一类新的具有神经保护功能的多肽的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医药领域，具体地，涉及一类新的具有神经保护功能的多肽。
【背景技术】
[0002] 青光眼（Glaucoma)是一组由病理性眼内压（intraocular pressure, Ι0Ρ)升高或 者视神经血流灌注压降低等多种因素引起的视神经退行性疾病，它是世界上导致不可逆性 致盲性眼病的第二大病因。目前临床上治疗青光眼的主要方法是通过药物、激光和手术方 法降低眼内压，以减轻病理性高眼压引起的机械性损伤，改善低血流灌注状态，从而减缓视 网膜神经节细胞的凋亡。然而，临床研究发现，很大一部分患者眼压控制在正常范围之内病 情却仍在发展，出现典型的视盘改变和视野缺损。此外，疾病的发生发展可以出现在眼压始 终在正常范围内的患者中，即正常眼压性青光眼。因此，对于青光眼的治疗，除了积极控制 眼压，还应重视对视神经的保护。
[0003] 视神经保护的方法有多种，如通过药物口服、局部滴眼或玻璃体腔内注射以减缓、 阻止甚至逆转神经细胞的死亡；还有基因疗法，即通过重组腺病毒相关病毒（rAAV)或慢病 毒（Ientiviral)等载体介导的抗凋亡蛋白或神经营养因子的表达来减缓RGCs的凋亡；此 外，通过干细胞移植的方法可以利用干细胞分泌神经营养因子及其他调节因子减轻青光眼 发病相关的神经营养因子剥夺、炎症反应、氧化应激、兴奋性毒性等从而保护RGCs。就药物 而言，传统的化学药物毒副作用大，重组蛋白类药物生产成本高、免疫原性强，这些缺点都 阻碍了其在临床上的广泛应用。
[0004] 在开发有效的眼部炎症抑制剂时，应充分考虑到眼科用药的特殊性。
[0005] 第一，眼部存在多个解剖性和功能性的屏障。全身给药常常由于血-房水屏障和 血-视网膜屏障而无法在眼组织局部达到足够的药物浓度；局部给药，如玻璃体腔注射，大 于76. 5kDa的大分子在理论上很难穿透视网膜作用于视网膜和脉络膜新生血管。
[0006] 第二，药物在亲水的泪液、房水、玻璃体液中溶解的程度与其有效性呈正相关。
[0007] 第三，基于上述主要原因，眼科用药的生物利用度很低；要使之提高，需加大给药 的浓度。但高浓度药物的毒副作用较为明显，全身和局部均无法高剂量给药。
[0008] 因此，本领域迫切需要开发一种适于眼球组织的安全有效的小分子神经保护剂。
【发明内容】
[0009] 本发明提供了一种新的具有神经保护功能的多肽，尤其是适用于眼球的组织的多 肽。
[0010] 本发明第一方面，提供了一种下式I表示的多肽，或其药学上可接受的盐
[0011] [XaaO]-[Xaal]-[Xaa2]-[Xaa3]-[Xaa4]-[Xaa5]-[Xaa6]-[Xaa7]-[Xaa8]-[Xaa9 ]-[XaalO]-[Xaal2]-[Xaal2]-[Xaal3]-[Xaal4]-[Xaal5]-[Xaal6]-[Xaal7]-[Xaal8]-[X aal9] (I)
[0012] 式中，
[0013] XaaO是无，或1-5个氨基酸构成肽段；
[0014] Xaal 是选自下组的氨基酸：Ile、Leu、Val、Met、Ala 或 Phe ;
[0015] Xaa2是选自下组的氨基酸：Pen或Hcy ;
[0016] Xaa3是选自下组的氨基酸：Lys、Arg、Gln或Asn ;
[0017] Xaa4是选自下组的氨基酸：Gly、Pro、Ala或；
[0018] Xaa5是选自下组的氨基酸：Lys、Arg、Gln或Asn ;
[0019] Xaa6是选自下组的氨基酸：Glu或Asp ;
[0020] Xaa7 是选自下组的氨基酸：Val、lie、Leu、Met、Phe 或 Ala ;
[0021] Xaa8是选自下组的氨基酸：Cys、Hcy或Pen ;
[0022] Xaa9是选自下组的氨基酸：Thr或Ser ;
[0023] XaalO是选自下组的氨基酸：Acp或β -Ala ;
[0024] Xaall 是选自下组的氨基酸：Asn、Gin、His、Lys 或 Arg ;
[0025] Xaal2是选自下组的氨基酸：Ala、Val、Leu或lie ;
[0026] Xaal3是选自下组的氨基酸：Pro或Ala ;
[0027] Xaal4 是选自下组的氨基酸：Val、Ile、Leu、Met、Phe 或 Ala ;
[0028] Xaal5是选自下组的氨基酸：Ser或Thr ;
[0029] Xaal6 是选自下组的氨基酸：Ile、Leu、Val、Met、Ala 或 Phe ;
[0030] Xaal7是选自下组的氨基酸：Pro或Ala ;
[0031] Xaal8是选自下组的氨基酸：Gln或Asn ;
[0032] Xaal9是无，或1-5个氨基酸构成肽段；
[0033] 其中，所述的Xaa2和XaaS之间形成二硫键，并且所述的多肽具有神经保护的活 性。
[0034] 在另一优选例中，所述的多肽长度< 28个氨基酸，较佳地，< 25个，更佳地，< 20 个。
[0035] 在另一优选例中，所述多肽至少具有12个固定氨基酸，较佳地为15个，更佳地为 16个。
[0036] 在另一优选例中，所述的多肽如SEQ ID NO. : 1-10所示。
[0037] 在另一优选例中，所述的多肽为：
[0038] XaaO 是无；
[0039] Xaal是选自下组的氨基酸：Ile或Leu ;
[0040] Xaa2 为 Pen ;
[0041] Xaa3是选自下组的氨基酸：Lys或Arg ;
[0042] Xaa4是选自下组的氨基酸：Gly或Ala ;
[0043] Xaa5是选自下组的氨基酸：Lys或Arg ;
[0044] Xaa6是选自下组的氨基酸：Glu或Asp ;
[0045] Xaa7是选自下组的氨基酸：Val或Leu ;
[0046] Xaa8是选自下组的氨基酸：Cys或Pen ;
[0047] Xaa9是选自下组的氨基酸：Thr或Ser ;
[0048] XaalO是选自下组的氨基酸：Acp或β -Ala ;
[0049] Xaall是选自下组的氨基酸：Asn或Gln ;
[0050] Xaal2是选自下组的氨基酸：Ala或Val ;
[0051] Xaal3是选自下组的氨基酸：Pro或Ala ;
[0052] XaaH是选自下组的氨基酸：Val或Leu ;
[0053] Xaal5是选自下组的氨基酸：Ser或Thr ;
[0054] Xaal6是选自下组的氨基酸：Ile或Leu ;
[0055] Xaal7是选自下组的氨基酸：Pro或Ala ;
[0056] Xaal8是选自下组的氨基酸：Gln或Asn ;
[0057] Xaal9 是无；
[0058] 其中，所述的Xaa2和XaaS之间形成二硫键，并且所述的多肽具有神经保护的活 性，且所述的多肽经过至多1-5个，较佳地1-3个，更佳地1-2个氨基酸的取代。
[0059] 在另一优选例中，所述的XaaO是1~3个氨基酸构成的肽段；和/或所述的Xaal9 是1~3个氨基酸构成的肽段。
[0060] 本发明第二方面，提供了一种衍生多肽，所述衍生多肽是SEQ ID NO. :1所示多肽 的衍生多肽，且选自下组：
[0061] (a)具有SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列；
[0062] (b)将SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列经过1-5个（较佳地1-3,更佳地1-2个）氨 基酸残基的缺失、取代或添加而形成的，且具有神经保护功能的由（a)衍生的多肽。
[0063] 在另一优选例中，（a)所述多肽的长度< 28个氨基酸，较佳地，< 25个，更佳地， < 20 个。
[0064] 在另一优选例中，所述的衍生多肽是由SEQ ID NO. : 1所示多肽经过1-5个，较佳 地1-3个，更佳地1-2个氨基酸取代；和/或
[0065] 在另一优选例中，所述的缺失是1-3个，较佳地1-2个多肽C端的氨基酸残基的缺 失；和/或
[0066] 所述的衍生多肽的两端分别经过1-5个，较佳地1-4个或1-3个，更佳地1-2个， 氨基酸添加形成的。
[0067] 在另一优选例中，所述的多肽根据表1中"代表性的取代"进行取代。
[0068] 在另一优选例中，所述的多肽根据表1中"优选的取代"进行取代。
[0069] 在另一优选例中，所述的衍生多肽保留了 > 70%的SEQ ID NO: 1的所示多肽的神 经保护活性。
[0070] 在另一优选例中，所述的衍生多肽与SEQ ID NO: 1的同源性彡80%，较佳地彡90% ; 更佳地> 95%。
[0071] 本发明还提供了神经保护功能的、式I化合物的二聚体和多聚体形式。
[0072] 在另一优选例中，本发明还提供了一种分离的核酸分子，它编码本发明上述的多 肽。
[0073] 本发明第三方面，提供了一种药物组合物，它含有：
[0074] (a)本发明第一方面任一的多肽、本发明第二方面任一的衍生多肽，或其药学上可 接受的盐；和
[0075] (b)药学上可接受的载体或赋形剂。
[0076] 在另一优选例中，所述组合物的剂型为眼药水、针剂（如眼周和眼内注射液，尤其 是玻璃体腔内注射）、眼用凝胶或眼药膏。
[0077] 在另一优选例中，所述的组合物为缓释剂型。
[0078] 本发明第四方面，提供了一种本发明所述多肽或其衍生多肽或药学上可接受的盐 的用途，它们被用于制备神经保护或防治与神经细胞损伤疾病的药物。
[0079] 在另一优选例中，所述的对象是人。
[0080] 在另一优选例中，所述的神经细胞损伤是与眼部神经细胞损伤的神经细胞损伤。
[0081] 在另一优选例中，所述的与神经细胞损伤相关疾病的选自下组：眼部神经细胞损 伤相关疾病、急性或慢性视网膜视神经细胞损伤性疾病。
[0082] 在另一优选例中，所述的眼部神经细胞损伤相关疾病包括青光眼、黄斑病变、糖尿 病性视网膜病变、视网膜动静脉阻塞。
[0083] 在本发明的第五方面，提供了一种加强哺乳动物神经保护的方法，包括步骤：给需 要的对象施用本发明所述的多肽或其药学上可接受的盐。
[0084] 在另一优选例中，所述的施用包括眼表施用或玻璃体腔内注射施用
[0085] 在另一优选例中，所述的对象是人。
[0086] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附图说明】
[0087] 图1显示了 NP-17肽对RGC-5细胞具有促增殖作用，并呈现出剂量依赖性。NP-17 在1000ng/ml浓度时活性最强。
[0088] 图2显示了缺氧环境下，RGC-5细胞生存率降低，NP-17能够提高缺氧环境下细胞 的生存率，保护神经节细胞免受缺氧环境的损伤。
[0089] 图3显示了 NMDA对RGC-5细胞具有毒性作用，并呈现出剂量依赖性。NMDA在 100uM/L时，RGC-5细胞的生存率约为55%~60%。
[0090] 图4显示了 NP-17对NMDA诱导RGC-5细胞损伤的保护作用：NMDA损伤下，RGC-5细 胞生存率降低，NP-17能够提高NMDA诱导损伤下细胞的生存率，保护神经节细胞免受NMDA 兴奋性毒性的损伤。
[0091] 图5显示了 NMDA损伤后，RGC-5细胞凋亡增加，NP-17能够降低NMDA诱导损伤后 细胞的凋亡率，保护神经节细胞。
[0092] 图6显示了 NP-17上调PI3K/Akt通路：NP-17作用5分钟后磷酸化水平开始上调， 30分钟时达到高峰，随后逐渐下降。
[0093] 图7显示了 PI3K/Akt通路抑制剂对NP-17神经保护作用的影响：加入通路抑制剂 后，细胞死亡率明显升高；单纯加入信号通路抑制剂后，抑制剂对细胞生存率无显著影响； LY294002能够明显降低p-Akt的水平。
[0094] 图8显示了 NP-17上调ERK通路：NP-17作用2. 5分钟后磷酸化水平开始上调， ERKl在7. 5分钟时达到高峰，而ERK