专利名称：一种靶向蛋白-聚乙二醇-抗癌药物连接物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种具有靶向功能的水溶性的靶向蛋白-聚乙二醇-抗癌药物连接物 及其制备方法。
背景技术：
癌症号称人类“杀手”，开发和研制高效低毒的抗癌药物是人类所面临的重大挑 战。目前化疗仍然是临床上治疗癌症的主要途径之一，然而许多常用的化疗药物例如紫杉 醇、喜树碱类似物等，由于水溶性极低，生物利用度低，制剂开发困难；再加上选择性差、细 胞毒性过高、体内代谢快等缺点，大大限制了这些药物的临床应用。为克服上述缺陷，寻找 新的、有效的治疗肿瘤的化疗药物仍然是研究者关注的热点。抗癌药物的聚乙二醇化就是 其中一种，如紫杉醇、喜树碱、多柔比星等抗癌药的聚乙二醇化[Veronese F Met al :Exp. Opin.Ther. Patents,2004，14(6) :859-894.]。当PEG分子与药物分子偶联，得到PEG修饰的药物分子，不仅改善药物溶解性和 体内生物分布行为，在其修饰的药物周围产生空间屏障，减少药物的酶解，降低其在肾脏的 排泄速率，增加药物滞留时间，而且所形成的大分子连接物可因增强渗透和滞留(enhanced permeability and retention effect, EPR)效应,对肿瘤组织起到被动靶向作用[Duncan R et al =Nat Rev Drug Discov，2003，2 :347-360]。因此抗癌药物经聚二醇修饰后，往往会 具有以下优点良好的肿瘤靶向性、更好的溶解性、更长的半衰期、血药浓度波动较小、较低 的最大血药浓度、较小的毒性等，大大改善化疗药物毒性大、无选择性、难溶等缺点。为了进一步提高PEG修饰小分子抗癌药物后对肿瘤的靶向作用，有必要 再偶联一个具有主动靶向作用的分子。主要策略是设计一种异双功能PEG衍生物 (Heterobifunctional PEG)，利用其一端连接抗癌药，另一端连接具有主动靶向作用的分 子。通常利用肿瘤细胞过度表达的受体(如转铁蛋白受体)或者特异抗原，选择这些受体 的配基(如转铁蛋白、转铁蛋白受体的抗体等)或者抗原的抗体(如人源单克隆抗体、抗体 片段等)作为主动靶向肿瘤的分子，然后通过受体介导或抗原-抗体结合介导的内吞作用 增强药物肿瘤细胞靶向释药。异双功能PEG衍生物(Heterobifunctional PEG)，结构通式为A-PEG-B，其中 A、B是不同的功能团，可分别与两个具有不同特性的大分子相连接。这样的异端双功能 基PGE衍生物可用作连接两个分子的亲水、生物相容的间隔物。异双功能聚乙二醇衍生 物的合成主要有两种方法[M. S. Thompson et al =Polymer 49(2008) :345-373]第一禾中 方法是开环聚合法(以环氧乙烷直接合成)，是利用一种异双功能的阴离子引发剂引发环 氧乙烷开环聚合，然后用另一种官能团终止反应。第二种方法是末端修饰法(End Group ModificationFrom PEG)，是将PEG两端的羟基部分衍生化，通过分离纯化得到异双功能衍 生物，例如NHS-PEG-MAL，一端为琥珀酰亚胺酯(NHS)活泼酯，可以与药物分子偶联 ’另一端 为马来酰亚胺基(MAL)，可与巯基化的靶向蛋白连接，在靶向给药研究中经常使用[Benoit Frisch et al :Bioconjugate Chem，1996，7(2) :180-186 ；Aimee Guider Paige et al Pharmaceutical Researchl995,12(12) :1883-1888]。转铁蛋白(transferrin，Tf)是一类广泛存在于脊椎动物体液及其细胞中的单体 糖蛋白家族，包含血清转铁蛋白、卵转铁蛋白、乳铁蛋白和黑素转铁蛋白，其中以血清转铁 蛋白含量最高，且分布广泛。成熟的Tf由679个氨基酸组成，分子质量约80kDa。Tf主要 在肝脏合成，其主要作用是运载细胞外的铁，通过细胞膜Tf受体(FfR)介导的内吞作用， 将铁转入细胞。恶性肿瘤表面TfR的超量表达提供了转铁蛋白作为肿瘤导向分子靶向转 运抗癌药的可能性，如Tf肿瘤靶向转运阿霉素、正定霉素等[Li et al =Trends Pharmacol Sci,2002,23(5) :206-209, Singh et al =Anticancer Res,1998,18(3A) :1323-1427, Kratz et al :Bioorganic&MedicinalChemistry Letters, 1997, 7 (5) :617-622]。甲胎蛋 白(alpha-fetoprotein)是一种主要癌胚蛋白，它是肿瘤细胞过量表达癌胚蛋白受体的一 种配基，已有人使用甲胎蛋白靶向释放顺钼至肿瘤(Severin SE, et al, BiochemMol Biol Int,1995,37 :385-392).抗癌的单克隆抗体主要是免疫球蛋白G(IgG)类的抗体，每个单抗含有2个相同重 链和2个相同轻链，两个重链之间通过二硫键相连。每个重链分成Fab部分和Fc部分，其 中Fab部分又分为可变区片段(VH)和恒定区片段，轻链与重链Fab部分通过二硫键相连， 构成抗体Fab片段，是识别和结合抗原的区域，现代研究表明抗体中抗原识别和结合域主 要由重链可变区链(VH)和轻链可变区链(VL)连接构成，使用生物工程技术可将VH和VL通 过人工接头连接成各种单链抗体。单克隆抗体、抗体Fab片段和单链抗体靶向释放化疗抗 癌药物已有许多研究报道(Milenic DE. Curr Pharm Des. 2002,8 :1749-1764 ；Kontermann RE, CurrOpin Mol Ther. 2006,8(1) :39-45.)本发明利用PEG作为药物载体的优良性能以及靶向蛋白主动靶向功能，来克服抗 肿瘤药物临床应用中存在的溶解性差、选择性低、毒副作用大等问题，发明一种具有主动和 被动肿瘤靶向功能的靶向蛋白-聚乙二醇-抗癌药物连接物。
发明内容
本发明的目的是提供一种靶向蛋白-聚乙二醇-抗癌药物连接物及其制备方法。本发明是以肿瘤特异的配体或抗体作为靶向蛋白，双功能PEG衍生物为中间基 团，与抗肿瘤药物结合制备成具有被动靶向和主动靶向双重功能的转铁蛋白-聚乙二 醇-抗癌药物连接物，具有以下通式TP-X-PEG-Y-G其中，TP是能与癌细胞特异结合的各种蛋白质，包括与癌细胞受体结合的蛋白质 配基分子(如转铁蛋白或转铁蛋白受体抗体、癌胚蛋白或癌胚蛋白受体抗体等)和与癌细 胞抗原结合的抗体或抗体片段(如各种人源单克隆抗体、抗体Fab片段或单链抗体等)，这 些TP靶向蛋白可通过以下试剂进行巯基化，这些试剂包括2-亚氨基硫烷盐酸(Traut’ s试 剂)、3-(2_吡啶二硫代)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(SPDP)、甲基-4-巯基丁酰亚胺、S-乙酰巯 基丁二酸酐(SAMSA)等，优选的巯基化试剂为2-亚氨基硫烷盐酸(Traut’ s试剂)；交联 剂X为一端是马来酰亚胺基团另一端是琥珀酰亚胺基团的异双功能交联剂，例如3-马来酰 亚胺基丙酸羟基琥珀酰亚胺酯(Mal-3-NHS、MPS)、4_马来酰亚胺基丁酸N-琥珀酰亚胺酯 (Mal-4-NHS、GMBS)、6_(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯(Mal_6_NHS、EMCS)、琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧基-(6-氨基己酸酯)(LC-SMCC)等，优选的交 联剂X为3-马来酰亚胺基丙酸羟基琥珀酰亚胺酯(Mal-3-NHS、MPS) ；PEG为具有-(OH2CH2O) η-重复结构的异双功能聚乙二醇衍生物，聚乙二醇平均分子量为I 20KDa，η为45 450，优选分子量为2KDa和4KDa ；连接臂Y是能够将两个末端羟基连接起来的饱和或不饱 和的环状酸酐，例如丁二酸酐、戊二酸酐、马来酸酐等，优选的连接臂Y为丁二酸酐；抗肿瘤 药物G为末端带有羟基且分子量小于0. 5KDa的小分子抗癌药物，包括喜树碱、10-羟基喜树 碱、7-乙基-10羟基喜树碱(SN38)、紫杉醇、多西紫杉醇等，优选的药物分子是7-乙基-10 羟基喜树碱(SN38)。本发明所涉及的靶向蛋白-聚乙二醇-抗癌药物连接物是通过异双功能PEG衍生 物(例如一端为胺基另一端为羟基的聚乙二醇衍生物)的一端与巯基化的靶向蛋白共价连 接，另一端与抗肿瘤药物共价连接，进而形成的。本发明涉及靶向蛋白-聚乙二醇-抗癌药物连接物的制备方法，包括以下步骤(1)H0-PEG_NH2 的制备首先以PEG和对甲苯磺酰氯(TsCl)为原料，二氯甲烷为溶剂，Ag2OAI为催化剂， 室温搅拌数小时，得到的HO-PEG-OTs (I)。再加入氯化铵，浓氨水，30°C搅拌数天。硅胶柱层 析法分离纯化硅胶300-400目，湿法装柱，干法上样，梯度洗脱，得到H0-PEG-NH2(II)。(2) Mal-PEG-COOH 的制备以H0-PEG-NH2为原料，无水二氯甲烷为溶剂，Mal-3-NHS (MPS)为交联剂，三 乙胺(TEA)为催化剂，室温搅拌过夜，异丙醇重结晶，真空干燥得Mal-PEG-OH(III)。 再加入丁二酸酐，二氯甲烷为溶剂，TEA为催化剂，室温搅拌过夜，异丙醇重结晶，得 Mal-PEG-COOH(IV)。(3) Mal-PEG-抗癌药的制备以Mal-PEG-COOH和抗癌药为原料，无水氯仿为溶剂，无水吡啶和二氯磷酸苯 酯为催化剂，N 2保护下，室温避光搅拌Mh，异丙醇重结晶，硅胶柱层析分离纯化，得 Mal-PEG-抗癌药(V)。 (4) TP-PEG-抗癌药的制备首先将TP进行巯基化。以靶向蛋白TP和Traut’ s试剂为原料，pH8. 5的缓冲液 中反应，室温避光轻微搅拌lh。超滤离心法进行浓缩和纯化，得到TP-SH溶液(VI)。再加 入Mal-PEG-抗癌药(V)，在pH7. 0的PBS液中反应，4°C避光轻微搅拌12h。超滤离心法进 行浓缩和纯化。加入冻干保护剂，冷冻干燥，即得TP-PEG-抗癌药(VII)。以TP-PEG-SN38为例，本发明靶向蛋白-聚乙二醇-抗癌药连接物合成的流程为
权利要求
1.一种靶向蛋白-聚乙二醇-抗癌药物连接物，其特征在于具有以下通式TP-X-PEG-Y-GTP为靶向癌细胞的蛋白质。X为连接巯基与胺基的交联剂；PEG为具有-(OH2CH2O)n-重复结构的聚乙二醇及其衍生物；Y为连接两个羟基连接臂；G为小分子抗癌药物。
2.按权利要求1所述的靶向蛋白-聚乙二醇-抗癌药物连接物，其特征在于所述的TP 靶向蛋白是能与癌细胞特异结合的各种蛋白质，包括与癌细胞受体结合的蛋白质配基分子 (如转铁蛋白或转铁蛋白受体抗体、癌胚蛋白或癌胚蛋白受体抗体等)和与癌细胞抗原结 合的抗体或抗体片段(如各种人源单克隆抗体、抗体Fab片段或单链抗体等)，这些TP靶 向蛋白通常是通过以下试剂转化成为其巯基化衍生物，这些试剂包括2-亚氨基硫烷盐酸 (Traut' s试剂),3-(2-吡啶二硫代)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(SPDP)、甲基4-巯基丁酰亚 胺、S-乙酰巯基丁二酸酐(SAMSA)等，优选的巯基化试剂为2-亚氨基硫烷盐酸(Traut’ s 试剂)。
3.按权利要求1所述的靶向蛋白-聚乙二醇-抗癌药物连接物，其特征在于所述的交 联剂X是一端为马来酰亚胺基团另一端为琥珀酰亚胺基团的异双功能交联剂，包括3-马来 酰亚胺基丙酸羟基琥珀酰亚胺酯(Mal-3-NHS、MPQ、4_马来酰亚胺基丁酸N-琥珀酰亚胺酯 (Mal-4-NHS、GMBS)、6_(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯(Mal_6_NHS、EMCS)、琥珀酰亚 胺-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧基-(6-氨基己酸酯)(LC-SMCC)等，优选的交 联剂为3-马来酰亚胺基丙酸羟基琥珀酰亚胺酯(Mal-3-NHS、MPS)。
4.按权利要求1所述的靶向蛋白-聚乙二醇-抗癌药物连接物，其特征在于所述的 PEG聚乙二醇是异双能的聚乙二醇衍生物，例如一端为胺基另一端为羟基的聚乙二醇衍生 物等，其中聚乙二醇平均分子量为2000-20000Da，η为45 450，优选分子量为2000Da和 4000Dao
5.按权利要求1所述的靶向蛋白-聚乙二醇-抗癌药物连接物，其特征在于所述的连 接臂Y是能够将两个不同分子中羟基连接起来的饱和或不饱和环状酸酐，包括丁二酸酐、 戊二酸酐、马来酸酐等，优选的连接臂为丁二酸酐。
6.按权利要求1所述的靶向蛋白-聚乙二醇-抗癌药物连接物，其特征在于所述的抗 肿瘤药物G为末端带有羟基且分子量小于500Da的小分子抗癌药物，包括喜树碱、10-羟基 喜树碱、7-乙基-10羟基喜树碱(SN38)、紫杉醇、多西紫杉醇等，优选的药物分子是7-乙 基-10羟基喜树碱(SN38)。
全文摘要
本发明公开了一种水溶性的具有靶向功能的靶向蛋白-聚乙二醇-抗癌药物连接物及其制备方法。本发明的靶向蛋白-聚乙二醇-抗癌药物连接物的特征在于改善抗肿瘤药物的溶解性，延长药物的体内半衰期，通过大分子连接物被动靶向肿瘤作用和靶向蛋白特异结合肿瘤细胞的主动靶向肿瘤作用，将抗癌药物选择性地靶向释放至肿瘤细胞。本发明连接物制备方法的特征在于以聚乙二醇为原料，合成一端为羧基、另一端为马来酰亚胺基的异双功能聚乙二醇衍生物，利用该衍生物羧基端与抗癌药共价连接，马来酰亚胺基端与靶向蛋白共价连接，得到靶向蛋白-聚乙二醇-抗癌药物连接物。
文档编号A61K47/48GK102145176SQ20111008898
公开日2011年8月10日 申请日期2011年4月11日 优先权日2011年4月11日
发明者张云坤, 栾立标 申请人:中国药科大学