一种雌蚕丝蛋白多肽1及其制备和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术多肽制备领域，具体涉及雌蚕丝蛋白多肽制备领域。 技术背景
[0002] 蚕丝广泛应用于纤维制造业。最近的研究发现，不同性别的蚕的蚕丝蛋白其结构 和化学性质不同。结果显示，雄蚕丝的结晶度、取向度、耐热性能、断裂强度都较高，但雄蚕 丝吸湿能力低于雌蚕丝，而在放湿过程中雄蚕丝达到平衡的时间要低于雌蚕丝。因此，当蚕 丝用于纤维制造时，往往优选雄蚕丝，而大量的雌蚕丝则被丢弃，造成了浪费。
[0003] 随着蚕丝的应用领域的拓宽，蚕丝在化妆品领域的功效显得尤为突出。由于蚕丝 蛋白质分子特殊的化学结构，具有天然调湿、改善人体皮肤营养、防止皮肤起皱、增强皮肤 细胞活力和弹性、促进细胞新陈代谢及维持皮肤正常生理状态的作用。由于，化妆品与纤维 制造的需求不同，化妆品需要更高的保湿效果，因此，雌蚕丝比雄蚕丝具有更好的吸湿能力 和更慢的放湿过程的特点，如果应用于化妆品领域，有起到更好的保湿作用，能更有效的改 善皮肤营养，恢复细胞活力和弹性。
[0004] 当雌蚕丝蛋白应用于化妆品时，和普通蚕丝蛋白一样存在分子量较大的问题。较 大的分子量的蛋白往往会引起过敏反应，导致皮肤瘙痒。小分子蛋白质或多肽就不容易诱 发免疫变态反应。但是，小分子蛋白质往往会失去原形蛋白质的功效。因此，如何才能让分 解后的蚕丝蛋白小分子既有原蛋白质的功效，且不引起过敏，一直是一个难以协调的问题。
【发明内容】
[0005] 发明目的
[0006] 针对现有蚕丝蛋白化妆品的现状，发明一种雌蚕丝蛋白多肽及制备和应用，该多 肽是利用雌蚕丝制备的多肽，将该多肽应用于化妆品，其与雄蚕丝蛋白和普通蚕丝蛋白相 比，具有更好的保湿效果，且该多肽没有抗原性。
[0007] 技术方案
[0008] 一种雌蚕丝蛋白多肽，其特征在于，序列为HHHISAGIPGMACKKKNVWYRG。所述雌蚕 丝蛋白多肽的制备方法，其特征在于，步骤包括（1)将清洗、烘干后的雌蚕茧100g剪碎，加 入100mL去离子水中；(2)在-80°c速冻；（3)将蚕茧和水的混合物超声、粉碎；(4)煮沸1-2 小时，同时缓慢搅拌；（5)待溶液冷却后，加入水解酶，在20-40°C反应30-60分钟；(6)离心 2000-3000rpm，5-10分钟，取上清；（6)采用盐析法，将蚕丝蛋白沉淀；（7)将沉淀物复溶于 pH5. 4-5. 7缓冲液中，脱盐；(8)采用分子筛层析技术，分离出分子量为2-3KDa的多肽，即 得。
[0009] .根据权利要求书2所述雌蚕丝蛋白多肽的制备方法，其特征在于，步骤（5)中所 述的水解酶是胃蛋白酶、胰蛋白酶、菠萝蛋白酶、生姜蛋白酶或合欢蛋白酶。所述雌蚕丝蛋 白多肽的制备方法，其特征在于，步骤（7)中所述的盐析法所用的盐为NH 4C1。
[0010] 所述雌蚕丝蛋白多肽的制备方法，其特征在于，步骤（8)中所述的缓冲液为PBS。
[0011] 所述雌蚕丝蛋白多肽的制备方法，其特征在于，步骤（9)中所述的分子筛为葡聚 糖凝胶。
[0012] 所述的雌蚕丝蛋白多肽在制备化妆品中的应用。
[0013] 本发明多肽委托上海吉尔生化合成，纯度为95%。
[0014] 有益效果
[0015] 本发明的制备得到的雌蚕丝蛋白多肽，经蛋白质序列测定，序列为 HHHISAGIPGMACKKKNVWYRG，纯度大于70%。实验表明，该多肽具有保湿的作用，作用与普通 蚕丝蛋白和雄蚕丝蛋白相比，效果更好。抗原实验结果表明，该多肽没有抗原性。
【具体实施方式】
[0016] 实施例1
[0017] 将清洗、烘干后的雌蚕茧100g剪碎，加入100mL去离子水中；在-80°C速冻；将蚕 茧和水的混合物超声、粉碎；煮沸1小时，同时缓慢搅拌；待溶液冷却后，加入生姜蛋白酶， 在室温反应60分钟；离心3000rpm，5-10分钟，取上清；在上清中加入NH4C1，将蚕丝蛋白 沉淀，离心，得沉淀物；将沉淀物复溶于PH5. 4-5. 7缓冲液中，透析脱盐；采用分子筛层析技 术，分离出分子量为2-3KDa的多肽，即得。采用固相蛋白质自动测序仪测定该多肽的序列 为 HHHISAGIPGMACKKKNVWYRG，纯度为 72. 3%。
[0018] 实施例2
[0019] 将清洗、烘干后的雌蚕茧100g剪碎，加入100mL去离子水中；在-80°C速冻；将蚕 茧和水的混合物超声、粉碎；煮沸2小时，同时缓慢搅拌；待溶液冷却后，加入胰蛋白酶，在 40°C反应30分钟；离心3000rpm，5-10分钟，取上清；在上清中加入NaCl，将蚕丝蛋白沉淀， 离心，得沉淀物；将沉淀物复溶于PH5. 4-5. 7缓冲液中，透析脱盐；采用分子筛层析技术， 分离出分子量为2-3KDa的多肽，即得。采用固相蛋白质自动测序仪测定该多肽的序列为 HHHISAGIPGMACKKKNVWYRG，纯度为 73. 1 % 〇
[0020] 实施例3
[0021] 将上海吉尔合成的多肽添加入乳膏基质中，进行免疫原性检测。BALB/c白鼠6只， 雌雄各半，将小鼠背部脱毛，裸露皮肤。分别取不同浓度的雌蚕丝蛋白多肽溶液（0.5,1.0， 2. Omg/ml)以1. 25 μ L/cm2涂敷密度短期1次涂敷，每日涂敷1次，连续8周，于1-12周 眼眶静脉丛定点取血每周一次，12000rpm离心2min，分离血浆取上清液，-20°C低温保存备 用。待室温溶解后，取0.1 ml上清液间接ELISA检测血清中抗体滴度。以各样品实际A值 (0D450)比阴性对照血清A值即得RA值，RA彡2. 1即为阳性，将Blood bio-samples样品 作一系列稀释后进行检测，呈阳性反应的最高稀释度即为该样品的滴度。测定结果显示。 1-12周收集的血样，经ELISA间接法检测多肽诱导抗体均为阴性。由此可见，本发明得到的 雌蚕丝蛋白多肽无免疫原性。
[0022] 实施例4
[0023] 将实施例1制备的多肽添加入乳膏基质中。分别取不同浓度的普通蚕丝蛋白 2. Omg/ml、雄蚕丝蛋白2. Omg/ml、雌蚕丝蛋白多肽溶液（0· 5,1. 0,2. Omg/ml)以L 25 yL/ cm2涂敷密度短期1次涂敷，轻轻拍打至吸收，测定12小时后角质层水分含量。数据计算： 皮肤水合度变化率（％) =[皮肤水合度（测试时）-皮肤水合度（对照时）]/皮肤水合度 (对照时）X100%。将实验重复三次，2. Omg/ml普通蚕丝蛋白、2. Omg/ml雄蚕丝蛋白、0· 5， I. 0,2. Omg/ml雌蚕丝蛋白多肽溶液的皮肤水合度率分别提高了为41. 22、36. 11、43. 15、 54. 26、67. 24%。
[0024] 同时，分别取不同浓度的普通蚕丝蛋白2. Omg/ml、雄蚕丝蛋白2. Omg/ml、雌蚕丝 蛋白多肽溶液（0.5,1.0, 2. Omg/ml)以1.25 μ L/cm2涂敷密度短期1次涂敷，轻轻拍打至 吸收，测定12小时后使用前后表皮的水分经皮肤散失，将实验重复三次。初始对照的透皮 失水值分别为 19. Ig/(m2 · h)、19. 5g/(m2 · h)、19. 2g/(m2 · h)、19. 4g/(m2 · h)和 19. 3g/ (m2 · h)使用2. Omg/ml普通蚕丝蛋白、2. Omg/ml雄蚕丝蛋白、0· 5,1. 0, 2. Omg/ml雌蚕丝蛋 白多肽溶液至12h时，透皮失水分别达到14. Og/ (m2 · h)、16. 7g/ (m2 · h)、14. 9g/ (m2 · h)、 12. Ig/(m2 · h)和10. 8g/(m2 · h)，均有不同程度的降低。
[0025] 可见，雌蚕丝蛋白多肽溶液能显著性提高皮肤水合度率，有效地降低皮肤的透皮 水分蒸发，具有保湿的作用，且与较普通蚕丝蛋白和雄蚕丝蛋白相比，效果更好。
[0026] 实施例5
[0027] 抑制酪氨酸酶的实验
[0028] 上海吉尔合成的多肽给药组反应混合物2mL :0.1 M pH6. 8 PBS 0. 9mL加不同浓度 的多肽ImL加0.03%酪氨酸0. lmL。37°C的恒温箱孵育lOmin，加0.1 mL的酪氨酸酶（350u/ mL)水溶液，将溶液混合均匀，置于37°C的恒温箱中反应25min后，用分光光度计于475mm 测定吸光度值；阴性对照组以等体积的蒸馏水代替多肽用分光光度计于475mm测定吸光度 值；阳性对照组用熊果苷代替多肽用分光光度计于475mm测定吸光度值；0.1 M pH 6.8 PBS 按照2005版《中国药典》配制。多肽分为l、5、10mg/mL。同时，以熊果苷（10mg/mL)作为阳 性对照组。抑制率％= (1-给药组/阴性组）*1〇〇% ;每个浓度多肽实验均重复统计学处 理试验数据以均数土标准差（X土s)表示，采用t检验，使用Excel软件做数据分析处理。
[0029]
[0030] 皮肤黑素形成是一个十分复杂的过程，在皮肤黑素的形成过程中由于受到紫外 线、遗传、内分泌、炎症介质、饮食不当等因素的影响，色素代谢异常，皮肤黑素过快增长和 分布不均，就会造成局部皮肤过黑及色素沉着，表现为黄褐斑、雀斑和炎症后色素沉着等。 酪氨酸酶为含Cu离子的氧化酶，其普遍存在于哺乳动物、植物和微生物中，主要参与生物 体内黑色素和其他多酚类物质的形成过程，是生物体合成黑色素的关键酶，酪氨酸酶抑制 剂就是通过抑制酪氨酸酶活性从而抑制黑色素生成，因而可用来预防和治疗色素沉着等。 本发明通过体外实验观察了多肽对酪氨酸酶活性的抑制作用，结果表明不同浓度的多肽液 对酪氨酸酶活性均有抑制作用，且具有显著的量效关系，证实其具有确切的美白祛斑功效。
【主权项】
1. 种雌蚕丝蛋白多肽，其特征在于，序列为HHHISAGIPGMACKKKNVWYRG。2. 根据权利要求1所述雌蚕丝蛋白多肽的制备方法，其特征在于，步骤包括（1)将清 洗、烘干后的雌蚕茧100g剪碎，加入100mL去离子水中；（2)在-80°C速冻；（3)将蚕茧和 水的混合物超声、粉碎；（4)煮沸1-2小时，同时缓慢搅拌；（5)待溶液冷却后，加入水解酶， 在20-40°C反应30-60分钟；（6 )离心2000-3000rpm，5-10分钟，取上清；（7 )采用盐析法， 将蚕丝蛋白沉淀；（8)将沉淀物复溶于pH5. 4-5. 7缓冲液中，脱盐；（9)采用分子筛层析技 术，分尚出分子量为2_3KDa的多肽，即得。3. 根据权利要求书2所述雌蚕丝蛋白多肽的制备方法，其特征在于，步骤（5)中所述的 水解酶是胃蛋白酶、胰蛋白酶、菠萝蛋白酶、生姜蛋白酶或合欢蛋白酶。4. 根据权利要求书2所述雌蚕丝蛋白多肽的制备方法，其特征在于，步骤（7)中所述的 盐析法所用的盐为NH4Cl。5. 根据权利要求书2所述雌蚕丝蛋白多肽的制备方法，其特征在于，步骤（8)中所述 的缓冲液为PBS。6. 根据权利要求书2所述雌蚕丝蛋白多肽的制备方法，其特征在于，步骤（9)中所述的 分子筛为葡聚糖凝胶。7. 根据权利要求书1所述的雌蚕丝蛋白多肽在制备化妆品中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种雌蚕丝蛋白多肽，涉及生物技术多肽制备领域。其序列为HHHISAGIPGMACKKKNVWYRG。制备步骤包括将清洗、烘干后的雌蚕茧100g剪碎，加入100ml去离子水中；在-80℃速冻；（3）将蚕茧和水的混合物超声、粉碎；煮沸1-2小时，同时缓慢搅拌；待溶液冷却后，加入水解酶，在20-40℃反应30-60分钟；离心2000-3000rpm，5-10分钟，取上清；采用盐析法，将蚕丝蛋白沉淀；将沉淀物复溶于pH5.4-5.7缓冲液中，脱盐；采用分子筛层析技术，分离出分子量为2-3KDa的多肽，即得。雌蚕丝蛋白多肽溶液能显著性提高皮肤水合度率，有效地降低皮肤的透皮水分蒸发，具有保湿的作用，且与较普通蚕丝蛋白和雄蚕丝蛋白相比，效果更好。
【IPC分类】C12P21/06, A61Q19/00, A61K8/64, C07K14/435
【公开号】CN105017400
【申请号】CN201510451391
【发明人】罗瑞雪
【申请人】苏州普罗达生物科技有限公司
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2015年7月28日