2在10分钟时达到高峰，随后逐渐下降。
[0095] 图9显示了 ERK通路抑制剂对NP-17神经保护作用的影响：加入通路抑制剂 Η)098059后，细胞死亡率明显升高；单纯加入信号通路抑制剂后，抑制剂对细胞生存率无 显著影响；PD098059能够明显降低p-Akt的水平。
[0096] 图10显示了 NP-17抑制Caspase3的表达：NP-17能够降低NMDA损伤后RGC-5细 胞中Caspase3的表达，而且其抑制能力强于BDNF。
[0097] 图11显示了 Caspase3抑制剂抑制细胞凋亡：未加入NMDA组，加入Caspase3抑制 剂Z-DEVD-FMK后，对细胞死亡率无明显影响，表面该抑制剂无细胞毒性；加入NMDA组，使用 抑制剂后，细胞死亡率明显降低，并呈现剂量依赖性。
[0098] 图12显示了 NP-17提高Bcl-2表达，抑制Bad和Bax的表达：NP-17能够降低NMDA 损伤后RGC-5细胞中Bad和Bax的表达，提高Bcl-2的表达。
[0099] 图13显示了 NP-17保护神经节细胞：NMDA组神经节细胞的数量明显下降，注射 NP-17后，残余的神经节细胞数量多余NMDA组。
[0100] 图14显示了 NP-17抑制神经节细胞的凋亡：NMDA组神经节细胞层细胞凋亡数量 明显增加，加用NP-17后，RGC细胞的凋亡数量明显降低。
[0101] 图15显示了 NP-17降低视网膜组织中Caspase3的含量：NMDA能够明显增加视网 膜组织中Caspasd的含量，玻璃体腔注射NP-17后，视网膜组织中Caspasd的含量显著下 降。
[0102] 图16显示了多肽Nl对RGC-5细胞增殖作用：不同浓度组的多肽Nl对RGC-5细胞 均不具有促增殖作用，P>〇. 05。
[0103] 图17显示了多肽N2对RGC-5细胞增殖作用：不同浓度组的多肽NI对RGC-5细胞 均不具有促增殖作用，P>〇. 05。
【具体实施方式】
[0104] 本发明人经过广泛而深入的研究，首次制备了一类源自脑源性神经营养因子、具 有神经保护活性的，分子量小于5kD(如仅约2kD)的小分子多肽。具体而言，本发明人应用 生物信息学的方法，基于同源性分析和生物学特性等分析，设计了数个候选序列，采用固相 法将其合成修饰，分离纯化获得高纯度的多肽NP-17,并运用HPLC及MS对之进行鉴定，再经 体内外NMDA诱导凋亡的RGC细胞进行筛选，获得了一类新型的、具有神经保护作用的小分 子多肽，其活性程度可达BDNF的80%，并获得了该多肽的最佳有效浓度。此外，本发明人还 通过实验发现，本发明多肽NP-17是通过提高Bcl-2蛋白浓度，抑制Caspasd的表达来实 现的。
[0105] 本发明的多肽的分子量小，可透过各种眼组织屏障；水溶性好，能在中性泪液、房 水和玻璃体液中保持较高的浓度；安全性高，对生物组织毒副作用小；眼局部用药生物利 用度高，可减少剂量，从而减小全身副作用。在此基础上完成了本发明。
[0106] 脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF)
[0107] 脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF)是一种具有 神经营养和神经保护作用的大分子蛋白质，1982年Barde等首次发现。BDNF分子单体有 119个氨基酸组成，蛋白等电点9199,分子量为13. 15kD，其分子内部可形成多个Loop结构。 BDNF是体内含量最高的神经营养因子，广泛分布于神经系统、内分泌系统以及骨和软骨组 织中，通过与原肌球蛋白受体激酶（TrkB)结合，激活下游通路，调节神经细胞的行为和功 能，如增加突触可塑性、促进神经发生、促进神经元分化以及修复损伤神经元等，对神经组 织生长发育和损伤修复发挥着十分重要的作用。
[0108] BDNF具有十分强的生物学活性，但是由于其分子量大，难以通过各种生理屏障，如 血脑屏障、血视网膜屏障等，再加之在体内半衰期极短，目前难以应用于临床。课题组利用 生物信息学技术，筛选出具有类似BDNF发夹样LOOP结构的生物肽，能够与TrkB受体结合， 发挥类似BDNF的活性。在现有技术中已已合成多个具有LOOP结构的生物肽，但是活性最 高的也只有BDNF的60%，活性难以满足临床需求。
[0109] 活性多肽
[0110] 在本发明中，术语"本发明多肽"、"NP-17多肽"、"NP-17多肽"、"短肽NP-17"或"肽 NP-17"可互换使用，都指具有神经保护活性的肽NP-17氨基酸序列（I (Pen) KGKEVCT (Acp) NAPVSIPQ，如SEQ ID NO: 1所示）的蛋白或多肽，且本发明多肽为含有链内二硫键的环形多 肽。此外，所述术语还包括具有神经保护功能的、SEQ ID NO :1序列的变异形式。这些变异 形式包括（但并不限于）：1-5个（通常为1-4个，更佳地1-3个，最佳地1-2个）氨基酸的 缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个（通常为5个以 内，较佳地为3-4个以内，更佳地为1-2个以内）氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或 相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添 加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的结构和功能。此外，所述术语还包括 单体和多聚体形式本发明多肽。
[0111] 本发明还包括NP-17多肽的活性片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语"片 段"、"衍生物"和"类似物"是指基本上保持神经保护功能或活性的多肽。本发明的多肽 片段、衍生物或类似物可以是（i)有一个或几个保守或非保守性氨基酸残基（优选保守性 氨基酸残基）被取代的多肽，或（ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或
[111] NP-17多肽与另一个化合物（比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇）融合所 形成的多肽，或（iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽（与前导序列、分 泌序列或6His等标签序列融合而形成的然后蛋白）。根据本文的教导，这些片段、衍生物和 类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
[0112] 一类优选的活性衍生物指与式I的氨基酸序列相比，有至多5个，较佳地至多3-4 个，更佳地至多1-2个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性 变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
[0113] 表 1
[0114]
[0115]
[0116] 发明还提供NP-17多肽的类似物。这些类似物与天然NP-17多肽的差别可以是氨 基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。类似物还包 括具有不同于天然L-氨基酸的残基（如D-氨基酸）的类似物，以及具有非天然存在的或 合成的氨基酸（如β、Y-氨基酸）的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的 代表性的多肽。
[0117] 一些常用的非天然氨基酸列于下表lb。
[0118] 表1b
[0119]
[0121] 修饰（通常不改变一级结构）形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙 酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进 行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶（如哺乳动 物的糖基化酶或去糖基化酶）而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基（如磷酸酪 氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸）的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优 化了溶解性能的多肽。
[0122] 本发明多肽还可以以由药学上或生理学可接受的酸或碱衍生的盐形式使用。这 些盐包括（但不限于）与如下酸形成的盐：氢氯酸、氢溴酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、乳 酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、草酸、富马酸、马来酸、草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、或羟乙 磺酸。其他盐包括：与碱金属或碱土金属（如钠、钾、钙或镁）形成的盐，以及以酯、氨基甲 酸酯或其他常规的"前体药物"的形式。
[0123] 编码序列
[0124] 本发明还涉及编码NP-17多肽的多核苷酸。，它编码SEQ ID NO: 1所示的短肽 NP-17。
[0125] 本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA可以是编码链或非编码链。本 发明的NP-17核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法 获得。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明多肽（或其片段，或其衍生物） 的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子（或如载体） 和细胞中。
[0126] 本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或NP-17多肽 编码序列经基因工程产生的宿主细胞。
[0127] 另一方面，本发明还包括对NP-17多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体， 尤其是单克隆抗体。
[0128] 制备方法
[0129] 本发明多肽可以是重组多肽或合成多肽。本发明的多肽可以是化学合成的，或重 组的。相应地，本发明多肽可用常规方法人工合成，也可用重组方法生产。
[0130] -种优选的方法是使用液相合成技术或固相合成技术，如Boc固相法、Fmoc固相 法或是两种方法联合使用。固相合成可快速获得样品，可根据目的肽的序列特征选用适当 的树脂载体及合成系统。例如，Fmoc系统中优选的固相载体如连接有肽中C端氨基酸的 Wang树脂，Wang树脂结构为聚苯乙烯，与氨基酸间的手臂是4-烷氧基苄醇；用25%六氢吡 啶/二甲基甲酰胺室温处理20分钟，以除去Fmoc保护基团，并按照给定的氨基酸序列由C 端逐个向N端延伸。合成完成后，用含4%对甲基苯酚的三氟乙酸将合成的胰岛素原相关肽 从树脂上切割下来并除去保护基，可过滤除树脂后乙醚沉淀分离得到粗肽。将所得产物的 溶液冻干后，用凝胶过滤和反相高压液相层析法纯化所需的肽。当使用Boc系统进行固相 合成时，优选树脂为连接有肽中C端氨基酸的PAM树脂，PAM树脂结构为聚苯乙烯，与氨基 酸间的手臂是4-羟甲基苯乙酰胺；在Boc合成系统中，在去保护、中和、偶联的循环中，用 TFA/二氯甲烷（DCM)除去保护基团Boc并用二异丙基乙胺（DIEA/二氯甲烷中和。肽链缩 合完成后，用含对甲苯酚（5-10%)的氟化氢（HF)，在0°C下处理1小时，将肽链从树脂上切 下，同时除去保护基团。以50-80%乙酸（含少量巯基乙醇）抽提肽，溶液冻干后进一步用 分子筛Sephadex GlO或Tsk_40f分离纯化，然后再经高压液相纯化得到所需的肽。可以使 用肽化学领域内已知的各种偶联剂和偶联方法偶联各氨基酸残基，例如可使用二环己基碳 二亚胺（DCC)，羟基苯骈三氮唑（HOBt)或1，1，3, 3-四脲六氟磷酸酯（HBTU)进行直接偶联。 对于合成得到的短肽，其纯度与结构可用反相高效液相和质谱分析进行确证。
[0131 ] 在一优选例中，本发明多肽NP-17,按其序列，采用固相合成的方法制备，行高效液 相色谱纯化，获得高纯度目的肽冻干粉，-20°C贮存。
[0132] 另一种方法是用重组技术产生本发明多肽。通过常规的重组DNA技术，可利用本 发明的多核苷酸可用来表达或生产重组的NP-17多肽。一般来说有以下步骤：
[0133] (1).用本发明的编码NP-17多肽的多核苷酸（或变异体），或用含有该多核苷酸 的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
[0134] (2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；
[0135] (3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
[0136] 重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其 物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域 技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理 (盐析方法）、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析（凝胶过滤）、吸附层析、离子交 换层析、高效液相层析（HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
[0137] 由于本发明多肽较短，因此可以考虑将多个多肽串联在一起，重组表达后获得多 聚体形式的表达产物，然后通过酶切等方法形成所需的多肽。
[0138] 药物组合物和施用方法
[0139] 另一方面，本发明还提供了一种药物组合物，它含有（a)安全有效量的本发明多 肽或其药学上可接受的盐；以及（b)药学上可接受的载体或赋形剂。本发明多肽的数量通 常为10微克-100毫克/剂，较佳地为100-1000微克/剂。
[0140] 为了本发明的目的，有效的剂量为给予个体约0. 01毫克/千克至50毫克/千克， 较佳地0. 05