蛋白多肽类药物n端定点聚乙二醇修饰的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种蛋白多肽类药物N端定点聚乙二醇修饰的方法。
【背景技术】
[0002] 聚乙二醇（PEG)是一种用途极其广泛的人工合成高分子化合物，主要应用于生物 医药、化工、食品、材料科学等众多领域。PEG易溶于水和有机溶剂，具有很好的理化特性和 生物相容性。在生物医药中，PEG因具有两亲性和良好的安全性、生物相容性，且无活性、也 无毒副作用，故作为辅料被广泛应用于药物制剂以及药物的缓释、靶向研宄，还可以通过共 价连接于蛋白质或多肽以改善蛋白、多肽类药物的生物化学特性和药动学性质，甚至用于 小分子药物的修饰。大量研宄表明，经过PEG修饰的多肽与蛋白类药物抗原性明显降低或 消除，稳定性增加，药物半衰期大为延长，疗效更好。
[0003] 为了将聚乙二醇与药物相连接，需要在PEG链的末端连接各种具有活性的官能基 团。其中，聚乙二醇醛类衍生物（PEG醛）对蛋白质N端氨基的定点修饰由于条件温和、修 饰位点均一等优势而获得了广泛的应用，且可用于大多数N端为非活性位点的蛋白多肽类 药物的修饰，是目前最常用的PEG修饰剂之一。
[0004] 目前，报道的制备PEG醛的方法主要有氧化法和缩醛法。氧化法是通过直接氧化 PEG链的末端羟基而获得，例如将氧气加入至PEG和催化剂的混合物中氧化PEG链末端的羟 基为醛基，或者以MnO2等作为氧化剂直接氧化末端羟基，但是在大多数情况下，这些氧化条 件容易导致PEG链的分解。缩醛法是通过在PEG链末端引入缩醛基团随后水解而获得，但 是这种方法所用的反应物原料较为昂贵而不适于商业化。
[0005] 另外现有的很多PEG修饰剂尤其是PEG醛类衍生物由于具有活性基团，其稳定性 较差，为了保证使用时的修饰效率，往往需要很苛刻的储存条件，一旦储存不当，不仅严重 影响对蛋白多肽类药物的修饰效率，而且影响整个生产工艺，给该项技术的产业化带来很 多不确定因素。例如，聚乙二醇乙醛具有较高的反应活性，在制备和储存中极易发生羟醛缩 合反应而导致副产物，产品质量和储存使用均难以得到有效控制，因此，未能得到很好的开 发和利用。中国专利CN200610099081. 0公开了用酰胺键取代烷氧基类型的基团，使聚乙二 醇乙醛类衍生物具有了较高的稳定性，但是该衍生物仍然具有活性较高的醛基而存在不稳 定因素。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是为了解决上述现有技术的不足而提供一种能够得到稳定结构的 聚乙二醇化蛋白多肽类药物的蛋白多肽类药物N端定点聚乙二醇修饰的方法。
[0007] 为了实现上述目的，本发明所设计的蛋白多肽类药物N端定点聚乙二醇修饰的方 法，包括如下步骤：
[0008] (1)将PEG的端羟基转变为活性更高的基团得到PEG活性中间体，然后用PEG活性 中间体与具有邻羟基、α-羟基酸、β-氨基醇或α-氨基酮结构的小分子化合物反应获得 聚乙二醇中间体，所述聚乙二醇中间体的结构式①或②如下：
[0009]
[0010] 其中，η为10~3000的整数，m为0~5的整数；k为2~8的整数，表示聚乙二 醇链的数目；
[0011] R为羟基、烷氧基、芳烷氧基，或者是氨基、羧基、氰基、卤素、环氧化物、马来酰亚 胺、吡啶基二硫化物、对甲苯磺酸酯、甲基磺酸酯、对硝基苯碳酸酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、 N-琥珀酰亚胺基氧、磺基-N-琥珀酰亚胺基氧、马来酰亚胺基、1-苯并三唑基氧、1-咪唑基 氧、对硝基苯基氧的一种或多种；
[0012] X为醚键、硫醚键、氨基键、酰胺键、酯键、硫代酯键、碳酸酯键、氨基甲酸酯键、硫脲 键的一种或多种组成的连接基团，或者是具有双功能官能团的连接基团；
[0013] Y为聚乙二醇中间体的末端基团，具有邻羟基、α -羟基酸、β-氨基醇或α -氨基 酮结构；
[0014] Z为连接多个聚乙二醇链的小分子连接基团，具有多个活性基团，包括苹果酸、柠 檬酸、谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、寡聚氨基酸的一种或多种；
[0015] (2)将聚乙二醇中间体用氧化剂氧化为末端具有活性醛基的聚乙二醇醛类衍生 物，而后用于蛋白多肽类药物N端的定点聚乙二醇修饰，经还原剂的还原胺化作用即可获 得稳定结构的聚乙二醇化蛋白多肽类药物，上述将聚乙二醇活性修饰剂的制备与其对蛋白 多肽类药物的修饰需前后紧密衔接。
[0016] 所述氧化剂为高碘酸或其盐；所述还原剂为氰基硼氢化钠或硼氢化钠。即通过高 碘酸氧化和氰基硼氢化钠还原胺化两个步骤完成对蛋白多肽类药物N端氨基的修饰，将聚 乙二醇中间体氧化后无需繁琐的后处理操作即可直接或是经过简单的超滤、透析等方法除 去小分子杂质后用于蛋白多肽类药物的聚乙二醇修饰，因此，该方法将聚乙二醇活性修饰 剂的制备与其对蛋白多肽类药物的修饰这两个工艺进行紧密衔接。
[0017] 在合成聚乙二醇中间体时，所述PEG活性中间体与小分子之间的连接键是醚键、 硫醚键、氨基键、酰胺键、酯键、硫代酯键、碳酸酯键、氨基甲酸酯键或硫脲键的一种或多种。
[0018] 所述PEG活性中间体上的活性基团包括氨基、羧基、对硝基苯碳酸醋、磺酸酯（优 选甲基磺酸酯和对甲基苯磺酸酯）、膦酸酯（三苯基膦酸酯）、氰基、异氰酸酯、异硫氰酸酯、 硝酸酯、亚硝酸酯、卤素（优选氯和溴）、硫酸酯、卤代硫酸酯、硝酸酯、卤代亚硫酸酯、N-琥 珀酰亚胺基、马来酰亚胺基的一种或多种。所述PEG活性中间体是两端具有相同或不同功 能基团的PEG活性中间体，或是单端封闭的PEG活性中间体。这里优选为单甲氧基聚乙二 醇（mPEG)。
[0019] 所述小分子化合物包括3-氨基-1，2-丙二醇、3-氯-1，2-丙二醇、3-溴-1，2-丙 二醇、2, 3-二羟基丙酸、3-巯基-1，2-丙二醇、二硫苏糖醇、氨基葡萄糖、半乳糖胺、葡萄糖 酸、丝氨酸、苏氨酸、异丝氨酸、3-氨基-2-羟基己酸、4-氨基-5-羟基戊酸、2-氨基-3-羟基 戊酸、2-氨基-3-羟基-3-甲基丁酸、4-氨基-3-羟基丁酸、3-氨基-4-羟基丁酸、1，4-二 胺-2- 丁醇、4-氨基-2-羟基丁酸、酒石酸的一种或多种。
[0020] 上述聚乙二醇中间体可以是直链、双链、多链或者星形、树形、分叉形结构的聚乙 二醇衍生物，该中间体在PEG链的末端引入了邻羟基、α -羟基酸、β -氨基醇或α -氨基酮 等结构，可被高碘酸及其盐氧化而获得相应结构的聚乙二醇醛类衍生物，该氧化反应所用 溶剂为水，条件温和，不会导致PEG链的分解，且反应可以定量完成。显而易见的是，上述聚 乙二醇中间体相对于其氧化产物聚乙二醇醛类衍生物具有更加稳定的结构，有利于储存备 用。
[0021] 上述方法的整个工艺流程均在水溶液中进行，条件温和、操作简便，且所用试剂来 源方便、廉价易得，因此，本发明所涉及的蛋白多肽类药物N端定点聚乙二醇修饰的方法被 认为是一种适合于商业化生产的经济型方法。
[0022] 本发明具有以下明显的优势：
[0023] 1.所制备的聚乙二醇中间体相对于其氧化产物聚乙二醇醛类衍生物要更加稳定， 有利于储存备用；该中间体可以通过比现有方法更加经济、简单的方法来获得具有修饰活 性的聚乙二醇醛类衍生物。
[0024] 2.通过氧化-还原胺化法对蛋白多肽类药物N端定点聚乙二醇修饰的方法，将聚 乙二醇中间体的活化（即聚乙二醇醛类衍生物的制备）与其对蛋白多肽类药物的修饰这两 个工艺进行紧密衔接，不仅可避免很多聚乙二醇醛类衍生物因储存不当容易失效的问题， 而且是一种短周期、低成本、高效率的聚乙二醇化新技术。
【附图说明】
[0025] 图1为聚乙二醇中间体mPEG20000-Ser经氧化-还原胺化法对尿酸酶的聚乙二醇 修饰的SDS-PAGE的结果；
[0026] 图中：A为碘液染色的结果，B为考马斯亮蓝染色的结果；
[0027] 1 为蛋白 Marker，分子量为 14. 0、25· 0、30· 0、40· 0、50· 0、70· 0 和 100kD，
[0028] 2为未被PEG修饰的尿酸酶，3为经PEG修饰的尿酸酶。
【具体实施方式】
[0029] 下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
[0030] 实施例1 :
[0031] 本实施例的蛋白多肽类药物N端定点聚乙二醇修饰的方法，包括如下步骤：
[0032] (1)将PEG的端羟基转变为活性更高的基团得到PEG活性中间体，然后用PEG活性 中间体与具有邻羟基、α-羟基酸、β-氨基醇或α-氨基酮结构的小分子化合物反应获得 聚乙二醇中间体；具体本实施例中采用的PEG活性中间体由单端封闭的PEG的端羟基转变 为活性更高的基团而制得。本实施例中选为单甲氧基聚乙二醇（mPEG5000,平均相对分子量 为5000)。将mPEG5000的端羟基转变为对硝基苯碳酸酯获得PEG活性中间体，然后与小分 子化合物4-氨基-2-羟基丙酸进行反应得到聚乙二醇中间体mPEG5000-羟基酸，其结构式 为
其中η平均为113，m为2, R为甲 氧基，X为氨基甲酸酯键，Y为α -羟基酸结构。
[0033] (2)将聚乙二醇中间体mPEG5000-羟基酸用高碘酸钠氧化为末端具有活性醛基的 聚乙二醇醛类衍生物，而后用于蛋白多肽类药物N端的定点聚乙二醇修饰，经氰基硼氢化 钠的还原胺化作用即可获得稳定结构的聚乙二醇化蛋白多肽类药物，上述将聚乙二醇活性 修饰剂的制备与其对蛋白多肽类药物的修饰需前后紧密衔接。
[0034] I. 1聚乙二醇中间体mPEG5000-羟基酸的制备 [0035] 反应式：
[0036]
[0037] 取0. 205g氯甲酸对硝基苯酯溶于IOmL无水二氯甲烷中，加入0. 123g 4-二甲氨 基吡啶（DMAP)搅拌，然后Ih内滴加5g mPEG5000的二氯甲烷溶液（15mL)，室温反应至溶液 完全澄清。然后加入0. 56g 4-氨基-2-羟基丙酸，室温反应20h。反应结束后，用lmol/L 盐酸洗涤有机相3次，再用饱和氯化钠溶液洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤浓缩后用 冷却无水乙醚沉淀，抽滤后真空干燥，得白色粉末4. 32g，收率86. 4%。
[0038] 1. 2聚乙二醇中间体mPEG5000-羟基酸的氧化及其对胸腺素的修饰
[0039] 反应式：
[0040]
[0041] 取上述产物mPEG5000-羟基酸适量，用0. lmol/L磷酸缓冲液（pH5. 0)配制 成5. 0 X ΙθΛιοΙ/L的溶液，再用0. lmol/L磷酸缓冲液（pH5. 0)分别配制胸腺素溶液 (I. 25X 10_4mol/L)、高碘酸钠溶液（0. 05mol/L)和氰基硼氢化钠溶液（0. 02mol/L)。
[0042] 取mPEG5000-羟基酸的溶液400 μ L，加入高碘酸钠溶液8 μ L，室温避光搅拌2h后 加入乙二醇5 μ