用于治疗癌症的抗新血管系统制剂的制作方法

专利名称：用于治疗癌症的抗新血管系统制剂的制作方法
背景技术：
相关领域的描述尽管生物医学有了很大进步，但是癌症的治疗仍然颇具挑战性。近年来，已描述了两种极具前景的治疗方法治疗性疫苗和抗血管生成。
治疗性疫苗基于对癌组织的观察，所述癌组织通常表达某些抗原，总起来说优选肿瘤相关抗原(TuAA)。TuAA包括通常由癌症起源的组织选择性表达的蛋白质(分化抗原)，与癌症的不同发展阶段有关的蛋白质(胎性癌和睾丸癌(cancer-testis)抗原)，由畸变染色体重排产生的蛋白质，或者来源于致癌病毒的蛋白质。然后将这些TuAA，或其片段用作疫苗中的免疫原，以刺激细胞免疫杀灭肿瘤细胞，特别是细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的细胞免疫。
抗血管生成方法利用肿瘤需要补充血液供给以维持其持续生长。为此，肿瘤会分泌能促进新血管生长的血管生成因子。这种抗血管生成方法的目的是破坏肿瘤的养分提供，使其死亡，或至少限制其生长。对这种方法的研究已经找到了可直接针对各种抗血管生成因子以及血管生成的化学治疗药物。
发明概述此处公开的本发明涉及设计用于刺激靶向肿瘤相关新血管系统(TuNV)的细胞免疫应答的组合物。在本发明的一个实施方案中，该组合物刺激CTL反应。这种组合物可含有一个或多个靶抗原的表位。这个实施方案的一个方面具体地含有一个管家表位，另外具体地含有一个免疫表位或表位簇，另一个方面具体地结合管家表位和免疫表位。
本发明的实施方案涉及利用前列腺特异性膜抗原(PSMA)作为该组合物的靶抗原。该实施方案的各个方面包括来源于PSMA的各种表位，这些表位直接以多肽形式，或以一种能够表达表位的核酸形式存在。其它的实施方案涉及其它TuNV相关抗原的利用。
在本发明的其它实施方案中，通过将两种来源的免疫原组合为单一制剂或方法或治疗，组合物直接靶向由癌细胞表达的TuNV和TuAA。
将免疫的T细胞继承转移到SCID小鼠中，可以实现对本发明组合物的临床前评估，所述小鼠体内带有形成自移植的人皮肤微血管内皮细胞(HDMEC)的微血管系统。还可以通过组合物免疫的HLA转基因小鼠实现临床前的评估，所述组合物由小鼠和人之间保守的表位组成。
本发明的实施方案涉及评价细胞介导的免疫的方法。该方法可包括下述步骤将血管细胞移植到免疫缺陷的哺乳动物体内；在该哺乳动物体内形成免疫应答；并测定特征以确定该哺乳动物体内的细胞介导的免疫。例如，该细胞介导的免疫可以直接靶向新血管系统抗原。该新血管系统抗原可以被肿瘤相关的新血管系统优先地表达，例如，在优选的实施方案中可以是前列腺特异性膜抗原(PSMA)，血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)等等。这个建立的步骤可例如，通过将T细胞继承转移到哺乳动物体内，通过用抗原接触该哺乳动物等方式完成。该细胞介导的免疫可由细胞毒性T淋巴细胞介导。血管细胞可以是血管内皮细胞，如人皮肤微血管内皮细胞(HDMEC)，端粒酶转化的内皮细胞，等等。免疫缺陷的哺乳动物可以是小鼠，如SCID小鼠。表征步骤可包括评定参数，如血管形成，血管破坏，血管密度，输送宿主哺乳动物血液的血管比例等等。
该方法还可进一步包括将肿瘤细胞或肿瘤组织移植到小鼠体内的步骤。该表征步骤可包括评定参数，如肿瘤的存在，肿瘤生长，肿瘤大小，肿瘤出现的速度，抑制或防止肿瘤形成所需要的疫苗剂量，肿瘤血管形成，在肿瘤中坏死组织的比例等等。
该方法可进一步包括提供哺乳动物第一群体和哺乳动物第二群体的步骤；在第一群体中形成细胞介导的免疫；在第二群体形成不同的细胞介导的免疫；并且将获自哺乳动物第一群体的结果与获自哺乳动物第二群体的结果相比较。第一群体细胞介导的免疫可包括如原初免疫和对无关表位的免疫等等。
其它实施方案涉及评价细胞介导的免疫的方法，包括针对新血管系统抗原的免疫。该方法可包括以下步骤将MHC转基因肿瘤细胞移植或注射到MHC转基因哺乳动物中；在该哺乳动物体内形成免疫应答；并测定特征以确定该哺乳动物体内细胞介导的免疫。MHC转基因哺乳动物可以是HLA转基因哺乳动物，如HLA-A2转基因哺乳动物。在优选的实施方案中，该哺乳动物可以是小鼠。可通过接种疫苗形成细胞介导的免疫，在优选的实施方案中，例如，可以在肿瘤细胞的转移之前，其同时或其之后进行接种疫苗。在优选的实施方案中，该细胞介导的免疫可由细胞毒性T淋巴细胞介导。新血管系统抗原可以被肿瘤相关新血管系统优先地表达，该抗原也可以是肿瘤相关抗原。优选地，该抗原可以是纤连蛋白的ED-B结构域。该表征步骤可以包括，例如评价参数，包括肿瘤的存在，肿瘤的生长，肿瘤的大小，肿瘤出现的速度，抑制或防止肿瘤形成所需要的疫苗剂量，肿瘤的血管化，该肿瘤内部坏死组织的比例等等。该方法可以进一步包括以下步骤提供哺乳动物的第一群体和哺乳动物的第二群体；在第一群体内形成细胞介导的免疫；在第二群体内形成不同的细胞介导的免疫；并将获自哺乳动物第一群体的结果与获自哺乳动物第二群体的结果相比较。第一群体的细胞介导的免疫可包括原初免疫，对无关表位的免疫等等。
另外的实施方案涉及治疗肿瘤疾病的方法，包括免疫哺乳动物以诱导针对抗原的细胞免疫应答的步骤，所述抗原由肿瘤相关的新血管系统差异(differentially)表达。差异表达的抗原可以是蛋白质，如前列腺特异性膜抗原，血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)等等。在其它优选的实施方案中，该抗原可以是纤连蛋白的ED-B结构域。例如，可以用来源于该蛋白质序列的至少一种肽进行免疫，或者用能够表达该蛋白质或肽的核酸进行免疫等。所述的至少一种肽可以包括管家表位，例如在优选的实施方案中，可以是与所述管家表位共C末端的。这些方法还可包括至少一个额外的肽，其中所述至少一个额外的肽包括免疫表位。这些方法可包括一个额外的步骤，在其中哺乳动物用直接靶向癌细胞的抗肿瘤治疗活性物质进行处理。抗肿瘤治疗可以是靶向肿瘤相关抗原的免疫。优选地，该细胞免疫应答可以包括CTL反应。
其它实施方案涉及免疫原性的组合物。这些免疫原性组合物可以包括至少相应于一种抗原的一个免疫原，所述抗原由肿瘤相关新血管系统表达，其中组合物可以诱导细胞免疫应答。免疫原可以与受体同种细胞没有联系。抗原可以是蛋白质，如前列腺特异性膜抗原，血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)，等等。在其它优选的实施方案中，抗原可以是纤连蛋白的ED-B结构域。该免疫原可以包括至少一种肽。这些组合物可以包括一种能够表达抗原的核酸，其中所述抗原是一种蛋白质或一种肽。这些组合物可包括至少一种含有管家表位的肽，在优选的实施方案中，所述的至少一种肽可以是与所述管家表位共C末端的。另外，这些组合物还可另外含有至少一种带有一种免疫表位的肽。这些组合物可含有至少一种相应于肿瘤相关抗原的免疫原。在优选的实施方案中，细胞免疫应答可以包括CTL反应。
实施方案涉及抗肿瘤疫苗的设计方法。该方法可含有以下步骤鉴定由肿瘤相关新血管系统差异表达的抗原；并将该抗原组分合并到一疫苗中。该组分可以包括例如该抗原的多肽片段，编码该抗原或抗原片段的核酸等。
其它的实施方案涉及研究模型的制造方法。这些方法可包括将血管细胞和肿瘤细胞移植到免疫缺陷的哺乳动物中。肿瘤细胞和血管细胞可被移植成彼此靠近的位置。血管细胞可以是血管内皮细胞，比如HDMEC。在优选的实施方案中，血管内皮细胞可被端粒酶转化。免疫缺陷的哺乳动物可以是小鼠，如SCID小鼠。
其它实施方案涉及研究模型。这些研究模型可包括免疫缺陷的哺乳动物。该哺乳动物可含有移植的血管细胞和移植的肿瘤细胞。血管细胞和肿瘤细胞可被移植成彼此靠近的位置。
附图简述

图1A，B和C显示PSMA163-192蛋白酶消化在T＝60分钟时间点等分试样的N-末端池测序(pool sequencing)结果。
图2显示HLA-A2PSMA168-177和HLA-A2PSMA288-297与对照的结合曲线。
图3显示PSMA281-310蛋白酶消化在T＝60分钟时间点等分试样的N-末端池测序结果。
图4显示HLA-A2PSMA461-489，HLA-A2PSMA460-469，和HLA-A2PSMA663-671和对照的结合曲线。
图5显示检测PSMA463-471反应性的HLA-A1+CD8+T细胞的基于γ-IFN的ELISPOT试验的结果。
图6显示利用抗HLA-A1mAb阻断T细胞的反应活性，说明HLA-A1的限制性识别，所述T细胞为图10中所用的T细胞。
图7显示HLA-A2PSMA663-671和对照的结合曲线。
图8显示HLA-A2PSMA662-671和对照的结合曲线。
图9显示来自用ED-B 29-38肽免疫的HHD-A2小鼠的CTL表位特异性溶解作用。
优选实施方案的详细描述此处公开的本发明的实施方案提供了针对肿瘤的新血管系统的组合物，组合物或疫苗的设计方法，以及涉及产生细胞免疫应答，优选T细胞应答，更优选CTL应答的治疗方法。这些方法以及组合物可特别用于治疗及预防癌症。其它实施方案涉及组合物评价模型。
组合物，组合物的设计，以及使用组合物进行治疗本发明的实施方案涉及针对肿瘤新血管系统(TuNV)的免疫原性组合物，包括疫苗，用于产生细胞免疫应答，特别是T细胞应答和具体地，CTL应答。“肿瘤新血管系统”广义地包括在肿瘤块之中或其周围发现的任何血管系统，维持肿瘤生长或肿瘤生长所必需的血管系统等等。应当指出，而且本领域技术人员可以理解，虽然本文的讨论通常涉及肿瘤和肿瘤新血管系统，但本发明的实施方案还可被用于与不合适的血管生成相关的其它病情或疾病。
到目前为止，抗肿瘤疫苗的设计已经集中于恶性细胞本身所表达的抗原。然而，较大的肿瘤是非常复杂的结构，并不是简单的细胞均质体。所有的细胞，特别是快速生长的细胞，需要供给营养(氧，葡萄糖，氨基酸，等等)，以及除去代谢废物的手段，以保持代谢的活性以及完整性。这通常是通过血液和淋巴流动通过各种身体器官而实现。在细胞水平上，身体的组织被一层精细的毛细血管-微小的血管网络渗透，通过它们可以在细胞周围通过扩散互相交换营养和废物。扩散在相对较短的距离内有效。毛细血管床分布十分广泛，细胞通常都位于其附近，只有少数细胞远离毛细血管。如果肿瘤仅仅通过其本身恶性细胞的繁殖而生长的话，那么不久，在肿块内部的那些细胞将不能维持其本身。实际上，未血管化的肿瘤内部经常含有坏死组织。因此，为了不受抑制地生长，肿瘤会分泌出能促进新血管向内生长即TuNV的因子。由于TuNV会表达使其与其它组织区别开的抗原，就可以用针对TuNV的治疗性组合物治疗癌症，而不是直接靶向癌细胞本身。适当的TuNV抗原可以包括，例如那些通常在新血管系统中表达或由TuNV优先表达的抗原。
在本发明的一些实施方案中，组合物可含有例如表位肽或肽。可将免疫表位嵌入表位簇和蛋白质片段。管家表位可具备适当的C-末端。在本发明的其它实施方案中，例如，组合物可含有能够在pAPC上表达这些表位的核酸。
在优选的实施方案中，组合物可直接施用给接受治疗的哺乳动物的淋巴系统。这可应用于多肽和基于核酸的组合物。这种类型的给药方法以及相关技术已公开在美国专利申请号09/380,534，其于1999年9月1日提交，以及于2001年2月2日提交的其部分连续申请；美国专利申请号09/776,232，两者的名称为“A METHEOD OF INDUCING A CTLRESPONSE”。
在一个优选的实施方案中，通过本发明组合物的作用破坏肿瘤中的血管，可以除去肿瘤中的所有细胞。然而，小的肿瘤，包括微小转移瘤在内，典型地是非血管化的。另外，已经报道了有些未血管化的肿瘤，它们并非明显地依赖通过渗透肿瘤块的管道的血流(Maniotis A.J等，Am.J.Pathol.155739-752，1999)。因此，在其它实施方案中，这些组合物通常有效作为可能不会消除所有的癌细胞的肿瘤控制剂。因此，本发明提供各种手段用于消除肿瘤，控制肿瘤生长，减少肿瘤负荷，改善整体临床状况等等。在一些实施方案中，期望将该组合物与其它直接靶向癌细胞的治疗相结合。另外，有证据说明肿瘤内的血管系统本质上可以是由内皮细胞及癌细胞组成的嵌合体(Chang Y.S.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9714608-14613，200)。因此，在本发明的一些实施方案中，可在组合物治疗过程后，给药生物或化学治疗剂。在特别优选的实施方案中，治疗可包括在给药抗TuNV组合物的同时或之后，给药抗TuAA的组合物。
如上所述，这些组合物适用的TuNV抗原可包括例如通常在新血管系统内表达的或由TuNV优先表达的那些抗原。发现TuAA的各种技术是本领域公知的。这些的技术的实例包括但不限于示差杂交和扣除杂交，包括使用微矩阵；克隆表达；SAGE(基因表达连续分析)；SEREX(重组表达克隆抗原的血清学鉴定)；原位RT-PCI；免疫组织化学(如对于PSMA)；EST分析；各种利用大部分或部分，和/或显微解剖的组织等等。这些以及其它方法的利用给予了本领域技术人员鉴定靶细胞内部包含的可能被用作免疫原性组合物的抗原的基因和基因产物所必需的技术。无论靶细胞是癌细胞还是内皮细胞，这些即使都适用于发现TuAA。可仔细检查任何被鉴定的抗原的表位，该表位可用于本发明的实施方案中。
构成血管系统内层的内皮细胞可以表达管家蛋白酶体(housekeepingproteasomes)。因此，相应于管家蛋白酶体(即管家表位)的消化产物，靶向内皮细胞的组合物可以由肽，或者能够表达该肽的核酸组成。IFN-γ，其由免疫系统活化的细胞分泌，可以诱导免疫蛋白酶体在靶细胞中表达。通常，免疫蛋白酶体存在于专业抗原呈递细胞(pAPC)中。因此，它可以有助于将免疫表位或表位簇包容在CTL诱导组合物中，以确保无论靶细胞处于什么位置，CTL都能识别靶细胞。这对于易于呈现抗原呈递功能的内皮细胞特别理想。这些概念在下述文件中被更完整地解释2000年4月28日提交的美国专利申请号09/560,465，2001年11月7日提交的申请号10/005,905；和它的连续申请，2001年12月7日提交的美国申请号＿＿＿＿＿，代理人记录号(attorney docket number)CTLIMM.21CP1C，每个名称均为“EPITOPE SYNCHRONIZATION INANTIGEN PRESENTING CELLS”。
如上所述，免疫原性组合物，包括在优选的实施方案中的疫苗，都可包括例如TuNV抗原和表位。这些表位可包括一个或多个管家表位和/或一个或多个免疫表位。可利用美国专利申请号09/561,074公开的方法鉴定用于组合物的特定表位，该申请名称为“METHOD OF EPITOPEDISCOVERY”，申请日为2000年4月28日。例如，可将已知的或预测能够结合某些MHC限制性元件的肽序列，与由蛋白酶消化产生的片段相比较，以鉴定具有共同C末端的肽。
可用于本发明实施方案的表位，包括ED-B和PSMA的表位的实例在下述文件中公开美国临时专利申请号＿＿，名称为“EPITOPESEQUENCES”，代理人记录号CTLIMM.027PR；与这个申请同日提交，2002年3月7日，以及两个美国临时专利申请，每个名称为“EPITOPESEQUENCES”；申请号60/282,211，2001年4月6日提交，以及60/337,017，于2001年11月7日提交。将这些申请的每一个全文并入本文作为参考。
PSMA是TuAA的一个实例，可在一些实施方案中作为靶物质。PSMA在大多种肿瘤类型的新血管系统中表达，而不是由正常组织的血管内皮表达(Chang S.M.等，Cancer Res.59(13)3192-8，1999；Clin CancerRes.102674-81，1999)。PSMA是一种膜抗原，同样，可以用单克隆抗体(mAb)攻击表达PSMA的TuNV。然而，mAb治疗癌症的效果已经显示，该方法比起初预期的要困难得多。而且，由于发现其它抗原与TuNV相关联，很可能其中许多抗原会证实不在血管系统的表面表达，使得这些抗原难以受到mAb的攻击。
另一方面，T细胞，尤其CTL，通过主要组织相容性复合体(MHC)限制的抗原呈递过程来检验细胞内部组分的表达。用于测定抗自身抗原的T细胞活化疫苗以及组合物的效率的参数十分精细。一些涉及合理的表位选择的关键特性和参数公开在美国专利申请号09/560,465，名称“EPIIOPE SYNCHRONIZATION IN ANTIGEN PRESENTING CELLS”，于2001年4月28日提交；美国专利申请号09/561,074，名称“METHOD OF EPITOPEDISCOVERY”，于2001年4月28日提交；以及美国专利申请号09/561,571，名称为“EPITOPE CLUSTERS”，于2001年4月28日提交。促进表位同步化的DNA疫苗的设计特点公开在美国专利申请号09/561,572，名称为“EXPRESSION VECTORS ENCODING EPITOPES OF TARGET-ASSOCIATEDANTIGENS”，于2001年4月28日提交，以及美国临时申请号60/336,968，名称为“EXPRESSION VECTORS ENCODING EPITOPES OF TARGET-ASSOCIATEDANTIGENS AND METHODS FOR THEIR DESIGN”，于2001年11月7日提交。特别有效的疫苗运送方法公开在美国专利申请号09/380,534，于1999年9月1日提交，以及其连续部分申请美国专利申请号09/776,232，于2001年2月2日提交；两者的名称为“A METHOD OF INDUCING A CTLRESPONSE”。上述每一个参考文献全文并入本文作为参考。
可用于实施方案的TuNV抗原的另一个例子是纤连蛋白，优选ED-B结构域。纤连蛋白经受发育调节的选择性的剪接(developmentallyregulated alternative splicing)，具有由单个外显子编码的ED-B结构域，该外显子主要是在胎性癌组织被使用。Matsuura，H.和S HakomoriProc.Natl.Acad.Sci.USA，826517-6521，1985；Carnemolla B等，J.Cell Biol.1081139-1148，1989；Loridon-Rosa B等，Cancer Res.501608-1612，1990；Nicolo，G.等，Cell Differ.Dev.32401-408，1990；Borsi，L.等，Exp.Cell Res.19998-105，1992；Dyama，F.等，Cancer Res.532005-2011，1993；Mandel，U.等，APMIS 102695-702，1994；Farnoud，MR.等，Int.J.Cancer 6127-34，1995；Pujuguet，P.等，Am.J.Pathol.148579-592，1996；Gabler，U.等，Heart 75358-362，1996；Chevalier，X.Br.J.Rheumatol.35407-415，1996；Midulla，M.Cancer Res.60164-169，2000。
ED-B结构域还在新血管系统的纤连蛋白中表达，Kaczmarek，J.等，Int.J.Cancer 5911-16，1994；Castellani，P.等，Int.J.Cancer59612-618，1994；Neri D等Nat.Biotech.151271-1275，1997；Karelina，T.V.和A.Z.Eisen Cancer Detect.Prev.22438-444，1998；Tarli，L.等，Blood 94192-198，1999；Castellani，P.等.ActaNeurochir.(Wien)142277-282，2000。作为胎性癌结构域，除由TuNV表达之外，ED-B结构域通常在肿瘤细胞表达的纤连蛋白中发现。所以，靶向ED-B结构域的CTL-诱导组合物可显示两种作用机理引导肿瘤细胞水解，以及通过破坏TuNV而破坏肿瘤的血液供给。
应当指出，纤连蛋白ED-B结构域的表达已经在肿瘤相关的以及正常的新血管系统中被报道(Castellani P.等Int.J.Cancer 59612-618，1994)。因此，基于它的组合物，或类似表达的抗原，对与不适当的血管生成有关的其它疾病也是有效的。另外，由于CTL活性可以在停止给药组合物后快速地下降，因此，对正常血管生成的干扰可达到最小。
其它免疫原性组合物的靶物质包括生长因子受体，包括与血管细胞相关的那些受体。一个这样的实例为血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)。美国专利申请号6,342,221，包括VEGF和VEGFR2的讨论部分。本领域的技术人员可以理解，与血管细胞有关的任何其它抗原或蛋白质都可以作为该免疫原性组合物的靶物质，包括目前已知的以及还有待于鉴定的那些物质。
动物模型，制备模型的方法，以及组合物评价基于前述考虑设计的组合物对各种靶物质都有效。然而，可在任何时候，但优选在临床试用前，简易地进行附加的评价。例如可利用这种评价来进一步辅助组合物的设计。本发明的其它实施方案涉及评价免疫原性组合物的方法。本领域技术人员可以利用适于评价组合物的动物模型容易地评价本发明的组合物。例如按照以下的常规方法，本领域技术人员可以快速并高效地评价TuNV组合物。因此，使用本文描述的模型或根据本文的指导，本领域技术人员可以几乎不用实验，即可评价任何针对任何TuNV抗原的TuNV组合物。此外的实施方案涉及动物研究模型的制备方法。其它实施方案涉及研究模型动物。以下更完整地阐明这些实施方案。
基于异体移植的人血管系统的模型一些实施方案涉及研究人微血管形成机理的模型体系。例如在一些实施方案中，该模型体系能够用于在临床使用前评价组合物。该模型包括将端粒酶转化的人皮肤微血管内皮细胞(HDMEC)皮下移植到SCID小鼠中，所述细胞混合了MATRIGEL(Becton Dickinson)。Yang.J等在Nature Biotech 19219-224，2001中描述了皮下移植端粒酶转化的HCMEC。本发明组合物激活的T细胞可被继承转移，例如，移植到这种移植小鼠中，就可以评价T细胞破坏或防止这种人微血管形成的能力。在其它实施方案中，小鼠可被直接接种疫苗并进行评价。另外，在此外的实施方案中，通过用其它物种和物种匹配的端粒酶代替DMEC，和通过使用与那些下面描述的适于人体系的类似的试剂，该模型体系可进一步适当地用于测试在非人物种中组合物功效。
优选地，呈递受试组合物表位的MHC的限制性元件被移植到小鼠中的HDMEC系分享。T细胞可来源于体外免疫的人T细胞，或通过免疫HLA-转基因小鼠(本领域公知的程序和实施例公开在上述并入的专利申请中)获得。使用HLA转基因小鼠产生的T细胞可以在继承转移的T细胞和宿主之间形成匹配的遗传背景，从而减少同种的或异种的反应可能性，该反应可能使对结果的解释复杂化。然而，根据可购得的小鼠的品系，可能需要杂交育种，以获得在相同的遗传背景下HLA转基因和SCID表型。或者，可对供体T细胞(人或鼠)进行一轮或多轮体外刺激，以富集想要的群体或形成克隆，从而同样避免不想要的反应活性。
体外免疫的方法在本领域是已知的，例如Stauss等Proc.Natl.Aced.Sci USA 897871-7875，1992；Salgaller等，Cancer Res.554972-4979，1995；Tsai等，J.lmmunoI.1581796-1802，1997；和Chung等，J.Immunother.22279-287，1999。无论在体内或体外，一旦产生这种T细胞，就可用本发明的组合物和/或细胞因子(参见例如Kurokawa T等，Int.J.Cancer 91749-746，2001)或其它有丝分裂原进行刺激，通过体外扩增获得足量的T细胞。这些T细胞可构成能够识别一个或多个表位的克隆或多克隆群体。在优选的实施方案中，使用大约105-108细胞在小鼠中进行继承转移实验。(参见例如Drobyski W.R.等，Blood 972506-2513，2001；Seeley B.M.等，Otolaryngol HeadNeck Surg.124436-441，2001；Kanwar，J.R.等，Cancer Res.611948-1956，2001)。克隆及其它更加富集的群体通常需要移植较少的细胞。
可在移植或形成HDMEC之前，与其同时或在其之后进行T细胞转移。可被评价以评估组合物效力的参数包括血管形成，血管密度的改变，输送小鼠血液的能力(如Yang等人所述)等。可在端粒酶转化的HDMEC移植后1星期，优选在2星期之后，以及至少6星期进行评估；和在T细胞移植后，优选1到3星期后，从一天到超过6星期进行评估。通常，评估可包括将接受与靶抗原反应的T细胞的小鼠与接受原初(包括假免疫(sham-immunized))、或无关表位反应性的T细胞的小鼠相比较。
通常，相关的抗原可由新血管系统表达，或由TuNV优先表达。可用本领域已知的各种技术证实表达，包括免疫组织化学法和RT-PCR。例如可与HDMEC一起移植肿瘤细胞。这会导致抗原的诱导表达，所述抗原是由TuNV优先表达的那些抗原。在一个实施例中，可通过以下完成将一块肿瘤组织移植到含HDMEC的MATRIGEL移植物的附近位置，在该移植物位点注射肿瘤细胞，将含肿瘤细胞的MATRIGEL移植到含HDMEC的MATRIGEL移植物的附近位置，将肿瘤细胞和HDMEC都合并到同一MATRIGEL移植物中，也可利用其它适当的方法来完成。正如以上的讨论，在一些实施方案中，肿瘤细胞与血管细胞一起移植。如此处理的动物能够用作研究模型。另外可对该方法进行的改变对本领域技术人员而言是显而易见的。
HLA-转基因动物模型至于人和模型物种之间序列和/或表达框架中保守的抗原，HLA-转基因品种允许另一个方法，即对模型动物接种疫苗，以抗同基因肿瘤。纤连蛋白的ED-B结构域提供了这样一个机会，因为它是血管生成的标记，并且在人和小鼠中都具有相同的氨基酸顺序(Nilsson F.等CancerRes.61711-716，2001)。而且，已经分离并增殖了来自HLA-A2转基因小鼠品系的自发性肿瘤组织。以上论述了表位的发现和选择，以及组合物的设计和CTL诱导的组合物的运送。
肿瘤细胞系，Ml，来源于自发性唾液腺囊腺癌。Ml肿瘤细胞系及其用法已公开在美国临时申请号————，代理人记录号CTLIMM.028PR，与这个申请同日提交，2001年3月7日，名称为“AN HLA-TRANSGENIC MURINETUMOR CELL LINE”。肿瘤细胞系可在S.Pascolo等人(J.Exp.Med.，1852043-2051，1997)的HHD-A2转基因小鼠品系的个体中产生。这些小鼠表达单个单链I型分子，该分子包括人β2-微球蛋白，以及HLA-A2.1的α-1和α-2结构域，与来源于鼠的I型分子H2Db相平衡。肿瘤块可被移植到新的个体中，该肿瘤可以再生长，通常在1-3个星期之内，从3mm体积块成长为3cm。或者，肿瘤组织可被分散，肿瘤细胞在体外生长。收集后，可将肿瘤细胞皮下注射到颈或腹部(2.5×106细胞，连续3天)，导致在大约5-12星期内，早期传代细胞产生可见的肿瘤。在细胞变得更适应体外生长之后，单次注射1×106-1×107细胞，导致在10天内引发可见的肿瘤。通常，原始的肿瘤一贯存在于唾液腺附近，但是继发瘤也可在各种部位出现，包括肾，肺，肝，和腹肌。
为评价组合物的效力，可在形成肿瘤之前，与其同时或在其之后给药组合物，这可根据该组合物预想的机理而定。对于倾向用某种减小肿瘤体积(debulking)的技术(如外科手术)使用的治疗组合物，同时给药是合适的。在治疗开始前建立的肿瘤越好，那么测试就越令人信服。
已描述了两种用于试验适用于人的组合物的动物评估模型。然而，兽医组合物的申请与其类似，仅仅需要替换物种匹配的内皮细胞，MHC，TuAA，等等。
下述实施例仅仅为说明目的，不应以任何方式将其视为对本发明范围的限制。
实施例实施例1.
使用已被鉴定的抗原PSMA和此处公开的ED-B，进行临床前的研究。研究的结果显示了优异的备选表位。参见下面的表9。
实施例1.1簇分析(PSMA163-192)在433A ABI肽合成仪上，利用标准固相F-moc化学合成肽，AFSPQGMPEGDLVYVNYARTEDFFKLERDM，PSMA163-192，(SEQ ID NO.3)，其含有来自前列腺特异性膜抗原的Al表位簇，以及PSMA168-190(SEQ ID NO.4)。侧链脱保护并与树脂解离后，首先将肽溶于甲酸，然后稀释到30％的乙酸中，在反相制备HPLC C4柱上进行层析，条件为线性AB梯度(5％B/min)，流速4ml/min，其中洗脱剂A为0.1％含水TFA，洗脱剂B为0.1％TFA的乙腈溶液。根据质谱分析法判断在16.642min的分馏物含有预期的肽，收集该分馏物并冻干。然后用蛋白酶体消化该肽并进行基本如上所述的质谱分析。质谱的主峰归纳在表1中。
表1.PSMA163-192质量峰鉴定
黑体字序列对应于预测与MHC结合的肽，参见表2。
N末端池序列(pool sequence)分析用ABI 473A蛋白质测序仪(Applied Biosystems，Foster City，CA)，将在蛋白酶消化1小时时的一个等分试样进行N末端氨基酸序列分析。基于测序循环(sequence cycle)，蛋白质测序仪的重复产率，和在分析的序列中唯一的氨基酸的相对产率的考虑，来确定切割的位点和功效。也就是，如果(在分析序列中)唯一的残基X仅仅在第n个循环出现，那么切割位点存在于在N末端方它前面的n-1个残基。除帮助分辨在将质量分配给序列过程中模糊的情况之外，这些数据还可提供比质谱分析法更加可信的标记，指示各种片段的相对产率。
至于PSMA163-192(SEQ ID NO.3)，这种池测序可支持在V177之后的单一主要切割位点，以及几个次要切割位点，特别是在V179之后。检查图1A-C的结果可揭示以下内容第3个循环中的S，指示存在底物的氮末端。
第5个循环中的Q，指示存在底物的氮末端。
第1个循环中的N，指示V177后切割。
第3个循环中的N，指示V175后切割。注意表1中的176-192片段。
第5个循环中的T，指示V177后切割。
第1-第3个循环中的T，指示R181，A180和Y179后增加的常见切割。其中，仅最后一种情况与通过质谱检测的峰相对应；163-179和180-192，参见表1。其它缺失表示它们在比在质谱中检测的片段小的片段上。
第4，第8和第10个循环中的K，分别指示E183，Y179，和V177后切割，所有对应于通过质谱观测到的片段。参见表1。
第1和第3个循环中的A，分别指示存在底物的N末端，以及V177后切割。
第4和第8个循环中的P，指示存在底物的N末端。
第6和第10循环中的G，指示存在底物的N末端。
第7个循环中的M，指示存在底物的氮末端和/或F185后切割。
第15个循环中的M，指示V177后切割。。
第一个循环可以指示D191后切割，参见表1。
第4和第13个循环中的R，指示V177后切割。
第2和第11个循环中的R，指示V179后切割。
第2，第6和第13个循环中的V分别指示V175，M169后切割，以及存在底物的氮末端。注意表1中，在176和170开始的片段。
第1，第2和第14个循环中的Y分别指示V175，V177后切割，以及存在底物的氮末端。
第11和第12个循环中的L，分别指示V177后切割以及存在底物N的末端，是与其它数据最一致的解释。与质谱结果相比，我们发现在第2，第5和第9个循环中的L，分别与F186，E183或M169和Y179后切割相符。参见表1。
表位鉴定选择出通过SYFPEITHI或NIH算法预测的能够与HLA结合的具有8-10个氨基酸长序列的共C末端片段用于进一步分析。该方法的消化以及预测步骤可以任何顺序进行。虽然本文描述的用于蛋白酶体消化的底物肽被具体地设计成含有预测的HLA-A1结合序列，但是，可事后检测实际的消化产物对其它MHC分子的实际或预测的结合。选择的结果示于表2。
表2.通过蛋白酶消化产生的片段预测HLA结合
未预测HLA-A*0201结合试验使用改良的Stauss等方法，(Proc Nat Acad Sci USA 89(17)7871-5(1992))，测试备选表位PSMA168-177，GMPEGDLVYV(SEQ ID NO.6)与HLA-A2.1的结合。具体地，T2细胞，其能在表面表达无活性的(empty)或不稳定的MHC分子，用Iscove’s改良的Dulbecco’s培养基(IMDM)洗涤T2细胞两次，并在无血清的AIM-V培养基(LifeTechnologies，Inc.Rockville，MD)中过夜培养，所述AIM-V培养基补充有3μg/ml的人β2微球蛋白(Sigma，St.Louis，MO)，并以800，400，200，100，50，25，12.5，和6.25μg/ml的量向96孔平底培养板中加入肽，所述培养板中含有3×105细胞/200μl/孔。在分配到培养板之前，利用重复吹吸将肽与细胞混合(可将肽加入到单独的孔中)，轻轻地晃动培养板2分钟。在5％CO2保温箱内，37℃孵育。第二天，用不含血清的RPMI培养基洗涤两次，除去未结合的肽，加入饱和量的抗I型HLA单克隆抗体，异硫氰酸荧光素(F1TC)-结合的抗HLA A2，A28(One LambdaCanoga Park CA)。4℃孵育30分钟后，用补充有0.5％BSA，0.05％(w/v)叠氮化钠，pH7.4-7.6(染色缓冲剂)的PBS洗涤细胞3次。(或者，可使用W6/32(Sigma)作为抗I型HLA单克隆抗体，用染色缓冲剂洗涤细胞，然后在4℃下，与异硫氰酸荧光素(F1TC)结合的山羊F(ab’)抗鼠-IgG(Sigma)一起孵育30分钟，并如上所述洗涤3次)。用0.5ml染色缓冲剂重悬细胞。使用FACScan(Becton Dickinson，San Jose，CA)，通过流式细胞术分析由于与肽结合而稳定化的表面HLA-A2.1分子。如果流式细胞术不能立即进行，可加入四分之一体积的2％多聚甲醛固定细胞并贮藏在4℃黑暗中。
如图2所示，这个表位显示即使在低于阳性对照肽浓度条件下，仍具有显著的结合。在该试验中以Melan-A肽作为对照(在本文中都以其作为对照)，ELAGIGILTV(SEQ ID NO106)，其实际上是天然序列(EAAGIGILTV；SEQID NO107)的变体，并在该试验中显示高的亲合力affinity。已知的A2.1结合剂FLPSDYFPSV(HBV18-27SEQID NO107)也用作阳性对照。HLA-B44结合肽，AEMGKYSFY(SEQ ID NO109)，用作阴性对照。从阴性对照获得的荧光类似于试验中不使用肽的情况下所获得的信号。阳性和阴性对照肽选自Current Protocols in Immunology的18.3.2页的表18.3.1，John Wiley和Sons，纽约，1998。
实施例1.2簇分析(PSMA281-310)。
使用标准固相F-moc化学法，在433A ABI肽合成仪上合成另一个肽RGIAEAVGLPSIPVHPIGYYDAQKLLEKMG，PSMA281-310(SEQID NO.18)，其含有一个来自前列腺特异性膜抗原的A1表位簇，和PSMA283-307(SEQ ID NO.19)。侧链脱保护并与树脂解离后，将含于ddH2O的肽在反相制备HPLC C18柱上进行层析，条件为线性AB梯度(5％B/min)，流速4ml/min，其中洗脱剂A为0.1％含水TFA，洗脱剂B为0.1％TFA的乙腈溶液。根据质谱分析法判断，在17.061分钟时的分馏物含有预期的肽，收集该分馏物并冻干。然后用蛋白酶体消化该肽并进行基本如上所述的质谱分析。质谱的主峰归纳在表3中。
表3.PSMA281-310质峰鉴定 黑体字序列相应于预测与MHC结合的肽，参见表4。
*仅就质量而言，该峰还可以是296-310或288-303。
**仅就质量而言，该峰还可以是298-307。HPLC和质谱分析结合，显示在一些后面时间点，该峰是两个物种的混合物。
仅就质量而言，该峰还可以是289-298。
仅就质量而言，该峰还可以是281-295或294-306。
§仅就质量而言，该峰还可以是297-303。
仅就质量而言，该峰还可以是285-306。
#仅就质量而言，该峰还可以是288-303。
这些交替的排布均不支持N末端池序列分析。
N末端池序列分析用ABI 473A蛋白质测序仪(Applied Biosystems，Foster City，CA)，将在蛋白酶消化(参见以上实施例3部份3)1小时时的一个等分试样进行N末端氨基酸序列分析。基于测序循环，蛋白质测序仪的重复产率，和在分析的序列中唯一的氨基酸的相对产率的考虑，来确定切割的位点和功效。也就是，如果(在分析序列中)唯一的残基X仅仅在第n个循环出现，那么切割位点存在于在N末端方向它前面的n-1个残基。除帮助分辨在将质量分配给序列过程中模糊的情况之外，这些数据还可提供比质谱分析法更加可信的标记，指示各种片段的相对产率。
关于PSMA281-320(SEQ ID NO.18)，该池测序支持在其它次要的切割位点中，V287和I297之后的两个主要切割位点。检查表3中的结果揭示了下述内容在第4和第11循环中的S，分别指示V287后的切割和存在底物的N-末端。
在第8循环中的H，指示V287后的切割。与从10到11存在的高度的下降相对，在位置9和10峰高没有下降，可提示在A286和E285后也有切割，而不是表示在测序反应中潜伏的峰。
在第2，第4和第7循环中的D，分别指示Y299，I297，和V294后的切割。这个最后的切割在表4中的所有片段或在以下注释中的交替排布中末出现。
在第6循环中的Q，指示I297后的切割。
在第10和第12循环中的M，分别指示Y299和I297后的切割。
表位鉴定选择出通过SYFPEITHI或NIH算法预测的能够与HLA结合的具有8-10个氨基酸长序列的共C末端片段用于进一步分析。该方法的消化以及预测步骤可以任何顺序进行。虽然本文描述的用于蛋白酶体消化的底物肽被具体地设计成含有预测的HLA-A1结合序列，但是，可事后检测实际的消化产物对其它MHC分子的实际或预测的结合。选择的结果示于表4。
表4.
通过蛋白酶产生的片段PSMA281-319预测与HLA的结合
末预测如表4所示，对表位实行可靠序列的N末端加成常常可产生有益的，甚至更好的表位，用于相同或不同的MHC限制元件。注意例如(G)LPSIPVHPI与HLA-A*0201的结合，其中通过依赖N末端修饰以产生用于HLA-B7，-B*5101，和Cw*0401的表位，10-mer可作用对几种MHC类型有用的疫苗。
HLA-A*0201结合试验
基本如上述实施例1.1所述，用PSMA288-297，GLPSIPVHPI，(SEQ ID NO.21)进行HLA-A*0201结合研究。如图2所示，这个表位显示即使在低于阳性对照肽浓度条件下，仍具有显著的结合。
实施例1.3簇分析(PSMA454-481)如上所述，通过MPS合成另一个肽SSIEGNYTLRVDCTPLMYSLVHLTKEL，PSMA454-481(SEQ ID NO.28)(纯度＞95％)，其含有一个来自前列腺特异性膜抗原的表位簇，并对其进行蛋白酶体消化和质谱分析。质谱的主峰归纳在表5中。
表5.PSMA454-481质量峰鉴定
黑体字序列相应于预测与MHC结合的肽，参见表6。
*仅仅根据质量，该峰可同样地指定为肽455-472，然而认为仅N-末端氨基酸的蛋白酶去除不太可能。如果该结果重要，可通过N-末端测序解决。
**根据质量，该片段还可能代表455-464。
表位鉴定选择出通过SYFPEITHI或NIH算法预测的能够与HLA结合的具有8-10个氨基酸长序列的共C末端片段用于进一步分析。该方法的消化以及预测步骤可以任何顺序进行。虽然本文描述的用于蛋白酶体消化的底物肽被具体地设计成含有预测的HLA-A2.1结合序列，但是，可事后检测实际的消化产物对其它MHC分子的实际或预测的结合。选择的结果示于表6。
表6.通过蛋白酶体产生的片段预测HLA结合
未预测如表6所示，对表位实行可靠序列的N末端加成常常可产生有益的，甚至更好的表位，用于相同或不同的MHC限制元件。注意例如(L)RVDCTPLMY(SEQ ID NOS 35和(36))与HLA-B*2702/5的结合，其中10-mer具有真实的预测的解离半衰期，而共同C末端则没有。另外，注意SIEGNYTLRV(SEQ ID NO 30)的情况，预测的HLA-A*0201表位，通过依赖于N末端修饰以产生表位，其可用作对HLA-B*5101有用的疫苗。
HLAA-A*0201结合试验基本如以上实施例1.1所述，用PSMA460-469，YTLRVDCTPL，(SEQ ID NO.33)进行HLA-A*0201结合研究。如图4所示，发现该表位与HLA-A2.1的结合程度类似已知的用作阳性对照的A2.1结合体FLPSDYFPSV(HBV18-27；SEQID NO.108)。另外，PSMA461-469(SEQ ID NO32)也差不多结合。
ELISPOT分析PSMA463-471(SEQ ID NO.35)通过在包被缓冲剂(35mM碳酸氢钠，15mM碳酸钠，pH9.5)中，用50μl/孔的4μg/ml鼠抗人IFN单克隆抗体在4℃过夜孵育，使捕获抗体包被硝酸纤维素支持的微量滴定板的各孔。用PBS洗涤4次，每次5min，除去未结合的抗体。然后通过加入200μl/孔具有10％血清的RPMI培养基封闭膜上未结合的位点，并在室温下孵育1hr。以1∶3连续稀释抗原刺激的CD8+T细胞，并以100μl/孔的量，接种到微量滴定板各孔中，起始浓度为2×105细胞/孔。(在先的抗原刺激基本上如Scheibenbogen C等人的描写，Int.J.Cancer 71932-936，1997；将其全文并入本文作为参考。)加入PSMA462-471(SEQ ID NO.36)和IL-2，使PSMA462-471终浓度为10μg/ml，而IL-2的终浓度为100U/ml，并将细胞培养在37℃，5％CO2，水饱和的大气中，40小时。孵育后，用含有0.05％吐温-20的PBS(PBS-吐温)，以200μl/孔的量洗涤板6次。检测抗体，以50μl/孔的量加入2g/ml生物素化的鼠抗人IFN单克隆抗体的PBS+10％胎牛血清溶液，在室温下孵育板2小时。用200μl PBS-吐温洗涤4次，除去未结合的检测抗体。向每孔中加入100μl抗生物素蛋白结合的辣根过氧化酶(Pharmingen，San Diego，CA)，并在室温下孵育1小时。用200μl PBS-吐温洗涤6次除去未结合的酶。按下述制备底物将20mg 3-氨基-9-乙基coarbasole片剂溶解在2.5ml N，N-二甲基甲酰胺中，并将该溶液加入到47.5ml的0.05M磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液(pH5.0)中。在即将以100μl/孔的量分配底物之前，向底物溶液中加入25μl 30％的H2O2，并在室温下孵育板。显色后(通常15-30min)，用水洗涤该板，停止反应。空气干燥该板，并使用立体显微镜计算斑点。
图5显示检测PSMA463-471(SEQ ID NO.35)反应性的HLA-A1+CD8+T细胞，该细胞先前产生自HLA-A1+CD8+T细胞与自体树突状细胞及肽的培养物。在无肽的培养物中未检测到反应性(数据未显示)。在该情况下，可见该肽反应性的T细胞以2.2×104中有1个-6.7×104中有1个之间的频率存在于培养物中。抗HLA-A1单克隆抗体阻断-IFN产生的能力已经确实地证明这的确是HLA-A1-限制的反应；参见图6。
实施例1.4簇分析(PSMA653-687)用MPS合成另外的肽，FDKSNPIVLRMMNDQLMFLERAFIDPLGLPDRPFYPSMA653-687(SEQ ID NO.37)(纯度＞95％)，其含有来自前列腺特异性膜抗原的A2表位簇，以及PSMA660-681(SEQ ID NO 38)，并如上所述进行蛋白酶体消化和质谱分析。质谱的主峰归纳在表7中。
表7.PSMA653-687质量峰鉴定
黑体字序列相应于预测与MHC结合的肽，参见表7。
*仅仅根据质量，该峰可同样地指定为在654起始的肽，然而认为仅N-末端氨基酸的蛋白酶去除不太可能。如果该问题重要，可通过N-末端测序解决。
**仅仅根据质量，这些峰可能已被分配给内部片段，但是根据消化的总图谱来看，不太可能。
表位鉴定选择出通过SYFPEITHI或NIH算法预测的能够与HLA结合的具有8-10个氨基酸长序列的共C末端片段用于进一步分析。该方法的消化以及预测步骤可以任何顺序进行。虽然本文描述的用于蛋白酶体消化的底物肽被具体地设计成含有预测的HLA-A2.1结合序列，但是，可事后检测实际的消化产物对其它MHC分子的实际或预测的结合。选择的结果示于表8。
表8.通过蛋白酶体产生的片段预测HLA结合
未预测如表8所示，对表位实行可靠序列的N末端加成常常可产生有益的，甚至更好的表位，用于相同或不同的MHC限制元件。注意例如(R)MMNDQLMFL(SEQ ID NOS.39和(40))与HLA-A*02的结合，其中10-mer保持了真实的预期结合潜力。
HLA-A*0201结合试验基本如实施例1.1所述，用PSMA663-671(SEQ ID NO39)和PSMA662-671，RMMNDQLMFL(SEQ ID NO67)进行HLA-A*0201结合研究。如图4，7和8所示，该表位即使在低于阳性对照肽(FLPSDYFPSV(HBV18-27)；SEQ IDNO.108)的浓度下，仍显示显著的结合。虽然未平行进行，但与对照相比，提示PSMA662-671(其在亲合力方面接近Melan A肽)具有这两个PSMA肽的超级结合活性。
实施例2使用此处公开的组合物进行多中心临床研究。研究结果显示该组合物对于减小实性肿瘤和对于通常诱导抗血管生成活性是有用的并且有功效的。
实施例3.在异体移植的人血管系统模型中评价PSMA组合物靶抗原反应性的CTL的产生A.小鼠的体内免疫麻醉HHD1转基因A*0201小鼠(Pascolo，S，等，J.Exp.Med.1852043-2051，1997)，并在尾部基点皮下注射100μlPBS溶液，避开侧面的尾部静脉，所述PBS溶液中含有100nmol PSMA288-297(SEQ ID NO21)以及20μg HTL表位肽，并且该PBS溶液已被50μl IFA(不完全弗氏佐剂)乳化。
B制备刺激细胞(LPS胚细胞)。
处死2只免疫的以及未免疫的天然小鼠，将它们的尸体放入酒精，利用它们的脾脏。利用无菌的工具，将小鼠左边(中间略低的位置)皮肤的上皮层切开，露出腹膜。用酒精浸透腹膜，并无菌取出脾。将脾放入培养皿中，皿中带有不含血清的培养基。使用3ml注射器的无菌柱塞捣碎脾脏以分离脾细胞。将细胞收集在50ml锥形管中，管内含有不含血清的培养基，洗涤平皿孔。离心细胞(12000rpm，7min)，并用RPMI洗涤一次。以1×106细胞/毫升的浓度，将新鲜的脾细胞重悬于RPMI-10％FCS(胎牛血清)。加入25g/ml脂多糖和7μg/ml葡聚糖硫酸酯。在T-75烧瓶中，37℃，5％CO2条件下，孵育细胞3天。将脾胚细胞收集在50ml管中，沉淀(12,000rpm，7min)并以3×107/ml的量重悬于RPMI。以50μg/ml的量，用引发肽(priming peptide)冲击胚细胞，室温下(RT)4小时，以25μg/ml量的丝裂霉素C处理20min，并用DMEM洗涤三次。21C.体外刺激LPS刺激胚细胞后三天，并在同一天装入肽，处死接触过抗原的小鼠(在免疫后14天)，取出脾。在37℃和5％CO2条件下，在24孔板上，用1×106LPS胚细胞/孔的胚细胞，在DMEM培养基中培养3×106脾细胞，所述DMEM培养基补充有10％FCS，5×10-5M(β)巯基乙醇，100μg/ml链霉素和100IU/ml青霉素。在第3天向培养物中加入5％(体积/体积)的ConA上清液，并可在第7天移植。还在标准铬释放试验中测试该CTL等分试样，以确保活性。
移植和继承转移将1×106端粒酶转化的HDMEC在10μl EGM-2-VM培养基(Clonetics，San Diego，CA)中的溶液与0.5ml MATRIGEL(Becton Dickinson)在冰上混合。通过25标准规格的针，沿着SCID小鼠胸腔的中线，皮下注射该混合物。一周以后，静脉注射(或者可腹膜内注射)0.2毫升1×107T细胞(靶表位反应性的或假免疫)。
评定(显微形态测定法)移植1和2个星期后，除去移植物，固定在10％的缓冲液中过夜，石蜡包埋并分段。使用抗人IV型胶原IgG以及荧光标记的二次抗体免疫荧光检测人微血管，在10mM pH6.0柠檬酸中微波处理薄片段2×7分钟，释放并收集抗原。评价血管密度，作为阳性染色的环状构造的平均数的函数，所述构造是在五个分离的，随机选择的，来自每个移植物的至少三个片段的20x可见区中观察到的。
实施例4.在HLA转基因小鼠模型中的纤连蛋白ED-B疫苗A.形成肿瘤收获在加入了10％血清的完全RPMI中生长的肿瘤细胞，并用PBS通过离心洗涤。以5×106细胞/ml的浓度，将细胞悬浮在PBS中，并将0.5ml该悬液(早期传代)皮下注射到腹部。
B.接种疫苗将核苷酸序列插入合适的疫苗载体中(例如pVAX1(InvitrogenInc，Carlsbad，CA)或美国专利申请号09/561,572描述的载体，该申请名称为“EXPRESSION VECTORS ENCODING EPITOPES OF TARGET-ASSOCIATED ANTIGENS”，2001年4月28日提交，所述核苷酸序列编码HLA-A2限制的纤连蛋白ED-B结构域来源的管家表位，例如ED-B29-38(SEQ ID NO.103)。用0，2，10，50，100，和200μg的载体在PBS中的溶液节点内(intranodally)注射HHD-A2小鼠的腹股沟淋巴结，每隔一天，在8天内进行(4次注射)，每个侧面轮流注射(单一剂量/小鼠或小鼠组)。注射系列在注射肿瘤细胞当天开始，在之前2星期，以及在之后4和10星期。
C.评价在接受赋形剂而不是疫苗注射的小鼠中，注射肿瘤细胞之后大约12个星期观察到可见的肿瘤。该疫苗的效力可以表示为在相同时间内未形成肿瘤的接种疫苗动物的比例，在同一时间点肿瘤的相对大小，接种疫苗动物中肿瘤出现之前时间的延迟，以及抑制或防止肿瘤形成需要的剂量和组合物循环的数目。
D.交替性的时间表更具侵袭性的新近的(later)传代Ml细胞的有效性能够更压缩实验时间。肿瘤细胞接种当天并不对小鼠接种疫苗，而是在之前1、2个星期，以及注射1×106细胞后3或4天。接种肿瘤细胞大约10天后，评价接种疫苗的效力。
E.用肽免疫用ED-B29-38(SEQ ID NO.103)在弗氏完全佐剂中的溶液免疫HHD-A2小鼠，收集脾细胞并使用标准方法体外再刺激。所获的CTL能特异性溶解肽冲击过的T2细胞，其为HLA-A2+(图9)。
实施例5.表位和表位簇表9显示PSMA和ED-B的表位和表位簇，可用于构建本发明的组合物。
表9.SEQ ID NOS.*
1这个H在SWISSPROT数据库中发表为Y。
*SEQ ID NOS.5-17，20-27，29-36，39-88和92-105的任一序列，都可作为本发明各种实施方案中的表位。SEQ ID NOS.3，4，18，19，28，37，38，89和90的任一序列均可作为含表位或表位簇的序列，如同在本发明各实施方案中所述。
**此处和全文所用的所有登录号可在NCBI数据库登陆，例如Entrez seek和国际互联网的检索系统。
PSMA位点NM_0044762653bp mRNA PRI 01-NOV-2000定义人叶酸水解酶(前列腺特异性膜抗原)1(FOLH1)，mRNA.
登录号NM_004476版本NM_004476.1 GI4758397关键词来源人.
有机体人真核生物；后生动物；脊索动物；有头类；脊椎动物；Euteleostomi；哺乳纲；真兽亚纲；灵长类；狭鼻类；人科；人。
参考文献1(碱基1-2653)作者Israeli，R.S.，Powell，C.T.，Fair，W.R.和Heston，W.D.
标题编码前列腺特异性膜抗原的互补DNA的分子克隆杂志Cancer Res.53(2)，227-230(1993)MEDLINE93113576参考文献2(碱基1-2653)作者Rinker-Schaeffer CW，Hawkins AL，Su SL，Israeli RS，Griffin CA，Isaacs JT和Heston WDO.
标题前列腺特异性膜抗原(PSM)基因对人染色体11的定位和物理图谱杂志Genomics 30(1)，105-108(1995)MEDLINE96129312PUBMED8595888参考文献3(碱基1-2653)作者O′Keefe DS，Su SL，Bacich DJ，Horiguchi Y，Luo Y，Powell CT，Zandvliet D，Russell PJ，Molloy PL，Nowak NJ，Shows TB，Mullins C，Vonder Haar RA，Fair WR和Heston WD.
标题人前列腺特异性膜抗原基因的图谱，基因组组成和启动子分析杂志Biochim.Biophys.Acta 1443(1-2)，113-127(1998)MEDLINE99057588PUBMED9838072参考文献4(碱基1-2653)作者Maraj BH，Leek JP，Karayi M，Ali M，Lench NJ和Markham AF.
标题位于人染色体11p11.2的假定前列腺特异性膜抗原的详细遗传图谱杂志Cytogenet.Cell Genet.81(1)，3-9(1998)MEDLINE98358137PUBMED9691167注释临时的REFSEQ这个记录尚未经过最终的NCBI验证。参考序列来自M99487.1.
特征 位置/限定词来源1..2653/有机体＝″人″/db_xref＝″分类单位9606″/染色体＝″11″/图谱＝″11p11.2″/性别＝″男″/细胞_系＝″LNCaP-ATCC″/细胞_类型＝″前列腺″/组织_类型＝″前列腺癌转移性淋巴结″/组织_文库＝″Ron以色列的LNCaP cDNA″基因1..2653/基因＝″FOLH1″/注释＝″FOLH；PSM；PSMA″/db_xref＝″基因座ID2346″/db_xref＝″MIM600934″CDS262..2514/基因＝″FOLH1″/注释＝″叶酸水解酶1(前列腺特异性膜抗原)″/密码子_起始＝1/db_xref＝″基因座ID2346″/db_xref-″MIM600934″/证据＝实验/产物＝″叶酸水解酶(前列腺特异性膜抗原)1″/蛋白质id＝″NP004467.1″/db_xref＝″GI4758398″/翻译＝″MWNLLHETDSAVATARRPRWLCAGALVLAGGFFLLGFLFGWFIKSSNEATNITPKHNMKAFLDELKAENIKKFLYNFTQIPHLAGTEQNFQLAKQIQSQWKEFGLDSVELAHYDVLLSYPNKTHPNYISIINEDGNEIFNTSLFEPPPPGYENVSDIVPP
FSAFSPQGMPEGDLVYVNYARTEDFFKLERDMKINCSGKIVIARYGKVFRGNKVKNAQLAGAKGVILYSDPADYFAPGVKSYPDGWNLPGGGVQRGNILNLNGAGDPLTPGYPANEYAYRRGIAEAVGLPSIPVHPIGYYDAQKLLEKMGGSAPPDSSWRGSLKVPYNVGPGFTGNFSTQKVKMHIHSTNEVTRIYNVIGTLRGAVEPDRYVILGGHRDSWVFGGIDPQSGAAVVHEIVRSFGTLKKEGWRPRRTILFASWDAEEFGLLGSTEWAEENSRLLQERGVAYINADSSIEGNYTLRVDCTPLMYSLVHNLTKELKSPDEGFEGKSLYESWTKKSPSPEFSGMPRISKLGSGNDFEVFFQRLGIASGRARYTKNWETNKFSGYPLYHSVYETYELVEKFYDPMFKYHLTVAQVRGGMVFELANSIVLPFDCRDYAVVLRKYADKIYSISMKHPQEMKTYSVSFDSLFSAVKNFTEIASKFSERLQDFDKSNPIVLRMMNDQLMFLERAFIDPLGLPDRPFYRHVIYAPSSHNKYAGESFPGIYDALFDIESKVDPSKAWGEVKRQIYVAAFTVQAAAETLSEVA″(SEQ ID NO.1)/misc feature 778..1029/主释＝″PA；区域PA结构域″碱基数782a 524c 640g 707t起点1 ctcaaaaggg gccggatttc cttctcctgg aggcagatgt tgcctctctc tctcgctcgg61 attggttcag tgcactctag aaacactgct gtggtggaga aactggaccc caggtctgga121 gcgaattcca gcctgcaggg ctgataagcg aggcattagt gagattgaga gagactttac181 cccgccgtgg tggttggagg gcgcgcagta gagcagcagc acaggcgcgg gtcccgggag241 gccggctctg ctcgcgccga gatgtggaat ctccttcacg aaaccgactc ggctgtggcc301 accgcgcgcc gcccgcgctg gctgtgcgct ggggcgctgg tgctggcggg tggcttcttt361 ctcctcggct tcctcttcgg gtggtttata aaatcctcca atgaagctac taacattact421 ccaaagcata atatgaaagc atttttggat gaattgaaag ctgagaacat caagaagttc481 ttatataatt ttacacagat accacattta gcaggaacag aacaaaactt tcagcttgca541 aagcaaattc aatcccagtg gaaagaattt ggcctggatt ctgttgagct agcacattat601 gatgtcctgt tgtcctaccc aaataagact catcccaact acatctcaat aattaatgaa661 gatggaaatg agattttcaa cacatcatta tttgaaccac ctcctccagg atatgaaaat721 gtttcggata ttgtaccacc tttcagtgct ttctctcctc aaggaatgcc agagggcgat781 ctagtgtatg ttaactatgc acgaactgaa gacttcttta aattggaacg ggacatgaaa841 atcaattgct ctgggaaaat tgtaattgcc agatatggga aagttttcag aggaaataag901 gttaaaaatg cccagctggc aggggccaaa ggagtcattc tctactccga ccctgctgac961 tactttgctc ctggggtgaa gtcctatcca gatggttgga atcttcctgg aggtggtgtc1021 cagcgtggaa atatcctaaa tctgaatggt gcaggagacc ctctcacacc aggttaccca1081 gcaaatgaat atgcttatag gcgtggaatt gcagaggctg ttggtcttcc aagtattcct1141 gttcatccaa ttggatacta tgatgcacag aagctcctag aaaaaatggg tggctcagca1201 ccaccagata gcagctggag aggaagtctc aaagtgccct acaatgttgg acctggcttt1261 actggaaact tttctacaca aaaagtcaag atgcacatcc actctaccaa tgaagtgaca1321 agaatttaca atgtgatagg tactctcaga ggagcagtgg aaccagacag atatgtcatt1381 ctgggaggtc accgggactc atgggtgttt ggtggtattg accctcagag tggagcagct1441 gttgttcatg aaattgtgag gagctttgga acactgaaaa aggaagggtg gagacctaga1501 agaacaattt tgtttgcaag ctgggatgca gaagaatttg gtcttcttgg ttctactgag1561 tgggcagagg agaattcaag actccttcaa gagcgtggcg tggcttatat taatgctgac1621 tcatctatag aaggaaacta cactctgaga gttgattgta caccgctgat gtacagcttg1681 gtacacaacc taacaaaaga gctgaaaagc cctgatgaag gctttgaagg caaatctctt
1741 tatgaaagtt ggactaaaaa aagtccttcc ccagagttca gtggcatgcc caggataagc1801 aaattgggat ctggaaatga ttttgaggtg ttcttccaac gacttggaat tgcttcaggc1861 agagcacggt atactaaaaa ttgggaaaca aacaaattca gcggctatcc actgtatcac1921 agtgtctatg aaacatatga gttggtggaa aagttttatg atccaatgtt taaatatcac1981 ctcactgtgg cccaggttcg aggagggatg gtgtttgagc tagccaattc catagtgctc2041 ccttttgatt gtcgagatta tgctgtagtt ttaagaaagt atgctgacaa aatctacagt2101 atttctatga aacatccaca ggaaatgaag acatacagtg tatcatttga ttcacttttt2161 tctgcagtaa agaattttac agaaattgct tccaagttca gtgagagact ccaggacttt2221 gacaaaagca acccaatagt attaagaatg atgaatgatc aactcatgtt tctggaaaga2281 gcatttattg atccattagg gttaccagac aggccttttt ataggcatgt catctatgct2341 ccaagcagcc acaacaagta tgcaggggag tcattcccag gaatttatga tgctctgttt2401 gatattgaaa gcaaagtgga cccttccaag gcctggggag aagtgaagag acagatttat2461 gttgcagcct tcacagtgca ggcagctgca gagactttga gtgaagtagc ctaagaggat2521 tctttagaga atccgtattg aatttgtgtg gtatgtcact cagaaagaat cgtaatgggt2581 atattgataa attttaaaat tggtatattt gaaataaagt tgaatattat atataaaaaa2641 aaaaaaaaaa aaa(SEQ ID NO.2)纤连蛋白的ED-B结构域基因座HSFIBEDB 2823bp DNA线性PRI09-8月-1999定义 人纤连蛋白基因ED-B区。
登录号X07717版本X07717.1 GI31406关键词交替剪接；纤连蛋白。
来源人。
有机体人真核生物；后生动物；脊索动物；有头类；脊椎动物；Euteleostomi；哺乳纲；真兽亚纲；灵长类；狭鼻类；人科；人。
参考文献1(碱基1-2823)作者Paolella，G.，Henchcliffe，C.，Sebastio，G.和Baralle，F.E.
标题序列分析和体内表达显示人纤连蛋白基因的ED-B和ED-A区的交替剪接是独立事件。
杂志Nucleic Acids Res.16(8)，3545-3557(1988)MEDLINE 88233940特征 位置/限定词来源1..2823/有机体＝″人″
/db_xref＝″分类单位9606″/克隆＝″MA10″外显子1..104/数目＝1/产物＝″纤连蛋白″CDS连接(＜2..104，1375..1647，2758..＞2823)/密码子_起始＝1/产物＝″纤连蛋白″/蛋白质_id＝″CAB52437.1″/db_xref＝″GI5725425″/翻译＝″CTFDNLSPGLEYNVSVYTVKDDKESVPISDTIIPEVPQLTDLSFVDITDSSIGLRWTPLNSSTIIGYRITVVAAGEGIPIFEDFVDSSVGYYTVTGLEPGIDYDISVITLINGGESAPTTLTQQTAVPPPTDLRFTNIGPDTMRVTW″(SEQ ID NO.90)内含子105..1374/数目＝1外显子1375..1647/注释＝″ED-B外显子″/数目＝2/产物＝″纤连蛋白″内含子1648..2757/数目＝2外显子2758..2823/数目＝3/产物＝″纤连蛋白″碱基数824a 556c 528g 915t起点1 ctgcactttt gataacctga gtcccggcct ggagtacaat gtcagtgttt acactgtcaa61 ggatgacaag gaaagtgtcc ctatctctga taccatcatc ccaggtaata gaaaataagc121 tgctatcctg agagtgacat tccaataaga gtggggatta gcatcttaat ccccagatgc181 ttaagggtgt caactatatt tgggatttaa ttccgatctc ccagctgcac tttccaaaac241 caagaagtca aagcagcgat ttggacaaaa tgcttgctgt taacactgct ttactgtctg
301 tgcttcactg ggatgctgtg tgttgcagcg agtatgtaat ggagtggcag ccatggcttt361 aactctgtat tgtctgctca catggaagta tgactaaaac actgtcacgt gtctgtactc421 agtactgata ggctcaaagt aatatggtaa atgcatccca tcagtacatt tctgcccgat481 tttacaatcc atatcaattt ccaacagctg cctatttcat cttgcagttt caaatccttc541 tttttgaaaa ttggatttta aaaaaaagtt aagtaaaagt cacaccttca gggttgttct601 ttcttgtggc cttgaaagac aacattgcaa aggcctgtcc taaggatagg cttgtttgtc661 cattgggtta taacataatg aaagcattgg acagatcgtg tccccctttg gactcttcag721 tagaatgctt ttactaacgc taattacatg ttttgattat gaatgaacct aaaatagtgg781 caatggcctt aacctaggcc tgtctttcct cagcctgaat gtgcttttga atggcacatt841 tcacaccata cattcataat gcattagcgt tatggccatg atgttgtcat gagttttgta901 tgggagaaaa aaaatcaatt tatcacccat ttattatttt ttccggttgt tcatgcaagc961 ttattttcta ctaaaacagt tttggaatta ttaaaagcat tgctgatact tacttcagat1021 attatgtcta ggctctaaga atggtttcga catcctaaac agccatatga tttttaggaa1081 tctgaacagt tcaaattgta ccctttaagg atgttttcaa aatgtaaaaa atatatatat1141 atatatatat tccctaaaag aatattcctg tttattcttc tagggaagca aactgttcat1201 gatgcttagg aagtcttttc agagaattta aaacagattg catattacca tcattgcttt1261 aacattccac caattttact actagtaacc tgatatacac tgctttattt tttcctcttt1321 ttttccctct attttccttt tgcctccccc tccctttgct ttgtaactca atagaggtgc1381 cccaactcac tgacctaagc tttgttgata taaccgattc aagcatcggc ctgaggtgga1441 ccccgctaaa ctcttccacc attattgggt accgcatcac agtagttgcg gcaggagaag1501 gtatccctat ttttgaagat tttgtggact cctcagtagg atactacaca gtcacagggc1561 tggagccggg cattgactat gatatcagcg ttatcactct cattaatggc ggcgagagtg1621 cccctactac actgacacaa caaacgggtg aattttgaaa acttctgcgt ttgagacata1681 gatggtgttg catgctgcca ccagttactc cggttaaata tggatgtttc atgggggaag1741 tcagcaattg gccaaagatt cagataggtg gaattggggg gataaggaat caaatgcatc1801 tgctaaactg attggagaaa aacacatgca atatcttcag tacactctca tttaaaccac1861 aagtagatat aaagcctaga gaaatacaga tgtctgctct gttaaatata aaatagcaaa1921 tgttcattca atttgaagac ctagaatttt tcttcttaaa taccaaacac gaataccaaa1981 ttgcgtaagt accaattgat aagaatatat caccaaaatg taccatcatg ctcttccttc2041 taccctttga taaactctac catgctcctt ctttgtagct aaaaacccat caaaatttag2101 ggtagagtgg atgggcattg ttttgaggta ggagaaaagt aaacttggga ccattctagg2161 ttttgttgct gtcactaggt aaagaaacac ctctttaacc acagtctggg gacaagcatg2221 caacatttta aaggttctct gctgtgcatg ggaaaagaaa catgctgaga accaatttgc2281 atgaacatgt tcacttgtaa gtagaattca ctgaatggaa ctgtagctct agatatctca2341 catgggggga agtttaggac cctcttgtct ttttgtctgt gtgcatgtat ttctttgtaa
2401 agtactgcta tgtttctctt tgctgtgtgg caacttaagc ctcttcggcc tgggataaaa2461 taatctgcag tggtattaat aatgtacata aagtcaacat atttgaaagt agattaaaat2521 cttttttaaa tatatcaatg atggcaaaaa ggttaaaggg ggcctaacag tactgtgtgt2581 agtgttttat ttttaacagt agtacactat aacttaaaat agacttagat tagactgttt2641 gcatgattat gattctgttt cctttatgca tgaaatattg attttacctt tccagctact2701 tcgttagctt taattttaaa atacattaac tgagtcttcc ttcttgttcg aaaccagctg2761 ttcctcctcc cactgacctg cgattcacca acattggtcc agacaccatg cgtgtcacct2821 ggg(SEQ ID NO.91)//
序列表<110>麦康公司约翰·J·L·西马德戴维·C·戴蒙德<120>用于治疗癌症的抗新血管系统制剂<130>CTLIMM.015VPC<150>US60/274,063<151>2001-03-07<160>109<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>750<212>PRT<213>人<400>1Met Trp Asn Leu Leu His Glu Thr Asp Ser Ala Val Ala Thr Ala Arg1 5 10 15Arg Pro Arg Trp Leu Cys Ala Gly Ala Leu Val Leu Ala Gly Gly Phe20 25 30Phe Leu Leu Gly Phe Leu Phe Gly Trp Phe Ile Lys Ser Ser Asn Glu35 40 45Ala Thr Asn Ile Thr Pro Lys His Asn Met Lys Ala Phe Leu Asp Glu50 55 60Leu Lys Ala Glu Asn Ile Lys Lys Phe Leu Tyr Asn Phe Thr Gln Ile65 70 75 80Pro His Leu Ala Gly Thr Glu Gln Asn Phe Gln Leu Ala Lys Gln Ile85 90 95Gln Ser Gln Trp Lys Glu Phe Gly Leu Asp Ser Val Glu Leu Ala His100 105 110Tyr Asp Val Leu Leu Ser Tyr Pro Asn Lys Thr His Pro Asn Tyr Ile115 120 125Ser Ile Ile Asn Glu Asp Gly Asn Glu Ile Phe Asn Thr Ser Leu Phe130 135 140Glu Pro Pro Pro Pro Gly Tyr Glu Asn Val Ser Asp Ile Val Pro Pro145 150 155 160Phe Ser Ala Phe Ser Pro Gln Gly Met Pro Glu Gly Asp Leu Val Tyr165 170 175Val Asn Tyr Ala Arg Thr Glu Asp Phe Phe Lys Leu Glu Arg Asp Met180 185 190Lys Ile Asn Cys Ser Gly Lys Ile Val Ile Ala Arg Tyr Gly Lys Val
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actggaaact tttctacaca aaaagtcaag atgcacatcc actctaccaa tgaagtgaca 1320agaatttaca atgtgatagg tactctcaga ggagcagtgg aaccagacag atatgtcatt 1380ctgggaggtc accgggactc atgggtgttt ggtggtattg accctcagag tggagcagct 1440gttgttcatg aaattgtgag gagctttgga acactgaaaa aggaagggtg gagacctaga 1500agaacaattt tgtttgcaag ctgggatgca gaagaatttg gtcttcttgg ttctactgag 1560tgggcagagg agaattcaag actccttcaa gagcgtggcg tggcttatat taatgctgac 1620tcatctatag aaggaaacta cactctgaga gttgattgta caccgctgat gtacagcttg 1680gtacacaacc taacaaaaga gctgaaaagc cctgatgaag gctttgaagg caaatctctt 1740tatgaaagtt ggactaaaaa aagtccttcc ccagagttca gtggcatgcc caggataagc 1800aaattgggat ctggaaatga ttttgaggtg ttcttccaac gacttggaat tgcttcaggc 1860agagcacggt atactaaaaa ttgggaaaca aacaaattca gcggctatcc actgtatcac 1920agtgtctatg aaacatatga gttggtggaa aagttttatg atccaatgtt taaatatcac 1980ctcactgtgg cccaggttcg aggagggatg gtgtttgagc tagccaattc catagtgctc 2040ccttttgatt gtcgagatta tgctgtagtt ttaagaaagt atgctgacaa aatctacagt 2100atttctatga aacatccaca ggaaatgaag acatacagtg tatcatttga ttcacttttt 2160tctgcagtaa agaattttac agaaattgct tccaagttca gtgagagact ccaggacttt 2220gacaaaagca acccaatagt attaagaatg atgaatgatc aactcatgtt tctggaaaga 2280gcatttattg atccattagg gttaccagac aggccttttt ataggcatgt catctatgct 2340ccaagcagcc acaacaagta tgcaggggag tcattcccag gaatttatga tgctctgttt 2400gatattgaaa gcaaagtgga cccttccaag gcctggggag aagtgaagag acagatttat 2460gttgcagcct tcacagtgca ggcagctgca gagactttga gtgaagtagc ctaagaggat 2520tctttagaga atccgtattg aatttgtgtg gtatgtcact cagaaagaat cgtaatgggt 2580atattgataa attttaaaat tggtatattt gaaataaagt tgaatattat atataaaaaa 2640aaaaaaaaaa aaa2653<210>3<211>30<212>PRT<213>人<400>3Ala Phe Ser Pro Gln Gly Met Pro Glu Gly Asp Leu Val Tyr Val Asn1 5 10 15Tyr Ala Arg Thr Glu Asp Phe Phe Lys Leu Glu Arg Asp Met20 25 30<210>4<211>23<212>PRT<213>人<400>4Gly Met Pro Glu Gly Asp Leu Val Tyr Val Asn Tyr Ala Arg Thr Glu1 5 10 15Asp Phe Phe Lys Leu Glu Arg20
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<210>29<211>9<212>人<400>29Ile Glu Gly Asn Tyr Thr Leu Arg Val1 5<210>30<211>10<212>PRT<213>人<400>30Ser Ile Glu Gly Asn Tyr Thr Leu Arg Val1 5 10<210>31<211>8<212>PRT<213>人<400>31Glu Gly Asn Tyr Thr Leu Arg Val1 5<210>32<211>9<212>PRT<213>人<400>32Thr Leu Arg Val Asp Cys Thr Pro Leu1 5<210>33<211>10<212>PRT<213>人<400>33Tyr Thr Leu Arg Val Asp Cys Thr Pro Leu1 5 10
<210>34<211>9<212>PRT<213>人<400>34Leu Arg Val Asp Cys Thr Pro Leu Met1 5<210>35<211>9<212>PRT<213>人<400>35Arg Val Asp Cys Thr Pro Leu Met Tyr1 5<210>36<211>10<212>PRT<213>人<400>36Leu Arg Val Asp Cys Thr Pro Leu Met Tyr1 5 10<210>37<211>35<212>PRT<213>人<400>37Phe Asp Lys Ser Asn Pro Ile Val Leu Arg Met Met Asn Asp Gln Leu1 5 10 15Met Phe Leu Glu Arg Ala Phe Ile Asp Pro Leu Gly Leu Pro Asp Arg20 25 30Pro Phe Tyr35<210>38<211>22<212>PRT<213>人
<400>38Val Leu Arg Met Met Asn Asp Gln Leu Met Phe Leu Glu Arg Ala Phe1 5 10 15Ile Asp Pro Leu Gly Leu20<210>39<211>9<212>PRT<213>人<400>39Met Met Asn Asp Gln Leu Met Phe Leu1 5<210>40<211>10<212>PRT<213>人<400>40Arg Met Met Asn Asp Gln Leu Met Phe Leu1 5 10<210>41<211>9<212>PRT<213>人<400>41Arg Met Met Asn Asp Gln Leu Met Phe1 5<210>42<211>9<212>PRT<213>人<400>42Leu Leu His Glu Thr Asp Ser Ala Val1 5<210>43
<211>9<212>PRT<213>人<400>43Ala Thr Ala Arg Arg Pro Arg Trp Leu1 5<210>44<211>9<212>PRT<213>人<400>44Thr Pro Lys His Asn Met Lys Ala Phe1 5<210>45<211>10<212>PRT<213>人<400>45Glu Leu Lys Ala Glu Asn Ile Lys Lys Phe1 5 10<210>46<211>9<212>PRT<213>人<220>
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<220>
<221>变异体<222>(8)…(8)<223>Xaa＝His或Tyr<400>47Glu Asn Ile Lys Lys Phe Leu Xaa Asn Phe1 5 10<210>48<211>9<212>PRT<213>人<400>48Ala Gly Ala Lys Gly Val Ile Leu Tyr1 5<210>49<211>10<212>PRT<213>人<400>49Pro Leu Met Tyr Ser Leu Val His Asn Leu1 5 10<210>50<211>9<212>PRT<213>人<400>50Leu Met Tyr Ser Leu Val His Asn Leu1 5<210>51<211>9<212>PRT<213>人<400>51Arg Val Asp Cys Thr Pro Leu Met Tyr1 5
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1 5 10<210>62<211>9<212>PRT<213>人<400>62Gly Tyr Pro Ala Asn Glu Tyr Ala Tyr1 5<210>63<211>10<212>PRT<213>人<400>63Pro Gly Tyr Pro Ala Asn Glu Tyr Ala Tyr1 5 10<210>64<211>9<212>PRT<213>人<400>64Asp Pro Leu Thr Pro Gly Tyr Pro Ala1 5<210>65<211>9<212>PRT<213>人<400>65Ser Leu Tyr Glu Ser Trp Thr Lys Lys1 5<210>66<211>10<212>PRT<213>人<400>66
Lys Ser Leu Tyr Glu Ser Trp Thr Lys Lys1 5 10<210>67<211>9<212>PRT<213>人<400>67Glu Gly Phe Glu Gly Lys Ser Leu Tyr1 5<210>68<211>10<212>PRT<213>人<400>68Asp Glu Gly Phe Glu Gly Lys Ser Leu Tyr1 5 10<210>69<211>9<212>PRT<213>人<400>69Thr Lys Lys Ser Pro Ser Pro Glu Phe1 5<210>70<211>10<212>PRT<213>人<400>70Trp Thr Lys Lys Ser Pro Ser Pro Glu Phe1 5 10<210>71<211>10<212>PRT<213>人
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<211>147<212>PRT<213>人<400>90Cys Thr Phe Asp Asn Leu Ser Pro Gly Leu Glu Tyr Asn Val Ser Val1 5 10 15Tyr Thr Val Lys Asp Asp Lys Glu Ser Val Pro Ile Ser Asp Thr Ile20 25 30Ile Pro Glu Val Pro Gln Leu Thr Asp Leu Ser Phe Val Asp Ile Thr35 40 45Asp Ser Ser Ile Gly Leu Arg Trp Thr Pro Leu Asn Ser Ser Thr Ile50 55 60Ile Gly Tyr Arg Ile Thr Val Val Ala Ala Gly Glu Gly Ile Pro Ile65 70 75 80Phe Glu Asp Phe Val Asp Ser Ser Val Gly Tyr Tyr Thr Val Thr Gly85 90 95Leu Glu Pro Gly Ile Asp Tyr Asp Ile Ser Val Ile Thr Leu Ile Asn100 105 110Gly Gly Glu Ser Ala Pro Thr Thr Leu Thr Gln Gln Thr Ala Val Pro115 120 125Pro Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn Ile Gly Pro Asp Thr Met Arg130 135 140Val Thr Trp145<210>91<211>2823<212>DNA<213>人<400>91ctgcactttt gataacctga gtcccggcct ggagtacaat gtcagtgttt acactgtcaa 60ggatgacaag gaaagtgtcc ctatctctga taccatcatc ccaggtaata gaaaataagc 120tgctatcctg agagtgacat tccaataaga gtggggatta gcatcttaat ccccagatgc 180ttaagggtgt caactatatt tgggatttaa ttccgatctc ccagctgcac tttccaaaac 240caagaagtca aagcagcgat ttggacaaaa tgcttgctgt taacactgct ttactgtctg 300tgcttcactg ggatgctgtg tgttgcagcg agtatgtaat ggagtggcag ccatggcttt 360aactctgtat tgtctgctca catggaagta tgactaaaac actgtcacgt gtctgtactc 420agtactgata ggctcaaagt aatatggtaa atgcatccca tcagtacatt tctgcccgat 480tttacaatcc atatcaattt ccaacagctg cctatttcat cttgcagttt caaatccttc 540tttttgaaaa ttggatttta aaaaaaagtt aagtaaaagt cacaccttca gggttgttct 600ttcttgtggc cttgaaagac aacattgcaa aggcctgtcc taaggatagg cttgtttgtc 660cattgggtta taacataatg aaagcattgg acagatcgtg tccccctttg gactcttcag 720tagaatgctt ttactaacgc taattacatg ttttgattat gaatgaacct aaaatagtgg 780caatggcctt aacctaggcc tgtctttcct cagcctgaat gtgcttttga atggcacatt 840tcacaccata cattcataat gcattagcgt tatggccatg atgttgtcat gagttttgta 900tgggagaaaa aaaatcaatt tatcacccat ttattatttt ttccggttgt tcatgcaagc 960
ttattttcta ctaaaacagt tttggaatta ttaaaagcat tgctgatact tacttcagat 1020attatgtcta ggctctaaga atggtttcga catcctaaac agccatatga tttttaggaa 1080tctgaacagt tcaaattgta ccctttaagg atgttttcaa aatgtaaaaa atatatatat 1140atatatatat tccctaaaag aatattcctg tttattcttc tagggaagca aactgttcat 1200gatgcttagg aagtcttttc agagaattta aaacagattg catattacca tcattgcttt 1260aacattccac caattttact actagtaacc tgatatacac tgctttattt tttcctcttt 1320ttttccctct attttccttt tgcctccccc tccctttgct ttgtaactca atagaggtgc 1380cccaactcac tgacctaagc tttgttgata taaccgattc aagcatcggc ctgaggtgga 1440ccccgctaaa ctcttccacc attattgggt accgcatcac agtagttgcg gcaggagaag 1500gtatccctat ttttgaagat tttgtggact cctcagtagg atactacaca gtcacagggc 1560tggagccggg cattgactat gatatcagcg ttatcactct cattaatggc ggcgagagtg 1620cccctactac actgacacaa caaacgggtg aattttgaaa acttctgcgt ttgagacata 1680gatggtgttg catgctgcca ccagttactc cggttaaata tggatgtttc atgggggaag 1740tcagcaattg gccaaagatt cagataggtg gaattggggg gataaggaat caaatgcatc 1800tgctaaactg attggagaaa aacacatgca atatcttcag tacactctca tttaaaccac 1860aagtagatat aaagcctaga gaaatacaga tgtctgctct gttaaatata aaatagcaaa 1920tgttcattca atttgaagac ctagaatttt tcttcttaaa taccaaacac gaataccaaa 1980ttgcgtaagt accaattgat aagaatatat caccaaaatg taccatcatg ctcttccttc 2040taccctttga taaactctac catgctcctt ctttgtagct aaaaacccat caaaatttag 2100ggtagagtgg atgggcattg ttttgaggta ggagaaaagt aaacttggga ccattctagg 2160ttttgttgct gtcactaggt aaagaaacac ctctttaacc acagtctggg gacaagcatg 2220caacatttta aaggttctct gctgtgcatg ggaaaagaaa catgctgaga accaatttgc 2280atgaacatgt tcacttgtaa gtagaattca ctgaatggaa ctgtagctct agatatctca 2340catgggggga agtttaggac cctcttgtct ttttgtctgt gtgcatgtat ttctttgtaa 2400agtactgcta tgtttctctt tgctgtgtgg caacttaagc ctcttcggcc tgggataaaa 2460taatctgcag tggtattaat aatgtacata aagtcaacat atttgaaagt agattaaaat 2520cttttttaaa tatatcaatg atggcaaaaa ggttaaaggg ggcctaacag tactgtgtgt 2580agtgttttat ttttaacagt agtacactat aacttaaaat agacttagat tagactgttt 2640gcatgattat gattctgttt cctttatgca tgaaatattg attttacctt tccagctact 2700tcgttagctt taattttaaa atacattaac tgagtcttcc ttcttgttcg aaaccagctg 2760ttcctcctcc cactgacctg cgattcacca acattggtcc agacaccatg cgtgtcacct 2820ggg 2823<210>92<211>9<212>PRT<213>人<400>92Thr Ile Ile Pro Glu Val Pro Gln Leu1 5<210>93<211>10<212>PRT<213>人<400>93
Asp Thr Ile Ile Pro Glu Val Pro Gln Leu1 5 10<210>94<211>10<212>PRT<213>人<400>94Glu Val Pro Gln Leu Thr Asp Leu Ser Phe1 5 10<210>95<211>8<212>PRT<213>人<400>95Thr Pro Leu Asn Ser Ser Thr Ile1 5<210>96<211>8<212>PRT<213>人<400>96Ile Gly Leu Arg Trp Thr Pro Leu1 5<210>97<211>9<212>PRT<213>人<400>97Ser Ile Gly Leu Arg Trp Thr Pro Leu1 5<210>98<211>9<212>PRT<213>人
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<400>103Thr Ile Ile Gly Tyr Arg Ile Thr Val Val1 5 10<210>104<211>9<212>PRT<213>人<400>104Ile Gly Tyr Arg Ile Thr Val Val Ala1 5<210>105<211>10<212>PRT<213>人<400>105Ile Ile Gly Tyr Arg Ile Thr Val Val Ala1 5 10<210>106<211>10<212>PRT<213>人<400>106Glu Leu Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val1 5 10<210>107<211>10<212>PRT<213>人<400>107Glu Ala Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val1 5 10<210>108<211>10<212>PRT
<213>人<400>108Phe Leu Pro Ser Asp Tyr Phe Pro Ser Val1 5 10<210>109<211>9<212>PRT<213>人<400>109Ala Glu Met Gly Lys Tyr Ser Phe Tyr1 权利要求
1.一种评价细胞介导的免疫的方法，其包括以下步骤将血管细胞移植到免疫缺陷哺乳动物体内；在所述哺乳动物体内形成免疫应答；和鉴定一种特征，以确定在所述哺乳动物体内细胞介导的免疫。
2.权利要求1的方法，其中所述细胞介导的免疫是针对一种新血管系统抗原。
3.权利要求2的方法，其中所述新血管系统抗原被肿瘤相关新血管系统优先表达。
4.权利要求2的方法，其中所述新血管系统抗原是前列腺特异性膜抗原(PSMA)或血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)。
5.权利要求1的方法，其中所述形成步骤是通过将T细胞继承转移到哺乳动物体内而完成。
6.权利要求1的方法，其中所述形成步骤是通过用一种抗原接触所述哺乳动物而完成。
7.权利要求1的方法，其中所述细胞介导的免疫是由细胞毒性T淋巴细胞介导的。
8.权利要求1的方法，其中所述血管细胞是血管内皮细胞。
9.权利要求8的方法，其中所述内皮细胞是HDMEC。
10.权利要求8的方法，其中所述内皮细胞是端粒酶转化的内皮细胞。
11.权利要求1的方法，其中所述免疫缺陷的哺乳动物是小鼠。
12.权利要求10的方法，其中所述免疫缺陷的小鼠是SCID小鼠。
13.权利要求1的方法，其中所述表征步骤包括评价一个参数，所述参数选自血管形成，血管破坏，血管密度，和输送所述宿主哺乳动物血液的向管比例。
14.权利要求1的方法，其进一步包括将肿瘤细胞或肿瘤组织移植到小鼠体内的步骤。
15.权利要求14的方法，其中所述表征步骤包括评价一个参数，所述参数选自肿瘤出现，肿瘤生长，肿瘤大小，肿瘤出现的速度，抑制或防止肿瘤形成所需要的疫苗剂量，肿瘤血管化和在肿瘤内坏死组织的比例。
16.权利要求1的方法，其进一步包括以下步骤提供哺乳动物第一群体和哺乳动物第二群体；在所述第一群体内形成细胞介导的免疫；和在所述第二群体内形成不同的细胞介导的免疫；将获自所述哺乳动物第一群体的结果与获自所述哺乳动物第二群体结果相比较。
17.权利要求16的方法，其中所述第一群体的细胞介导的免疫选自原初免疫和对无关表位的免疫。
18.一种评价细胞介导的免疫的方法，包括以下步骤将MHC转基因肿瘤细胞移植或注射到一种MHC转基因哺乳动物内；在所述哺乳动物体内形成免疫应答；和鉴定一种特征，以确定所述哺乳动物体内的细胞介导的免疫。
19.权利要求18的方法，其中所述MHC转基因哺乳动物是一种HLA-转基因哺乳动物。
20.权利要求19的方法，其中所述HLA-转基因哺乳动物是一种HLA-A2转基因哺乳动物。
21.权利要求18的方法，其中所述哺乳动物是小鼠。
22.权利要求18的方法，其中所述细胞介导的免疫是通过接种疫苗而形成的。
23.权利要求22的方法，其中所述接种疫苗发生在移植所述肿瘤细胞之前，与其同时，或在其之后。
24.权利要求18的方法，其中所述细胞介导的免疫是由细胞毒性T淋巴细胞介导的。
25.权利要求18的方法，其中所述新血管系统抗原被肿瘤相关新血管系统优先表达。
26.权利要求18的方法，其中所述新血管系统抗原也是一种肿瘤相关抗原。
27.权利要求26的方法，其中所述抗原是纤连蛋白的ED-B结构域。
28.权利要求18的方法，其中所述表征步骤包括评价一个参数，所述参数选自肿瘤的出现，肿瘤的生长，肿瘤的大小，肿瘤出现的速度，抑制或防止肿瘤形成所需要的疫苗剂量，肿瘤的血管化，所述肿瘤内部坏死组织的比例等等。
29.权利要求18的方法，其进一步包括以下步骤提供哺乳动物第一群体和哺乳动物第二群体；在所述第一群体内形成细胞介导的免疫；在所述第二群体内形成不同的细胞介导的免疫；和将获自所述哺乳动物第一群体的结果与获自所述哺乳动物第二群体的结果相比较。
30.权利要求29的方法，其中所述第一群体的细胞介导的免疫选自原初免疫和对无关表位的免疫。
31.一种治疗肿瘤疾病的方法，其包括免疫哺乳动物以诱导针对抗原的细胞免疫应答的步骤，所述抗原由肿瘤相关的新血管系统差异表达。
32.权利要求31的方法，其中所述差异表达的抗原是一种蛋白质。
33.权利要求32的方法，其中所述蛋白质是前列腺特异性膜抗原。
34.权利要求31的方法，其中所述抗原是纤连蛋白的ED-B结构域。
35.权利要求32的方法，其中免疫是用至少一种来源于所述蛋白质序列的肽进行。
36.权利要求32的方法，其中免疫是用一种核酸进行，所述核酸能够表达所述蛋白质或肽。
37.权利要求36的方法，其中所述的至少一种肽包含一个管家表位。
38.权利要求37的方法，其中所述的至少一种肽是与所述管家表位共C末端的。
39.权利要求37的方法，其进一步包括至少一种另外的肽，其中所述的至少一种另外的肽包含一个免疫表位。
40.权利要求31的方法，其包括一个额外的步骤，其中所述哺乳动物是用直接靶向癌细胞的抗肿瘤治疗活性物质进行治疗。
41.权利要求40的方法，其中所述抗肿瘤治疗是靶向肿瘤相关抗原的免疫。
42.权利要求31的方法，其中所述细胞免疫应答包括一种CTL应答。
43.一种免疫原性组合物，其包括至少一种免疫原，所述免疫原相应于一种肿瘤相关新血管系统表达的抗原，其中所述组合物可诱导一种细胞免疫应答。
44.权利要求43的组合物，其中所述免疫原与一种细胞不相关，所述细胞与受体同种。
45.权利要求43的组合物，其中所述抗原是一种蛋白质。
46.权利要求45的组合物，其中所述蛋白质是前列腺特异性膜抗原。
47.权利要求43的组合物，其中所述抗原是纤连蛋白的ED-B结构域。
48.权利要求43的组合物，其中所述的免疫原包括至少一种肽。
49.权利要求43的组合物，其包括一种能够表达所述抗原的核酸，并且其中所述抗原是一种蛋白质或一种肽。
50.权利要求49的组合物，其包含至少一种包含一个管家表位的肽。
51.权利要求50的组合物，其中所述的至少一种肽是与所述管家表位共C末端的。
52.权利要求50的组合物，其另外包括至少一种包含一个免疫表位的肽。
53.权利要求43的组合物，其另外包括至少一种相应于一种肿瘤相关抗原的免疫原。
54.权利要求43的组合物，其中所述细胞免疫应答包括一种CTL应答。
55.一种抗肿瘤疫苗的设计方法，其包括以下步骤鉴定一种由肿瘤相关新血管系统差异表达的抗原；和将所述抗原的一个组分合并到一种疫苗中。
56.权利要求55的方法，其中所述组分是所述抗原的一个多肽片段。
57.权利要求55的方法，其中所述组分一种核酸，其编码所述抗原或所述抗原的一个片段。
58.一种制备一个研究模型的方法，其包括将一种血管细胞和一种肿瘤细胞移植到一种免疫缺陷的哺乳动物体内，其中所述肿瘤细胞被移植到靠近所述血管细胞的位置。
59.权利要求58的方法，其中所述血管细胞是一种血管内皮细胞。
60.权利要求59的方法，其中所述血管内皮细胞是HDMEC。
61.权利要求59的方法，其中所述血管内皮细胞是端粒酶转化的。
62.权利要求58的方法，其中所述免疫缺陷的哺乳动物是小鼠。
63.权利要求62的方法，其中所述小鼠是SCID小鼠。
64.一种研究模型，其包括一种免疫缺陷的哺乳动物，所述哺乳动物包含一种移植的血管细胞和一种移植的肿瘤细胞，其中所述血管细胞以及所述肿瘤细胞被移植成彼此靠近。
全文摘要
此处公开的是免疫原性的组合物，设计免疫原性组合物的方法，使用免疫原性组合物治疗的方法，评估由免疫原性组合物产生的细胞介导的免疫的方法，研究模型，和制备研究模型的方法，所有涉及靶向肿瘤血管系统。
文档编号C07K14/74GK1703247SQ02806006
公开日2005年11月30日 申请日期2002年3月7日 优先权日2001年3月7日
发明者约翰·J·L·西马德, 戴维·C·戴蒙德 申请人:麦康公司