299 以及 HCT116p53敲除的细胞，在三氧化二砷2. 5和5 μ M处理48小时之后，用MTT方法检测细胞 的活性。（C)P53野生型细胞MCF7，HCT116和Α549用5μΜ三氧化二砷单用，20μΜ PFTa 单用，或三氧化二砷和PFT a联合处理48小时。通过MTT的方法检测细胞活性。Ρ53突变 型细胞SKBR3作为阴性对照。（D)流式细胞仪检测MCF7和HCTl 16细胞在5 μ M三氧化二 砷单用，20 μ M PFTa单用，或三氧化二砷和PFT a联合处理48小时的细胞凋亡情况。通 过Annexin V-FITC和propidium iodide(PI)双染，确定细胞早期和晚期的凋亡。数据展 示细胞早期和晚期的凋亡的比例之和。（E)通过western blot检测凋亡过程中的marker PRAP和BCL2来确定三氧化二砷单用，PFT α单用，或三氧化二砷和PFT α联合处理之后细 胞的凋亡情况。以actin的表达量作为对照。（F)通过propidium iodide(PI)染色，利用 流式细胞仪检测三氧化二砷单用，PFT α单用，或三氧化二砷和PFT α联合处理之后细胞的 DNA的含量。柱形图展示处于S期的细胞的比例。（G)通过Western Blot检测在三氧化二 砷单用，PFT α单用，或三氧化二砷和PFT α联合处理之后细胞的P53以及p53磷酸化形式 的表达量。
[0052] 图12、三氧化二砷和p53抑制剂PFT α在体内的协同抑制肿瘤细胞生长的作用。
[0053] ㈧将处于对数生长期的HCT116细胞注射于裸鼠的皮下。待长出可见的肿瘤时， 将小鼠随机分成四组，每组6只。一组小鼠注射PBS作为对照，一组注射腹腔注射5mg/kg/ day三氧化二砷，一组腹腔注射2. 5mg/kg/day PFT α，最后一组联合三氧化二砷和PFT α用 药。每隔5天测量小鼠肿瘤的大小。曲线图展示小鼠平均肿瘤的大小变化趋势。（B)各组 所剥出的瘤体的照片。（C)实验结束时，每组小鼠的平均的体重。（小鼠的总体重减去负荷 肿瘤的重量）。（D)将处于对数生长期的SKBR3细胞注射于裸鼠的皮下。待长出可见的肿 瘤时，将小鼠随机分成两组。一组小鼠注射PBS作为对照，一组注射腹腔注射5mg/kg/d三 氧化二砷。每隔6天测量小鼠肿瘤的大小。曲线图展示小鼠平均肿瘤的大小变化趋势。
[0054] 图13、在转录组水平上三氧化二砷和三氧化二砷联合PFTa的作用模式与临床肿 瘤病人样本的相关性。
[0055] (A)通过CPP-SOM展示三氧化二砷（上）以及三氧化二砷和PFT a联合作用（下） 于HCT116后的调变基因。其中红色的代表在三氧化二砷处理过程中上调的基因，蓝色表示 在三氧化二砷处理过程中上调的基因，而黄色和绿色代表在三氧化二砷处理后调变较低的 基因。（B)根据CPP-SOM展示的基因的表达模式，将每个SOM图分为27个bases。（C)通过 Heatmap图展示三氧化二砷单独作用之后发生调变的的基因的基因分析。（D)通过Heatmap 图展示三氧化二砷和PFTa合用之后发生调变的的基因。（E)Venn diagram展示三氧化二 砷单独作用之后调变的基因与三氧化二砷与PFTa合用之后调变的基因之间的关系。以2 倍调变为标准，三氧化二砷单独作用之后有178个基因发生变化，而与PFT α合用之后调变 的基因增加到1071个。其中153个基因是其共同调变的。（F)三氧化二砷与PFTa合用后 发生两倍调变的基因与临床结肠癌病人数据的聚类分析。（G)两组病人无病生存率的可能 性发分析。
[0056] 图14、4HPR通过调节活性氧水平选择性的杀伤肿瘤干细胞。
[0057] (A) sphere细胞对顺钼的耐药性。流式细胞仪检测A2780parental细胞和sphere 细胞在20μΜ顺钼处理48小时的细胞凋亡情况。通过Annexin V-FlTC^Ppropidium iodide (PI)双染，确定细胞早期和晚期的凋亡。数据展示细胞早期和晚期的凋亡的比例之 和。（B)检测sphere细胞在小鼠体内的成瘤能力。将同样数目的A2780parental细胞和 sphere细胞注射到NOD-SCID小鼠的皮下组织，检测肿瘤的大小。数据代表每组中4只小 鼠皮下肿瘤生长的速度。（C)4HPR对A2780, MCF7, SUM159来源的sphere细胞的生长抑制 作用。在显微镜下对4HPR处理组和非处理的sphere细胞进行拍照。（D)流式细胞仪检测 A2780parental细胞和sphere细胞在3 μ M4HPR处理48小时的细胞凋亡情况。（E)流式细 胞仪检测A2780parental细胞和sphere细胞在3 μ M4HPR处理6小时后的细胞内的活性氧 水平。以DCF-DA的荧光强度代表细胞内的活性氧水平。并以维生素 C的预处理组作为阴性 的对照组。（F)流式细胞仪检测A2780parental细胞和sphere细胞在3 μ M4HPR以及4HPR 在维生素 C的预处理组24小时的细胞凋亡情况。
[0058] 图15、三氧化二砷与ρ53抑制剂PFT α与4HPR的联合作用。
[0059] (A)在ΗΤ29以及ΗΤ29来源的4HPR耐药株细胞，检测4HPR，三氧化二砷，5FU，EPB 处理48小时后细胞的活性。（Β)ρ53野生型细胞HCT116, Α549, MCF7, ρ53突变型SKBR3， SUM159，MDA-MB-231，ΗΤ29,以及 ρ53 缺失型 Η1299 细胞，在 4HPR6 μ M和 9 μ M处理48 小时之 后，用MTT方法检测细胞的活性。（C)通过PI染色，利用流式细胞仪检测4HPR单用，4HPR和 PFT α联合处理之后细胞的DNA的含量。柱形图展示处于S期的细胞的比例。（D)在MCF7 和HCTl 16中检测三氧化二砷联合PFT α以及4HPR诱导的细胞凋亡的作用。（E)三氧化二 砷与ρ53抑制剂PFT α与雷帕霉素 rapamycin与芬维A胺4HPR的组合对细胞活性的影响。
【具体实施方式】
[0060] 本发明人经过深入的研究，首次揭示了三氧化二砷的抗肿瘤新机制，在此基础上 提供了对于抗肿瘤有用的药物或药盒，以及三氧化二砷或相关制剂的新用途。
[0061] 本发明人在研究中发现，三氧化二砷特异性的诱导乳腺癌肺转移signature的重 编程，从而在体内和体外抑制乳腺癌肺转移过程。并且通过表达谱一转录因子的筛选及验 证，确定C/ΕΒΡβ在乳腺癌肺转移和三氧化二砷抑制肿瘤转移中所发挥的作用。同时发 现，三氧化二砷能很好的诱导P53功能缺失的细胞的凋亡，但对p53野生型的细胞没有影 响。基于这个发现，本发明人提出在肿瘤疾病治疗过程中联合三氧化二砷与P53抑制剂 PFT α以及以三氧化二砷与P53抑制剂PFT α为基础联合已有临床肿瘤治疗药物如雷帕霉 素 rapamycin和芬维A胺4HPR的肿瘤治疗方案。同时本发明人还发现ρ53抑制剂PFT α 可以抑制肿瘤的侵袭转移。
[0062] 三氧化二砷的新用途
[0063] 在三氧化二砷抑制肿瘤细胞生长方面，本发明人发现，在相同浓度下三氧化二砷 能特异性地抑制Ρ53功能缺失型肿瘤细胞的生长，但对于ρ53野生型肿瘤细胞无明显影响。 具体对于乳腺癌，结肠癌和肺癌细胞，本发明人发现三氧化二砷特异性地抑制来自乳腺癌， 结肠癌和肺癌细胞系中的Ρ53功能缺失型肿瘤细胞的生长如SKBR3，SUM159，MDA-MAB-231， HT29和H1299,而对p53野生型肿瘤细胞MCF7，HCT116和A549无明显影响。通过在动物体 内的实验，本发明人发现三氧化二砷在小鼠皮下植瘤模型中能明显抑制P53缺失SKBR3细 胞的生长，但对P53野生型HCT116细胞的生长抑制不明显。而当联合三氧化二砷和p53抑 制剂共同处理时，P53野生型HCT116细胞的皮下成瘤能力就受到明显的抑制。
[0064] 为了预测三氧化二砷与p53抑制剂合用在结肠癌病人中的治疗效果，本发明人选 择在三氧化二砷与P53抑制剂合用后发生两倍调变的基因作为靶基因，并用这些基因与临 床病人的生存年限进行基因量和病人肿瘤无病生存时间的双向聚类分析。根据三氧化二砷 与P53抑制剂合用的靶基因在病人样本中的表达量，可以将所有的病人分成两组，看到一 组病人有很高的死亡率，另一组病人的死亡率发生的可能性比较低。这些数据说明，三氧化 二砷与P53抑制剂合用确实能很好的与病人的临床数据结合起来，比单独应用三氧化二砷 可能具有很好的临床治疗的效果。
[0065] 在三氧化二砷抑制肿瘤细胞转移方面，本发明人对三氧化二砷作用后的 MDA-MAB-231细胞的表达谱研究发现，三氧化二砷能特异性的抑制乳腺癌肺转移相关的 signature基因的表达。在具有高转移性的乳腺癌细胞MDA-MB-231，及来源于MDA-MB-231 细胞，具有特异性肺转移能力的LM2-4175细胞中，三氧化二砷同样能特异性的抑制乳腺癌 肺转移相关signature基因的表达。
[0066] 本发明人发现，在体外的细胞转移模型中，三氧化二砷能明显的抑制乳腺癌细胞 迁移和侵袭的能力。在体内的小鼠尾静脉肺转移模型中，三氧化二砷可以抑制乳腺癌细胞 在肺部形成克隆。需要强调的是三氧化二砷抑制乳腺癌细胞在肺部形成克隆的能力可能与 三氧化二砷抑制乳腺癌肺转移signature基因有关，而不是通过调节某个单独的基因来实 现的。
[0067] 以临床肿瘤病人发生转移的数据为基础，本发明人了验证三氧化二砷在临床上抑 制肿瘤细胞转移的可能性。选择在三氧化二砷处理后发生两倍调变的基因作为三氧化二砷 作用的靶基因，并用这些基因与临床病人发生转移的数据进行基因表达量和病人肿瘤转移 时间的双向聚类分析。根据三氧化二砷作用靶基因在病人样本中的表达量，可以将所有的 病人分成两组，然后分析这两组病人在发生肺转移和骨转移的可能性。其中一组病人有很 高的肺转移发生的可能性，而另一组病人的肺转移发生的可能性低。而在骨转移上，这两组 病人没有明显的区别。并且ER，PR在这两组病人中有明显的差异。TGFii信号通路的三个 靶基因 ANGPTL4, VEGFA和C/EBP β在这两组病人中的表达量同样具有明显的差异。
[0068] 因此，本发明提供了三氧化二砷的新医药用途，用于制备治疗ρ53功能缺失型乳 腺癌、结肠癌或肺癌的药物；或用于制备抑制乳腺癌转移（较佳地为乳腺癌肺转移）的药 物。
[0069] C/ΕΒΡβ的新用途
[0070] 本发明人在深入研究后发现，转录因子C/ΕΒΡβ在调控肿瘤转移的signature中 发挥重要作用，并且三氧化二砷可以通过抑制C/EBP β的作用来抑制肿瘤的转移。
[0071] 通过signature基因的motif分析，本发明人发现三氧化二砷通过抑制转录因子 C/ΕΒΡβ的作用来抑制乳腺癌肺转移。在三氧化二砷作用之后，C/ΕΒΡβ的mRNA水平和C/ EBP β抑制型蛋白水平有了明显的升高。通过过表达C/ΕΒΡβ和siRNA敲除实验，本发明人 进一步证实C/ΕΒΡβ可以调节乳腺癌肺转移signature基因。进一步通过小鼠的体内实验 表明C/ΕΒΡβ的缺失可以促进肿瘤细胞的转移。并且通过ChIP实验，发现C/ΕΒΡβ与乳腺 癌肺转移signature基因的启动子区结合，从而调节这些基因的表达。
[0072] 进一步，本发明人通过表达谱芯片研究分析C/ΕΒΡβ调控的靶基因。选择在C/ EBP β缺失后发生两倍调变的基因作为C/ΕΒΡβ的靶基因，并用这些基因与临床病人发生 转移的数据进行基因量和病人肿瘤转移时间的双向聚类分析。根据C/ΕΒΡβ的靶基因在病 人样本中的表达量，我们可以将所有的病人分成两组。然后我们分析这两组病人在发生肺 转移和发生骨转移的可能性。我们看到其中一组病人有很高的肺转移发生的可能性，而另 一这组病人的肺转移发生的可能性低。而在骨转移上着两组病人没有明显的区别。
[0073] 鉴于C/ΕΒΡβ在乳腺癌肺转移和三氧化二砷抑制肿瘤转移中发挥重要作用，肿瘤 转移灶中C/ΕΒΡβ的表达量明显提高，其可以作为乳腺癌肺转移病人的分子诊断标记。因 此，本发明提供了 C/ΕΒΡβ在制备诊断乳腺癌转移的诊断试剂中的用途。
[0074] ρ53抑制剂的新用途
[0075] 本发明人还发现，ρ53抑制剂PFT a (Pifithrin-α )也能明显的抑制肿瘤（如乳腺 癌）的迁移和侵袭。现有技术中，本领域人员的思路一般均基于重建Ρ53蛋白的活性。而 本发明人的思路与之相反，提出以抑制Ρ53活性的模式，通过ρ53抑制剂来抑制肿瘤的侵袭 转移，以及恶性程度的进程。
[0076] 如本文所用，所述的ρ53抑制剂包括了拮抗剂、下调剂、阻滞剂、阻断剂等。
[0077] 所述的ρ53抑制剂是指任何可降低ρ53蛋白的活性、降低ρ53基因或蛋白的稳定 性、下调Ρ53蛋白的表达、减少ρ53蛋白有效作用时间、或抑制ρ53基因的转录和翻译的物 质，这些物质均可用于本发明，作为对于下调Ρ53有用的物质，从而可用于抑制肿瘤转移。 例如，所述的抑制剂是：特异性干扰Ρ53基因表达的小干扰RNA分子或反义核苷酸；或特异 性与Ρ53蛋白结合的抗体或配体。
[0078] 作为本发明的一种方式，所述的Ρ53的抑制剂是一种特异性与ρ53结合的抗体。 所述的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。可用p53蛋白免疫动物，如家兔，小鼠，大 鼠等来生产多克隆抗体；多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。与 之相似的，表达P53或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。所述的 抗体也可以是单克隆抗体，此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备（见Kohler等 人，Nature256 ;495,1975 ;Kohler 等人，Eur. J. Immunol. 6 :511，1976 ;Kohler 等人，Eu;r· J. Immunol. 6 ：292,1976 ；Hammerling 等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas, Elsevier, Ν· Y. , 1981) 〇
[0079] 作为本发明的一种优选方式，所述的p53的抑制剂是一种p53特异性的小干扰RNA 分子（siRNA)。如本文所用，所述的"小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA) "是指一 种短片段双链RNA分子，能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA，这个过程 就是RNA干扰（RNA interference)过程。作为本发明的特别优选的方式，提供了一种效果 良好的小干扰RNA分子，所述的小干扰RNA分子可特异性的干扰p53基因的表达，与其它的 人类核酸序列没有显著的同源性；并且经验证，其具有良好的干扰P53表达的效果。
[0080] 此外，本发明还提供了 p53在肿瘤分型方面的用途，用于区分不同肿瘤的P53基因 型，进而确定肿瘤对于三氧化二砷的敏感性。
[0081] 药盒及其用途
[0082] 本发明还发现，三氧化二砷与p53抑制剂对于p53野生型肿瘤细胞能够发挥良好 的杀伤活性。
[0083] 在相同浓度下三氧化二砷能特异性地抑制p53功能缺失型肿瘤细胞的生长，但对 于P53野生型肿瘤细胞无明显影响。并且，在p53野生型肿瘤细胞中，通过抑制p53的活性 来增强三氧化二砷的作用是有用的。在P53野生型肿瘤细胞MCF7, HCT116和A549中单独 使用三氧化二砷或P53抑制剂（如PFT α )对肿瘤细胞都无明显影响，但三氧化二砷和P53 抑制剂（如PFTa)的合用能明显抑制肿瘤细胞的生长。同时在 P53功能缺失型肿瘤细胞 MDA-MAB-231和HT29中三氧化二砷和p53抑制剂也有一定联合作用。
[0084] 三氧化二砷和p53抑制剂的协同作用主要是通过诱导细胞的凋亡和周期的阻滞 来实现的。在P53野生型肿瘤细胞MCF7和HCTl 16中，与单独使用三氧化二砷或p53抑制剂 相比，三氧化二砷和P53抑制剂（如PFT a )的合用能明显增加 Annexin V-PI阳性细胞的 比例，并且可以诱导剪切型PARP的出现和降低BCL2的表达。在调节细胞周期方面，三氧化 二砷和p53抑制剂的合用能明显降低HCT116和A549细胞中S期细胞的比例。在小鼠皮下 成瘤的实验中，三氧化二砷和P53抑制剂PFTa同样具有明显的联合作用。与单独使用三 氧化二砷或P53抑制剂PFT a相比，三氧化二砷和P53抑制剂PFT a的合用能明显抑制小 鼠皮下肿瘤的生长速度。并且与单独使用三氧化二砷相比，三氧化二砷和P53抑制剂PFT a 的合用并没有导致明显的小鼠毒副作用。
[0085] 本发明人进一步发现，三氧化二砷与p53抑制剂（如PFT a )与已有临床肿瘤治疗 药物如雷帕霉素和芬维A胺有明显的协同作用。本发明人比较了四种药物的16种组合在 细胞活性和诱导细胞凋亡方面的不同作用，发现三氧化二砷，P53抑制剂（如PFT a)联合 雷帕霉素或者三氧化