“P5sc”包含与P5相同的氨基酸但次序不同(TDSRCVIGLYHPPLQVY；[SEQ IDNO9])，相似地合成它并用作“对照肽”。
体外刺激单核细胞对于活化，在存在大肠杆菌LPS(O111B4，1μg/ml，Sigma-Aldrich，LaVerpillière，法国)的情况下培养单核细胞。通过锥虫蓝排除法并通过测量乳酸脱氢酶的释放来评估细胞的存活能力。在一些实验中，刺激物与TNF-α(5至100ng/ml，R & D System，里尔，法国)、IL-1β(5至100ng/ml，R & D System)、rIFN-γ(高达100U/ml，R & D System)、rIL-10(500U/ml，R & D System)或高达100ng/ml的P5和对照肽联合施用。
为了通过TREM-1活化单核细胞，如下加入抗TREM-1激动剂单克隆抗体(R & D System)预先用每孔10μg/ml抗TREM-1包被平底板。在用磷酸缓冲盐液(PBS)彻底洗涤后，以上述相似的浓度加入单核细胞悬液。一些实验在存在蛋白酶抑制剂(PMSF和蛋白酶混合物抑制剂；Invitrogen)的情况下进行。根据生产商(BD Biosciences，San Diego，美国)的推荐通过ELISA测试无细胞的上清液的TNF-α和IL-1β的产量。为了测定P5对单核细胞中NF-κB活性的作用，进行基于ELISA的试验(BD MercuryTM Transfactor试剂盒，BDBiosciences)。在存在大肠杆菌LPS(O111B4，1μg/ml)和/或激动剂抗TREM-1单克隆抗体(10μg/ml)和/或P5(100ng/mL)的情况下培养单核细胞24小时。然后制备全细胞提取物，按照生产商的推荐确定NF-κB p50和p65的水平。所有实验进行三次，数据以平均值(SEM)表示。
sTREM-1释放的鉴定和定量如上文所述培养初级单核细胞悬液。在37℃用大肠杆菌LPS(O111B4，1μg/ml)处理细胞24小时。对细胞条件化的培养基利用抗TREM-1单克隆抗体(R & D System)进行Western印迹从而证实抗TREM-1识别的27kDa物质的存在。如别处所报道的(18)，用反射扫描仪和Quantity One Quantitation软件(Bio-Rad，Cergy，法国)，通过评估免疫斑点上条带的光强度来测量可溶性TREM-1水平。通过将样品的光密度与纯化的TREM-1产生的标准参考曲线作比较，来确定每个样品中的可溶性TREM-1的浓度。所有测量进行三次。该技术的灵敏度可以检测低至5pg/mL的sTREM-1水平。
TREM-1RT-PCR从存在LPS的情况下培养的初级单核细胞中用TRIzol试剂(Invitrogen)来提取总mRNA，并用Superscript RT II(Invitrogen)进行反转录从而产生cDNA。然后，所有反应所使用的RT-PCR条件是94℃、30s/65℃、30s/68℃、1分钟，进行30个循环。用2.5mM MgCl2，0.2mM dNTP，2.0U Taq聚合酶和20pM5’和3’寡核苷酸引物(Proligos，巴黎，法国)来进行扩增。
所用的5’和3’引物对序列如下对于TREM-1(17)TTGTCTCAGAACTCCGAGCTGC；[SEQ ID NO10]和
GAGACATCGGCAGTTGACTTGG；[SEQ ID NO11]对于TREM-1sv(19)GGACGGAGAGATGCCCAAGACC；[SEQ ID NO12]和ACCAGCCAGGAGAATGACAATG；[SEQ ID NO13]对于β-肌动蛋白(用作持家扩增子)GGACGACATGGAGAAGATCTGG；[SEQ ID NO14]和ATAGTAATGTCACGCACGArrTCC；[SEQ ID NO15]PCR产物跑琼脂糖凝胶并用溴化乙锭染色使之可见。
小鼠中的LPS诱导的内毒素血症在地方伦理委员会批准后，随机分组雄性Balb/C小鼠(20至23g)，并在LPS刺激前后，用大肠杆菌LPS与P5(溶于500μl生理盐水)或对照载体进行腹膜内(i.p.)联合给药。在一些实验中，LPS注射后1小时i.p.给药5μg抗TREM-1单克隆抗体。每小时检查小鼠的生存能力，或以有规律的间隔处死动物。通过心脏穿刺收集血清样品并通过ELISA(BD Biosciences)检测TNF-α和IL-1β，通过免疫斑点检测sTREM-1水平。
CLP多微生物败血症模型通过i.p.给药溶于0.2mL无菌无热原盐水的氯胺酮和甲苯噻嗪来麻醉雄性Balb/C小鼠(7至9周龄，20至23g)。通过1.0cm腹部中线切开术来暴露出盲肠，结扎末梢的一半，接着用G21针两次穿刺。穿刺排出少量粪便以保证开放性。将盲肠重置入腹腔内并在两层间封闭腹部切口。手术后，用0.5ml生理盐水溶液s.c.注射所有小鼠使体液复苏，并每12h用1.25mg(即50μg/g)丙咪嗪s.c.注射。随机分组动物并用生理盐水(n＝14)、对照肽(n＝14，100μg)或P5(100μg)在H0(n＝18)、H+4(n＝18)或H+24(n＝18)时单次注射处理。最后一组小鼠(n＝18)用P5(100μg)在H+4、H+8和H+24时重复注射处理。所有的处理液都用500μl生理盐水稀释并进行i.p.给药。本发明人接着尝试确定各种剂量的P5的效果。为此目的，CLP后，小鼠(每组n＝15)用生理盐水或10μg、20μg、50μg、100μg或200μg P5在H0时单次注射处理，并监测存活情况。CLP后24小时再麻醉处死每组5只动物以确定细菌数和细胞因子水平。用2mL RPMI1640(Life Technologies)获得腹膜灌洗液，并通过心脏穿刺来收集血液。血清中TNF-α和IL-1β浓度用ELISA(BD Biosciences)来确定。为了评估细菌数，将血和腹膜灌洗液以系列对数稀释度涂布于补充有5％羊血的大豆胰蛋白酶液的琼脂板上。涂板后，将大豆胰蛋白酶液的琼脂板在37℃需氧孵育24小时，并无氧进行48小时。结果用每mL血的CFU或每只小鼠腹膜灌洗液的CFU来表示。
统计学分析血清sTREM-1和细胞因子水平用平均值(±SD)来表示。P5的抗LPS致死的保护作用利用Log-Rank测验通过比较存活曲线来测定。用Statview软件(Abacus Concepts，伯克利，CA)来完成统计学分析，双尾P＜0.05被认为是显著的。
结果用大肠杆菌LPS刺激后，可溶性形式的TREM-1从培养的人单核细胞中释放出来为了鉴定体外sTREM-1的潜在释放，本发明人用LPS刺激人单核细胞并用SDS-PAGE分析条件培养基。LPS刺激以时间依赖性的方式诱导了27-kDa蛋白质的出现(图7A)。Western印迹分析揭示该蛋白质由直接针对TREM-1胞外结构域的单克隆抗体所特异性识别(图7A)。诱导条件培养基中sTREM-1出现的LPS的浓度不对细胞生存能力产生影响，这显示TREM-1的释放不是由于细胞死亡而造成的。类似的，用蛋白酶抑制剂处理单核细胞不影响TREM-1释放(图7A)。TREM-1mRNA水平由于LPS处理而增加了(图7B)，而TREM-1sv mRNA水平仍旧未检测到。这暗示TREM-1释放很可能与基因增加转录有关而与TREM-1sv表达无关。用TNF-α(5至100ng/mL)或IL-1β(5至100ng/mL)刺激单核细胞16小时以细胞因子剂量依赖性的方式诱导出非常少的TREM-1释放。即使在高达100U/mL浓度时，用IFN-γ刺激也不诱导TREM-1释放。
P5减弱了与LPS相关的前炎性细胞因子的释放在用LPS培养的单核细胞上清液中观察到了显著的TNF-α和IL-1β的产生。相对于单独用mAb或LPS培养的，用TREM-1mAb和LPS两者培养的细胞的TNF-α和IL-1β的产量甚至更高(图8A)。若培养基补充了P5或IL-10的话，则LPS刺激后前炎性细胞因子的诱导释放显著更低。P5以浓度依赖性的方式，减少了用LPS或用LPS和mAb培养的细胞中产生的TNF-α和IL-1β，并同时增加了用LPS培养的细胞中sTREM-1的释放。对照肽显示出对细胞因子或sTREM-1的释放没有作用(未显示数据)。令人惊讶的，与之相反，IL-10完全抑制TREM-1和炎性细胞因子的释放(图8A)。LPS和TREM-1mAb都诱导了强烈活化的单细胞NF-κB p50和p65，而且联合给药LPS和TREM-1mAb产生了协同效应。P5抑制了由TREM-1结合诱导的NF-κB的活化但并不改变LPS的效果(图8B)。
LPS处理的小鼠的血清sTREM-1水平增加了为了确定在小鼠内毒素血症期间sTREM-1是否是全身性释放，本发明人测量了LPS给药后的血清sTREM-1水平。在给药LD50剂量的LPS后1小时就可容易地检测到血清sTREM-1，而且其在LPS处理后4至6小时保持在峰值平台水平(图9)。
TREM-1肽“P5”防止内毒素血症小鼠死亡在致死剂量(LD100)的LPS前用单剂量P5处理60分钟的小鼠以剂量依赖性的方式而免于死亡(图10A)。为了研究P5处理是否能延迟至LPS给药后，本发明人在LPS注射后4或6小时开始注射P5。这种延迟长达4小时的处理带来了显著抗LD100剂量的LPS的保护作用(图10B)。一周后再没有死亡发生，这显示P5不仅仅延迟了LPS致死的发作，而是提供了持久的保护。对照小鼠全都在死亡前出现了嗜睡、竖毛和腹泻。相反，P5处理的小鼠仍旧很整洁和活跃，没有腹泻，并活着。为了阐明P5防止小鼠死于LPS的机理，本发明人测定了在2和4小时时处毒素血症小鼠的TNF-α、IL-1β和sTREM-1的血清水平。如表4所示，相对于对照，用100μg P5预处理能减少细胞因子水平30％并增加sTREM-1水平2倍表4.内毒素血症小鼠的TNF-α、IL-1β和sTREM-1的血清浓度

TREM-1的结合对小鼠是致死的为进一步突出TREM-1结合在LPS介导的死亡中的作用，用激动剂抗TREM-1mAb与LD50剂量的LPS联合给药来处理小鼠。这诱导了死亡率从50％显著增加到了100％(图10C)。
P5防止小鼠的CLP诱导的死亡为了研究P5在更相关的脓毒性休克模型中的作用，本发明人进行了CLP实验(图11A)。对照组包含用生理盐水或用对照肽注射的小鼠。在该多微生物败血症模型中，即使在迟于败血症发生后24小时才给药，P5仍旧赋予了显著的抗致死的保护作用。有趣的是，P5重复注射具有对存活更有利的效果(P＜0.01)。P5对存活(图11b)和细胞因子的产生(表5)存在剂量应答效应。P5对清除细菌无效(图12)。
表5.CLP后24小时处的TNF-α、IL-1β和sTREM-1的血清浓度

败血症显示出复杂的临床综合症，这是由对严重感染的有害或破坏性的宿主应答而造成的。当最初合适的对全身感染的宿主应答变得扩大时，形成败血症，然后失调(4，5)。例如，暴露于LPS的嗜中性粒细胞和单核细胞/巨噬细胞被活化了，并释放出诸如TNF-α和IL-1β的前炎性细胞因子。普遍认为，这些细胞因子的过量产生促成了在败血症患者中所见到的多器官衰竭(20-23)。
TREM-1是最近鉴定的分子，其参与单核细胞活化和炎症应答(12，14)。其属于与NK细胞受体相关的家族，活化下游信号转导事件。TREM-1在PNN和单核细胞/巨噬细胞上的表达已证明是由LPS所诱导的(16，17)。
如本文所述，本发明人证实了在用大肠杆菌LPS刺激后，可溶形式的TREM-1从培养的人单核细胞中释放出来。早在LPS刺激后1小时，该可溶形式就也可在内毒素血症小鼠的血清中检测到。这与TREM-1对感染的先天应答的极早阶段的牵连是一致的(14，15，24)。sTREM-1释放的机制虽没有被清楚地阐释，但似乎与TREM-1基因增加的转录有关。然而，尽管和蛋白酶抑制剂混合物一起孵育不改变sTREM-1的释放，但是不能完全排除来自膜的表面TREM-1的裂解。有趣的是，除非加入LPS用作共刺激物，用诸如TNF-α、IL-1β或IFN-γ的前炎性细胞因子刺激人单核细胞只诱导非常少的sTREM-1释放。在单核细胞中检测到了备选的mRNA TREM-1剪接变体(TREM-1sv)的表达，其可能经由牛分支杆菌BCG细胞壁片段而非LPS(25)的刺激而翻译成可溶性受体(18)。这被本研究所证实i)LPS不增加单核细胞中的mRNA TREM-1sv水平，而且ii)由于LPS刺激，单核细胞仅仅释放27-kDa蛋白质，而非17.5-kDa变体。
尽管还没鉴定到其天然配体(13，14)，在单核细胞上TREM-1和激动剂单克隆抗体的结合导致了进一步增强前炎性细胞因子的产生，而P5以浓度依赖性的方式诱导这些合成的减少，而IL-10则完全抑制它。
炎性细胞因子，尤其是TNF-α，被认为是有害的，然而如带有受损TNF-α应答的动物中的致命腹膜炎问题所证明的那样(9-11)，它们在败血症中也起有益的效果(5)。另外，在临床试验中，抑制TNF-α增加了死亡率(8)。最终，由于发现败血症是用TNF-α拮抗剂治疗的类风湿性关节炎患者中常见的并发症，由此突出了TNF-α清除感染的作用(26)。
P5调节细胞因子产生的机制还不清楚。P5包含互补决定区(CDR)-3和TREM-1胞外结构域的‘F’β链。后者含有介导二聚化的酪氨酸残基。Radaev等推测TREM-1用其CDR等价环区域捕获其配体(27)。P5因此可能损害TREM-1的二聚化和/或同TREM-1的天然配体竞争。而且，增加由P5介导的单核细胞释放的sTREM-1，能阻止膜TREM-1的结合，sTREM-1作为诱骗受体起作用，如在TNF-α系统中那样(28，29)。
在暴露于细菌刺激物如LPS后，转录因子NF-κB的活化是产生单核细胞炎性细胞因子中的关键步骤(30，31)。在各种NF-κB/Rel二聚体中，p65/p50杂二聚体是在单核细胞LPS诱导的NF-κB的原型形式(32)。P5阻止由TREM-1结合所诱导的p65/p50NF-κB的过度激活。这至少部分解释了P5对产生细胞因子产生和在此所示的防止死亡的效果发生在LPS诱导的脓毒性休克前1小时或甚至长达4小时后才注射肽的时候。
内毒素血症能用实验简单地实现，但并不完美地适合再现人败血症的情况，而CLP诱导的多微生物败血症更为复杂但却是更好的模型，其中包括了体液复苏和抗生素的使用。因此后者也在本研究中使用，并证实了P5提供的剂量依赖性的保护作用，即使在迟至败血症发作后24小时给药的时候。可是P5的有利效果与增加的细菌清除作用无关。
应用免疫调节疗法的一个难点是不可能预测败血症的进展，因此接受这种治疗的患者通常已经得了完全确认的败血症(6)。由于P5显示出即使在败血症爆发后注射也有效，因此其可构成现实的治疗手段(24，33)。
相反，激动剂抗TREM-1单克隆抗体对TREM-1的结合会在LPS刺激的小鼠中介导出显著增加的死亡率这进一步强调了在脓毒性休克期间TREM-1结合的有害效果。
实验性脓毒性休克仅仅部分再现了人败血症。事实上，我们组最近揭示在败血症患者中的极病重患者的血清中释放了显著水平的sTREM-1(34)，在存活的患者中观察到了最高的水平。这与我们的实验发现一致，这显示sTREM-1释放越重大，结果就越有利，因此至少在理论上支持了可溶性TREM-1肽作为败血症发作后疗法的潜在价值。
TREM-1似乎是在感染触发的即刻免疫应答中的关键分子。在感染的早期阶段，由于微生物产物对模式识别受体的结合，使得嗜中性粒细胞和单核细胞引发了炎症反应(3，4)。同时，细菌产物诱导了sTREM-1的上调和释放。未知配体一经识别，TREM-1就激活扩大这些炎症反应的信号转导路径，在单核细胞/巨噬细胞中尤为如此。尽管没有完全抑制，但是TREM-1信号转导的调节减少了细胞因子的产生并防止败血症动物高反应性和死亡。用诸如P5的肽调节TREM-1的结合可能是治疗败血症的合适的治疗工具，尤其因为其甚至在感染侵入后的败血症发作之后还似乎是有活性的。
实施例4用P1和P5处理的经LPS处理败血症大鼠中的血液动力学研究在进一步的脓毒性休克模型中，在大鼠中进行LPS和CLP(盲肠结扎穿孔)实验来研究TREM-1肽的作用。
材料和方法
LPS诱导的内毒素血症随机分组(n＝10-20)动物并用大肠杆菌LPS(O111B4，Sigma-Aldrich，里昂，法国)与TREM-1或杂乱的肽联合i.p.处理。
CLP多微生物败血症模型操作如别处所详细描述的那样(参见Mansart，A等Shock 1938-44(2003))。简而言之，i.p.给药氯胺酮(150mg/kg)来麻醉大鼠(每组n＝6-10)。通过3.0-cm腹部中线切开来暴露盲肠，结扎末梢的一半，接着用G21针两次穿刺。从穿刺中排出少量粪便，以保证开放性。将盲肠重置于腹腔内并在两层间封闭腹部切口。手术后，用50mL/kg生理盐水s.c.注射所有大鼠以使体液复苏。然后如上给药TREM-1或杂乱的肽。
在大鼠中的血液动力学测定在LPS给药后即刻以及在CLP后16小时，用别处描述的操作(参见Mansart，A等Shock 1938-44(2003))纪录动脉BP(心脏收缩、心脏舒张和平均值)、心率、腹部大动脉血流和肠系膜血流。简而言之，将PE-50管插入左颈动脉和左颈静脉。用压力传感器和放大记录系统(IOX EMKA Technologies，巴黎，法国)连续监测动脉BP。血管周围的探测器(Transonic Systems，Ithaca，NY)包住上腹大动脉和肠系膜动脉，通过流量计(Transonic Systems)监测它们各自的流量。在最后一次测量(在LPS实验中的第4小时和CLP后的第24小时)后，用过量戊硫代巴比妥钠静脉注射处死动物。
生物学测量随后从颈动脉中抽血。在自动化血气分析仪(ABL 735，Radiometer，哥本哈根，丹麦)上进行动脉乳酸浓度和血气分析。根据厂商的推荐，血浆中的TNF-α和IL-1β浓度用ELISA试验(Biosource，Nivelles，比利时)确定。用Griess反应(R & D System，Abingdon，英国)测量血浆的亚硝酸盐/硝酸盐浓度。
统计学分析结果用平均值±SD表示。用学生t检验进行组间比较。用Statview软件(Abacus Concepts，CA)完成所有的统计学分析，双尾P＜0.05被认为是显著的。结果内毒素血症模型LPS给药后，动脉压、大动脉和肠系膜血流在对照动物(杂乱的肽处理的大鼠)中迅速下降，而心律保持不变(表6)。在TREM-1肽处理的动物中，动脉压和大动脉血流的下降延迟至第二小时，此时其数值显著高于对照动物。P1和P5处理的组间没有显著的差异。相反，这两个肽中的任何一个对降低肠系膜血流都没有任何效果(表6)。
动脉pH随时间保持稳定，直至LPS注射后的第4小时，其只在对照组中严重降低(表6)。第三小时后出现在对照动物中的动脉乳酸水平显著升高被TREM-1肽抑制了(表6)。对于pH、动脉碳酸氢盐和乳酸浓度，P1和P5间没有显著的差异。
如预期的那样，LPS在注射后30分钟至1小时间诱导出TNF-α血浆浓度的峰值，接着渐次下降(图13A)。P1肽的注射对该产量没有效果，而P5能降低TNF-α产量～30％。
P1延迟IL-1β的峰值直至LPS注射后的第3小时，但并不降低。相反，P5强烈的降低IL-1β的释放(图13B)。
对照和P1处理的动物中，亚硝酸盐/硝酸盐浓度在LPS给药后迅速增加，但经P5处理仍旧保持稳定(图14)。
表6.LPS诱导的内毒素血症期间的血液动力学参数


ap＜0.05P1vs对照bp＜0.05P5vs对照CLP模型由于本发明人的模型在完成CLP后16至20小时其严重程度达到最高值，因此本发明人选择到第16小时的时候研究动物。重要的是，在该时间点前没有死亡。尽管所有动物都经体液复苏，但为了严格考察肽的作用，没有一只接受抗生素。
随着时间对照动物中动脉压出现极大下降，到H24时心脏收缩、心脏舒张和平均动脉压各为58±7mmHg、25±4mmHg和38±2mmHg。该降低几乎被P1或P5处理所完全抑制，在H16和H24间没有显著差异(图15)。P1和P5处理的大鼠间没有差异。
TREM-1肽也防止对照动物中所观察到的大动脉和肠系膜血流下降(表7)。在P5处理下，对肠系膜血流改变的保护作用甚至更高。血流的相对维持与增加的心律无关，这是由于后者比对照动物更低(表7)。
对照大鼠中出现的渐进性代谢性酸中毒被P1肽降低，并几乎被P5抑制。对于动脉乳酸升高，观察到了相同的保护性趋势，P5有更明显的效果(表7)。
表7.CLP多微生物败血症期间的血液动力学和生化参数

ap＜0.05P1vs对照bp＜0.05P5vs对照cp＜0.05P5vsP1P1和P5都诱导降低TNF-α的产生，P5又有更强的效果。到H20时，在P5处理下，血浆TNF-α几乎检测不到，而在其他组动物中仍旧升高(图16)。
在对照动物中亚硝酸盐/硝酸盐浓度增加了，而在TREM-1肽治疗的组中仍旧保持在低水平(图17)。
因此在败血症大鼠中观察到了P5和P1对血液动力学的保护作用。动脉压和血流都得以独立于心率而维持。而且，尽管不完全，但是TREM-1信号转达的调节减少了细胞因子的产生并防止动物的高反应性。并不完全抑制细胞因子产生的事实是一个关键点。事实上，尽管诸如TNF-α的炎性细胞因子被认为是有害的，但它们也在败血症中显示出有益的效果，正如带有受损的TNF-α应答的动物腹膜炎模型中的致命问题所强调的的那样。
在脓毒性休克期间观察到的iNOS活化导致产生大量NO，这部分解释了一些外周血管紊乱(显著的血管舒张和血压过低)。对于心肌本身，多数NO的作用是由可溶性鸟苷酸环化酶的活化而介导的，鸟苷酸环化酶负责产生削弱胞质钙的收缩效应的cGMP。环GMP也能刺激一些磷酸二酯酶的活性。胞内cAMP水平的随之下降可以解释NO能减轻beta肾上腺素刺激的作用。因此动脉压的维持可以部分地由NO的产生的减少来解释，正如在TREM-1肽处理的动物中更低浓度的血浆亚硝酸盐/硝酸盐所反映的那样。
炎性细胞因子产量的减少能部分地解释血流上所观察到的效果。事实上，尽管心肌抑制的潜在细胞因子调节分子有很多，但是证明TNF-α和IL-1β是良好的候选分子。后两个细胞因子都能在体外或离体抑制心肌收缩。而且，在体外和体内中和或去除人败血症血清的TNF-α或IL-1β部分地消除了心肌抑制效应。尽管P1和P5在内毒素血症期间对血流和动脉压有完全相同的作用，但是它们对细胞因子产生的活性有区别，其中P1对血浆TNF-α和IL-1β浓度仅有轻微的效果。所以TREM-1肽的这种保护作用仅仅部分地与它们对细胞因子释放的作用有关，或者涉及冗余路径。
通过小的合成肽调节TREM-1路径在大鼠的实验性脓毒性休克期间对血液动力学产生有益效果，减少了炎性细胞因子的产生。
总之，这些数据证明本发明的TREM-1肽1)有效地防止个体动物败血症相关的血液动力学恶化；2)减轻乳酸酸中毒的发展；3)调节诸如TNF-α和IL-1β的前炎性细胞因子的产生；以及4)减少一氧化氮的产生。所以，TREM-1肽潜在地可用于恢复败血症、脓毒性休克或败血症样病情的患者的血液动力学参数，并因此构成前述状况的潜在治疗方法。
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85 90 95Arg Val Arg Met Val Asn Leu Gln Val Glu Asp Ser Gly Leu Tyr Gln100 105 110Cys Val Ile Tyr Gln Pro Pro Lys Glu Pro His Met Leu Phe Asp Arg115 120 125Ile Arg Leu Val Val Thr Lys Gly Phe Ser Gly Thr Pro Gly Ser Asn130 135 140Glu Asn Ser Thr Gln Asn Val Tyr Lys Ile Pro Pro Thr Thr Thr Lys145 150 155 160Ala Leu Cys Pro Leu Tyr Thr Ser Pro Arg Thr Val Thr Gln Ala Pro165 170 175Pro Lys Ser Thr Ala Asp Val Ser Thr Pro Asp Ser Glu Ile Asn Leu180 185 190Thr Asn Val Thr Asp Ile Ile Arg Val Pro Val Phe Asn Ile Val Ile195 200 205Leu Leu Ala Gly Gly Phe Leu Ser Lys Ser Leu Val Phe Ser Val Leu210 215 220Phe Ala Val Thr Leu Arg Ser Phe Val Pro225 230<210> 2<211> 230<212> PRT<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 2Met Arg Lys Ala Gly Leu Trp Gly Leu Leu Cys Val Phe Phe Val Ser1 5 10 15Glu Val Lys Ala Ala Ile Val Leu Glu Glu Glu Arg Tyr Asp Leu Val20 25 30Glu Gly Gln Thr Leu Thr Val Lys Cys Pro Phe Asn Ile Met Lys Tyr35 40 45Ala Asn Ser Gln Lys Ala Trp Gln Arg Leu Pro Asp Gly Lys Glu Pro50 55 60Leu Thr Leu Val Val Thr Gln Arg Pro Phe Thr Arg Pro Ser Glu Val65 70 75 80His Met Gly Lys Phe Thr Leu Lys His Asp Pro Ser Glu Ala Met Leu85 90 95Gln Val Gln Met Thr Asp Leu Gln Val Thr Asp Ser Gly Leu Tyr Arg100 105 110Cys Val Ile Tyr His Pro Pro Asn Asp Pro Val Val Leu Phe His Pro115 120 125Val Arg Leu Val Val Thr Lys Gly Ser Ser Asp Val Phe Thr Pro Val130 135 140Ile Ile Pro Ile Thr Arg Leu Thr Glu Arg Pro Ile Leu Ile Thr Thr145 150 155 160Lys Tyr Ser Pro Ser Asp Thr Thr Thr Thr Arg Ser Leu Pro Lys Pro165 170 175
Thr Ala Val Val Ser Ser Pro Gly Leu Gly Val Thr Ile Ile Asn Gly180 185 190Thr Asp Ala Asp Ser Val Ser Thr Ser Ser Val Thr Ile Ser Val Ile195 200 205Cys Gly Leu Leu Ser Lys Ser Leu Val Phe Ile Ile Leu Phe Ile Val210 215 220Thr Lys Arg Thr Phe Gly225 230<210> 3<211> 23<212> PRT<213> 小家鼠<220>
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<220>
<221> 结构域<222> (4)..(8)<223> TREM-1互补决定区(CDR)3<400> 4Val Ile Tyr His Pro Pro Asn Asp Pro Val Val Leu Phe His Pro Val1 5 10 15Arg Leu Val Val Thr Lys Gly20<210> 5<211> 17<212> PRT<213> 小家鼠<220>
<221> 结构域<222> (1)..(17)<223> 连接V-型免疫球蛋白Ig-样结构域和跨膜结构域的TREM-1颈状区<400> 5Thr Thr Thr Arg Ser Leu Pro Lys Pro Thr Ala Val Val Ser Ser Pro1 5 10 15Gly<210> 6<211> 21<212> PRT<213> 小家鼠
<220>
<221> 结构域<222> (15)..(19)<223> TREM-1互补决定区(CDR)3<400> 6Leu Gln Val Thr Asp Ser Gly Leu Tyr Arg Cys Val Ile Tyr His Pro1 5 10 15Pro Asn Asp Pro Val20<210> 7<211> 17<212> PRT<213> 小家鼠<220>
<221> 结构域<222> (15)..(17)<223> 部分TREM-1互补决定区(CDR)3<400> 7Leu Gln Val Thr Asp Ser Gly Leu Tyr Arg Cys Val Ile Tyr His Pro1 5 10 15Pro<210> 8<211> 23<212> PRT<213> 人工<220>
<223> 合成的杂乱氨基酸序列SEQ ID NO3
<400> 8Leu Thr Pro Lys His Gly Gln Arg Ser Thr His Val Thr Lys Phe Arg1 5 10 15Val Phe Glu Pro Val Met Leu20<210> 9<211> 17<212> PRT<213> 人工<220>
<223> 合成的杂乱氨基酸序列SEQ ID NO7<400> 9Thr Asp Ser Arg Cys Val Ile Gly Leu Tyr His Pro Pro Leu Gln Val15 10 15Tyr<210> 10<211> 22<212> DNA<213> 人工<220>
<223> RT-PCR引物<220>
<221> 引物_结合<222> (1)..(22)<223> TREM-1的RT-PCR 5’引物<400> 10ttgtctcaga actccgagct gc 22
<210> 11<211> 22<212> DNA<213> 人工<220>
<223> RT-PCR引物<220>
<221> 引物_结合<222> (1)..(22)<223> TREM-1的RT-PCR 3’引物<400> 11gagacatcgg cagttgactt gg 22<210> 12<211> 22<212> DNA<213> 人工<220>
<223> RT-PCR引物<220>
<221> 引物_结合<222> (1)..(22)<223> TREM-1sv的RT-PCT 5’引物<400> 12ggacggagag atgcccaaga cc 22<210> 13<211> 22<212> DNA<213> 人工<220>
<223> RT-PCR引物<220>
<221> 引物_结合<222> (1)..(22)<223> TREM-1sv的RT-PCR 3’引物<400> 13accagccagg agaatgacaa tg 22<210> 14<211> 22<212> DNA<213> 人工<220>
<223> RT-PCR引物<220>
<221> 引物_结合<222> (1)..(22)<223> β-肌动蛋白的RT-PCR 5’引物<400> 14ggacgacatg gagaagatct gg 22<210> 15<211> 24<212> DNA<213> 人工<220>
<223> RT-PCR引物<220>
<221> 引物_结合<222> (1)..(24)<223> β-肌动蛋白的RT-PCR 3’引物
<400> 15atagtaatgt cacgcacgat ttcc 24<210> 16<211> 23<212> PRT<213> 智人<220>
<221> 结构域<222> (6)..(11)<223> TREM-1互补决定区(CDR)2<400> 16Leu Ala Cys Thr Glu Arg Pro Ser Lys Asn Ser His Pro Val Gln Val1 5 10 15Gly Arg Ile Ile Leu Glu Asp20<210> 17<211> 23<212> PRT<213> 智人<220>
<221> 结构域<222> (4)..(8)<223> TREM-1互补决定区(CDR)3<400> 17Val Ile Tyr Gln Pro Pro Lys Glu Pro His Met Leu Phe Asp Arg Ile1 5 10 15Arg Leu Val Val Thr Lys Gly20
<210> 18<211> 21<212> PRT<213> 智人<220>
<221> 结构域<222> (15)..(19)<223> TREM-1互补决定区(CDR)3<400> 18Leu Gln Val Glu Asp Ser Gly Leu Tyr Gln Cys Val Ile Tyr Gln Pro1 5 10 15Pro Lys Glu Pro His20<210> 19<211> 17<212> PRT<213> 智人<220>
<221> 结构域<222> (15)..(17)<223> 部分TREM-1互补决定区(CDR)3<400> 19Leu Gln Val Glu Asp Ser Gly Leu Tyr Gln Cys Val Ile Tyr Gln Pro1 5 10 15Pro
<210> 20<211> 6<212> PRT<213> 智人<220>
<221> 结构域<222> (1)..(6)<223> TREM-1互补决定区(CDR)2<400> 20Arg Pro Ser Lys Asn Ser1 5<210> 21<211> 5<212> PRT<213> 智人<220>
<221> 结构域<222> (1)..(5)<223> TREM-1互补决定区(CDR)3<400> 21Gln Pro Pro Lys Glu1 5<210> 22<211> 6<212> PRT<213> 小家鼠<220>
<221> 结构域<222> (1)..(6)<223> TREM-1互补决定区(CDR)2
<400> 22Arg Pro Phe Thr Arg Pro1 5<210> 23<211> 5<212> PRT<213> 小家鼠<220>
<221> 结构域<222> (1)..(5)<223> TREM-1互补决定区(CDR)3<400> 23His Pro Pro Asn Asp1 权利要求
1.一种多肽，其包含源自TREM-1蛋白CDR2或CDR3的一个或多个序列，其特征在于能治疗、改善、或减轻败血症、脓毒性休克或败血症样病情的症状。
2.权利要求1所述的多肽，其中所述多肽包含所述TREM-1蛋白的少于30个连续的氨基酸。
3.一种具有抗败血症或抗脓毒性休克活性的TREM-1多肽，其由(i)对应于天然TREM-1蛋白序列的15-25个氨基酸的连续序列，该序列包括来自CDR2或CDR3序列的至少3个氨基酸；或(ii)其中一个或多个氨基酸由提供的其它氨基酸保守取代，可是来自CDR2或CDR3序列的至少3个氨基酸不被取代的这样的序列；或(iii)在其N和C末端之一或两端都连上异源多肽的(i)或(ii)的序列组成。
4.权利要求3所述的多肽，其中天然TREM-1蛋白序列是如SEQ ID NO1所标识的人序列，并且CDR2和CDR3序列分别为RPSKNS和QPPKE。
5.权利要求4所述的多肽，其中来自CDR2或CDR3序列的至少3个氨基酸是QPP。
6.权利要求4所述的多肽，其中来自CDR2或CDR3序列的至少3个氨基酸是QPPK。
7.权利要求4所述的多肽，其中来自CDR2或CDR3序列的至少3个氨基酸是QPPKE。
8.权利要求4所述的多肽，其中来自CDR2或CDR3序列的至少3个氨基酸是RPSKNS。
9.权利要求3所述的多肽，其中天然TREM-1蛋白序列是如SEQ ID NO2所标识的鼠序列，并且CDR2和CDR3序列分别为RPFTRP和HPPND。
10.权利要求9所述的多肽，其中来自CDR2或CDR3序列的至少3个氨基酸是HPP。
11.权利要求9所述的多肽，其中来自CDR2或CDR3序列的至少3个氨基酸是HPPN。
12.权利要求9所述的多肽，其中来自CDR2或CDR3序列的至少3个氨基酸是HPPND。
13.权利要求9所述的多肽，其中来自CDR2或CDR3序列的至少3个氨基酸是RPFTRP。
14.前述权利要求任一项所述的多肽，其中所述多肽特征在于能治疗、改善、或减轻败血症、脓毒性休克或败血症样病情的症状。
15.与SEQ ID NO3、4、6、7、16、17、18或19之任一序列具有基本上的序列同一性的多肽，且其特征在于能治疗、改善、或减轻败血症、脓毒性休克或败血症样病情的症状。
16.序列SEQ ID NO3、4、6、7、16、17、18或19的多肽、其活性片段、类似物和衍生物，且其特征在于能治疗、改善、或减轻败血症、脓毒性休克或败血症样病情的症状。
17.与序列SEQ ID NO3、4、6、7、16、17、18或19具有至少80％序列同一性的多肽，且其特征在于能治疗败血症、脓毒性休克或败血症样病情，并具有源自TREM-1蛋白CDR2或CDR3的至少2个连续的氨基酸。
18.与序列SEQ ID NO3、4、6、7、16、17、18或19具有至少80％序列同一性的多肽，且其特征在于能治疗败血症、脓毒性休克或败血症样病情，其中所述肽具有源自TREM-1蛋白CDR2或CDR3的至少3个连续的氨基酸。
19.一种分离的多核苷酸，其能编码与序列SEQ ID NO3、4、6、7、16、17、18或19具有基本上的序列同一性、且其特征在于能治疗败血症、脓毒性休克或败血症样病情的多肽。
20.一种包含多核苷酸的载体，所述多核苷酸能编码与序列SEQ ID NO3、4、6、7、16、17、18或19具有至少约80％序列同一性、且其特征在于能治疗败血症、脓毒性休克或败血症样病情的多肽。
21.权利要求15至20任一项所述的多肽，其中所述多肽包含天然TREM-1蛋白的至少30个连续的氨基酸。
22.包含前述权利要求任一项的肽或多肽的组合物。
23.用于治疗的前述权利要求任一项的肽或多肽。
24.用于治疗败血症、脓毒性休克或败血症样病情的疗法的前述权利要求任一项的肽或多肽。
25.前述权利要求任一项的肽或多肽在制备治疗败血症、脓毒性休克或败血症样病情的药物中的用途。
26.治疗或改善个体败血症、脓毒性休克或败血症样病情的方法，包括向个体给药治疗有效量的前述权利要求任一项的肽或多肽。
27.权利要求26的方法，其中所述肽或多肽与序列SEQ ID NO3、4、6、7、16、17、18或19具有基本上的序列同一性。
28.权利要求26的方法，其中所述肽或多肽是SEQ ID NO3、4、6、7、16、17、18或19的多肽、或SEQ ID NO3、4、6、7、16、17、18或19的活性片段、类似物或衍生物。
29.权利要求26的方法，其中所述肽或多肽与SEQ ID NO3、4、6、7、16、17、18或19具有至少约80％的序列同一性。
30.筛选治疗败血症、脓毒性休克或败血症样病情的化合物或组合物的方法，包括提供TREM-1肽或TREM-1多肽；将TREM-1肽与合适动物模型中的动物接触；确定是否在败血症中存在调节作用，其中存活增加显示TREM-1肽可用于治疗败血症、脓毒性休克或败血症样病情。
31.前述权利要求任一项所述的多肽、载体、用途、方法或组合物，其中适应症是败血症或脓毒性休克。
全文摘要
(本发明提供了)一种多肽，其包含源自TREM－1蛋白CDR2或CDR3的一个或多个序列，其特征在于能治疗、改善、或减轻败血症、脓毒性休克或败血症样病情的症状。
文档编号C12N15/63GK1817901SQ20051010469
公开日2006年8月16日 申请日期2005年11月21日 优先权日2004年11月29日
发明者G·福雷, S·吉博, P·帕尼纳, N·帕西尼 申请人:拜奥克塞尔有限公司, 南锡第一大学(亨列·普安卡雷大学)