三氧化二砷的抗肿瘤新用途及抗肿瘤制剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物制药领域；更具体地，本发明涉及三氧化二砷的抗肿瘤新用途及 抗肿瘤制剂。
【背景技术】
[0002] 几个世纪以前，砷剂（主要成分为三氧化二砷）就被人们用来治疗牛皮癣、风湿 症、白血病、梅毒、痔疮等。哈尔滨医科大学首先报道了静脉滴注三氧化二砷治疗复发的急 性早幼粒细胞白血病（APL)达到很高的完全缓解效率。随后上海血液研究所发现三氧化二 砷诱导APL细胞凋亡和分化的作用机制。近年来，三氧化二砷与肿瘤的研究发展很快，虽然 有结果显示，在其他类型的白血病甚至实体瘤中，三氧化二砷也有一定的治疗效果，但都没 有达到三氧化二砷在治疗APL白血病的治疗效率。因此，三氧化二砷在治疗其他类型肿瘤 中是如何起作用的，以及如何能增加三氧化二砷的治疗效果是一个非常重要的研究课题。
[0003] 侵袭和转移是恶性肿瘤的基本生物学特征，也是肿瘤患者死亡的主要原因。肿瘤 的转移包括局部侵袭、内渗进入邻近的血管或淋巴管、在循环系统内的生存及运输、从循环 系统的管腔外渗到远端组织、在远端组织克隆形成可见的肿瘤。肿瘤的转移是肿瘤细胞、 宿主细胞和肿瘤微环境之间一系列复杂的相互作用，相互影响的连续过程，多个基因，多 条通路，多种细胞因子参与了整个的侵袭和转移的过程，这些基因组成了调控肿瘤转移的 signature (Nguyen DX，Massague J. Nat Rev Genet. 2007;8:341-352)。乳腺癌是女性排 名第一的常见恶性肿瘤，其主要转移到病人的骨组织，肺，以及脑。乳腺癌骨转移，肺转移 (Minn AJ，Gupta GP，Siegel PM, et al. Nature. 2005;436:518-524)，脑转移的 Signature 相继被鉴定出来，使人们对乳腺癌转移的机制有了更深的了解，也为乳腺癌转移病人的治 疗提供了一系列的靶点。
[0004] p53是一个抑癌基因，在肿瘤的发生过程中起着非常重要的作用。当细胞受到外 界刺激，DNA损伤时，p53可被诱导表达，进而诱导p53下游一系列靶基因，促进细胞进入 细胞周期的停滞阶段，或者诱导受损细胞的凋亡，从而抑制肿瘤的发生（Horn HF, Vousden KH. 2007 ;26:1306-1316)。虽然p53蛋白能抑制肿瘤的发生，但在大约50%的肿瘤患者中 都会发现P53基因突变的情况，突变的p53可以促进肿瘤的转移，抑制化疗药物的作用，增 加肿瘤的恶性化进程。鉴于P53在癌症发生中的重要作用，医药企业开发出了众多以p53 为基础的抗癌药物和疗法。不过这些药物和疗法都是基于重建P53蛋白的活性（Brown CJ 等，Nat Rev Cancer. 2009 ;9:862-873)。
[0005] 鉴于现有的抗肿瘤疗法存在各种缺陷，本领域还有必要开发进一步的新的肿瘤治 疗制剂。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供三氧化二砷的抗肿瘤新用途及抗肿瘤制剂。
[0007] 在本发明的第一方面，提供一种用于治疗肿瘤的药盒，所述药盒包括：三氧化二 砷；和p53抑制剂。
[0008] 在一个优选例中，所述药盒中还包括：芬维A胺。
[0009] 在另个优选例中，所述药盒中还包括：雷帕霉素。
[0010] 在另一优选例中，所述的P53抑制剂包括：PFT a ;PFT μ ;以p53作为沉默靶标的 干扰分子。
[0011] 在另一优选例中，所述的以P53作为沉默靶标的干扰分子是p53为靶点的小干扰 RNA ;较佳地，所述的小干扰RNA是序列如SEQ ID NO: 1的核酸（或是以P53基因或mRNA序 列中SEQ ID N0:1序列位置为靶点的干扰核酸）；更佳地，所述的小干扰RNA藉由病毒介导 进入细胞内发挥干扰作用。
[0012] 在另一优选例中，所述的肿瘤是表达p53蛋白的肿瘤（较佳地为表达野生型或突 变型P53蛋白的肿瘤），以及缺失p53蛋白的肿瘤。
[0013] 在另一优选例中，所述的肿瘤包括（但不限于）：乳腺癌，肺癌，肠癌，前列腺癌，淋 巴瘤，黑色素瘤，肾癌，胰腺癌，卵巢癌，骨髓瘤。
[0014] 在本发明的另一方面，提供一种药物组合在制备治疗肿瘤的药盒中的用途；所述 的药物组合包括三氧化二砷和P53抑制剂。
[0015] 在一个优选例中，所述的药物组合还包括：芬维A胺。
[0016] 在另个优选例中，所述药盒中还包括：雷帕霉素。
[0017] 在另一优选例中，所述的p53抑制剂包括：PFT a ;PFT μ ;以p53作为沉默靶标的 干扰分子。
[0018] 在另一优选例中，所述的治疗肿瘤包括：抑制肿瘤的转移以及抑制肿瘤的生长。
[0019] 在另一优选例中，所述的肿瘤包括（但不限于）：乳腺癌，肺癌，肠癌，前列腺癌，淋 巴瘤，黑色素瘤，肾癌，胰腺癌，卵巢癌，骨髓瘤。
[0020] 在本发明的另一方面，提供三氧化二砷在制备抑制肿瘤转移的药物中的用途（较 佳地，所述的三氧化二砷通过抑制TGFP和TNFa或它们的下游基因、从而抑制肿瘤的转 移）。
[0021] 在一个优选例中，所述的肿瘤转移是乳腺癌转移（较佳地为乳腺癌肺转移）。
[0022] 在本发明的另一方面，提供三氧化二砷在制备TGF β或TNF a信号通路的抑制剂 中的用途；较佳地，所述的TGFii和TNFa信号通路抑制剂抑制肿瘤转移。
[0023] 在本发明的另一方面，提供三氧化二砷在制备治疗p53功能缺失型肿瘤的药物中 的用途。
[0024] 在一个优选例中，所述的p53功能缺失型肿瘤包括：乳腺癌、结肠癌或肺癌。
[0025] 在本发明的另一方面，提供p53抑制剂在制备抑制肿瘤转移的药物中的用途；较 佳地，所述的肿瘤包括：乳腺癌。
[0026] 在一个优选例中，所述的p53抑制剂包括：PFT a ;PFT μ ;以p53作为沉默靶标的 干扰分子。
[0027] 在本发明的另一方面，提供C/ΕΒΡβ以及C/ΕΒΡβ调控的靶基因在制备诊断乳腺 癌转移的诊断试剂中的用途（C/ΕΒΡβ特异性地在肺转移的细胞中高表达，并且参与肿瘤 的肺转移过程，缺失C/ΕΒΡβ促进乳腺癌细胞向肺部的转移；因此，可以通过确定C/ΕΒΡβ 以及C/ΕΒΡβ调控的靶基因的表达情况来进行乳腺癌的预后，如确定发生乳腺癌转移的可 能性）。
[0028] 在本发明的另一方面，提供芬维A胺在制备抑制肿瘤干细胞的药物中的用途；较 佳地，所述的肿瘤干细胞是卵巢癌，乳腺癌和结肠癌的肿瘤干细胞。
[0029] 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。
【附图说明】
[0030] 图1、三氧化二砷作用于乳腺癌细胞MDA-MB-231后的整体表达谱特征。
[0031] (A)通过CPP-SOM展示三氧化二砷作用于乳腺癌细胞MDA-MB-231后的调变趋势。 其中红色的代表在三氧化二砷处理过程中上调的基因，蓝色表示在三氧化二砷处理过程中 下调的基因，而黄色和绿色代表在三氧化二砷处理后调变较低的基因。（B)根据CPP-SOM展 示的基因的表达模式，将每个SOM图分为27个bases。（C)Heatmap图的聚类分析展示在任 一时间点大于2倍调变的基因。其中绿色的cluster代表三氧化二砷处理后下调的基因， 而红色的cluster代表三氧化二砷处理后上调的基因。蓝色的cluster代表中三氧化二砷 处理后动态变化的基因。图下面的bar代表基因的表达量。（D)图展示富集到的生物学功 能类GO。（E-G)通过heatmap展示在GO富集中与细胞周期，DNA复制和细胞的应急反应相 关的调变基因在三氧化二砷处理过程中的变化趋势。
[0032] 图2、三氧化二砷特异性抑制TGF β和TNFa信号通路。
[0033] ㈧三氧化二砷作用于MDA-MB-231细胞后，调变基因相关的pathway分析。（B) 三氧化二砷能特异性抑制TGFβ诱导的SMAD2/3的磷酸化。Western blot检测在TGFβ 以及三氧化二砷预处理之后MDA-MB-231细胞中SMAD2/3和磷酸化SMAD2/3的表达量。以 actin的表达量作为对照。（C)三氧化二砷能特异性抑制TNF α诱导的NF- κ B的磷酸化。 Western blot检测在TNF α以及三氧化二砷预处理之后MDA-MB-231细胞中NF- κ B和磷酸 化NF-κ B的表达量。（D)荧光实时定量PCR检测TGFii信号通路下游的靶基因在三氧化二 砷（ATO)，TGF β以及三氧化二砷和TGF β联合处理之后mRNA的表达量。以GAPDH的表达量 作为对照。（E)荧光实时定量PCR检测TNF α信号通路下游的靶基因在三氧化二砷，TNF α 以及三氧化二砷和TNF α联合处理之后mRNA的表达量。以GAPDH的表达量作为对照。
[0034] 图3、三氧化二砷重编程乳腺癌肺转移的signature。
[0035] 荧光实时定量PCR检测乳腺癌MDA-MB-231和LM2-4175细胞中乳腺癌肺转移 signature基因的表达量，以及三氧化二砷5 μ M处理36小时后MDA-MB-231和LM2-4175细 胞中乳腺癌肺转移signature基因的表达量。基因的表达量以GAPDH作为内参。
[0036] 图4、三氧化二砷对体外肿瘤转移模型和小鼠体内尾静脉肺转移模型的影响。
[0037] (A)三氧化二砷对MDA-MB-231和LM2-4175细胞迁移能力的影响。左图展示在 MDA-MB-231中的结果。在划痕之后，分别在0小时和40小时拍照。同样的，右图展示在 LM2-4175中的结果。（B)三氧化二砷对MDA-MB-231和LM2-4175细胞侵袭能力的影响。图 片展示MDA-MB-231和LM2-4175迁移到小室下层的细胞，用结晶紫进行细胞的染色。（C)对 B图中转移的细胞进行计数分析。（D)在小鼠尾静脉注射LM2-4175细胞后，小鼠每天腹腔 注射三氧化二砷5mg/kg作为治疗组，并以PBS处理作为阴性对照组。两个月后检测转移到 小鼠肺部的肿瘤细胞克隆。左图，对每组小鼠中代表性的肺组织进行拍照，并进行H&E的染 色。右图展示代表性的H&E的染色结果。（E)对PBS处理组小鼠和AT O治疗组小鼠转移到 小鼠肺部肿瘤克隆计数分析。（F)小鼠皮下注射LM2-4175细胞后，小鼠每天腹腔注射三氧 化二砷5mg/kg作为治疗组，并以PBS处理作为阴性对照组。三氧化二砷治疗36天，处死小 鼠，取出肿瘤并拍照。（G)每隔6天测量肿瘤的大小。实验结果展示每组小鼠肿瘤的平均体 积。
[0038] 图5、三氧化二砷的表达谱特征与临床肿瘤病人样本的相关性。
[0039] (A)三氧化二砷处理后发生两倍调变的基因与病人临床数据的聚类分析。（B)两 组病人在发生肺转移和发生骨转移的可能性发分析。（C)HER2,ER,PR以及TGF β信号通路 的三个靶基因 ANGPTL4, VEGFA和C/EBP β在这两组病人中的表达量。
[0040] 图6、转录因子C/EBP β参与乳腺癌肺转移相关signature的调控。
[0041] (A)motif分析乳腺癌肺转移signature基因的promoter区域，筛选可能结合到 这些promoter区域的转录因子。取Z-score大于5作为有意义的富集转录因子。（B和C) 荧光实时定量RT-PCR检测乳腺癌MDA-MB-231 (B)和LM2-4175 (C)细胞在三氧化二砷5 μ M 处理0小时，6小时，12小时，24小时和36小时后C/ΕΒΡβ和C/ΕΒΡ γ的表达量。以细胞 内GAPDH的表达量作为内参。（D)通过Joan Massagu6已经发表的GSE2603这套芯片数据 分析在LM2细胞和MDA-MB-231中C/ΕΒΡβ表达。其中LM2细胞包括LM2-4180，LM2-4175， LM2-4173和LM2-4142。同时与骨转移的BoM-1834和BoM-1833细胞比较C/ΕΒΡβ表达量。 (E)通过Joan Massagu6已经发表的GSE2603这套芯片数据分析在LM2细胞和MDA-MB-231 中C/ΕΒΡ γ表达。（F)荧光实时定量RT-PCR检测乳腺癌MDA-MB-231和LM2-4175细胞在 三氧化二砷5μΜ处理36小时后C/ΕΒΡβ和C/ΕΒΡγ的表达量。以细胞内GAPDH的表达 量作为内参。（G)经5 μ M三氧化二砷处理0小时，6小时，12小时，24小时和36小时后， MDA-MB-231和LM2-4175细胞中C/ΕΒΡβ蛋白含量变化的western结果。以针对C/EBP3C 端的抗体，可以同时检测三种C/ΕΒΡβ的蛋白形式。
[0042] 图7、缺失C/ΕΒΡ β促进乳腺癌细胞肺部的转移但不影响肿瘤的生长。
[0043] (A)在MDA-MB-231和LM2-5175细胞中表达慢病毒介导的特异性针对C/ΕΒΡ β序 列的两个小干扰RNA (siRNAl和siRNA2)，荧光实时定量RT-PCR检测敲除质粒的干扰效率。 以无特异性的NC序列作为阴性对照。（B)western blot检测敲除质粒的干扰效率。（C)实验 用小鼠模型，注射肿瘤细胞的数目，实验用小鼠的数目，以及发生肺转移小鼠的数目统计。 NC，siRNAl和siRNA2代表MDA-MB-231中稳定表达的针对C/ΕΒΡβ的序列。下图是代表性 肺转移小鼠的肺部组织拍照。（D)在裸鼠模型中，NC，siRNAl和siRNA2注射的MDA-MB-231 细胞转移至小鼠的肺部的，形成的转移灶的个数进行统计。（E)在NOD-SCID小鼠模型中， NC，siRNAl和siRNA2注射的MDA-MB-231细胞转移至小鼠的肺部的，形成的转移灶的个数进 行统计。（F)将转染NC，siRNAl和siRNA2的MDA-MB-231注射到小鼠的皮下组织，测量肿 瘤的大小。图片展示每组小鼠平均的肿瘤生长。实验结束时将肿瘤取出拍照，图片在C图 的最下方。
[0044] 图8、MDA-MB-231细胞缺失C/ΕΒΡ β后的转录组水平的变化
[0045] ㈧通过聚类分析展示在MDA-MB-231细胞中C/ΕΒΡβ缺失之后的表达谱的 变化。下面的bar图代表基因的表达量。（B)展示通过GSEA(Gene Set Enrichment Analysis)在C/ΕΒΡβ缺失的MDA-MB-231芯片数据中富集到的转录因子。取Statistical significance (nominal P value)小于0· 05和FDR(false discovery rate) q小于 0· 25。（C) 展示通过GSEA在C/EBP β缺失的MDA-MB-231芯片数据中富集到的细胞信号通路。nominal P value 代表富集的程度。（D)MDA-MB-231 中富集到 cytokine and cytokine receptor 信 号通路中的基因。
[0046] 图9、C/ΕΒΡβ靶基因与临床肿瘤病人样本的相关性。
[0047] (A)C/ΕΒΡβ缺失后发生两倍调变的基因与临床数据的聚类分析。（B)两组病人 在发生肺转移和发生骨转移的可能性发分析。（C)HER2，ER，PR以及C/ΕΒΡβ的靶基因 ANGPTL4, VEGFA以及和C/ΕΒΡβ本身在这两组病人中的表达量。
[0048] 图KKC/ΕΒΡβ通过直接结合到基因的启动子区发挥调节作用。
[0049] (A) Iuciferase实验检测C/EBP β激活型LAP，抑制型的LIP和三氧化二砷对转 移signature基因如：ANGPTL4, VCAMl，TNC，ISG20,以及TNFa信号通路相关的基因 IL1A， IL1B，CCL20,以及两个在缺失C/ΕΒΡβ之后明显上升的基因 BMP4, IFITl的启动子的影响。 C/ΕΒΡβ的表达载体pcDNA3. 0与PGL3. Obasic启动子载体共同转染MDA-MB-231细胞，检测 Iuciferase活性的活性。以空载的pcDNA3.0转染细胞为对照。用三氧化二砷处理转染这 些基因启动子的MDA-MB-231细胞，然后检测Iuciferase活性的活性。以三氧化二砷未处 理细胞为对照。（B)染色质免疫沉淀（ChIP)与荧光实时定量PCR技术验证在MDA-MB-231 和LM2-4175中C/ΕΒΡβ与乳腺癌肺转移signature基因的promoter区域的结合。以IgG 作为对照。
[0050] 图11、三氧化二砷和p53抑制剂PFT α在体外的协同抑制肿瘤细胞生长。
[0051] (A)实验所用细胞的名称，组织来源以及细胞中ρ53的状态。（Β)ρ53野生型细胞 HCTl 16, Α549, MCF7, ρ53 突变型 SKBR3, SUM159, MDA-MB-231，ΗΤ29, ρ53 缺失型 Η1