发现LIP的表达能明显激活这些基因的荧光素酶活性 (图10A)。而在TNC，ISG20, CCL20这三个基因中，LIP的表达能明显抑制这些基因的荧光 素酶活性（图10A)。
[0253] 当将激活型LAP和抑制型的LIP共转染时，发现在VCAMl，ILIA，CCL20这三个基 因中，LIP的表达能明显抑制LAPl所激活的Iuciferase活性（图25A)。但与空载质粒相 t匕，其对荧光素酶仍然有明显的激活（图10A)。而在BMP4这个基因上，LAP和LIP在对荧 光素酶活性的调节上有协同作用（图10A)。这些结果进一步表明，LAP和LIP在基因调控 中的不同的作用，并且暗示C/EBP β调控下游靶基因的复杂性。
[0254] 前面的研究表明，三氧化二砷对C/ΕΒΡβ有明显的调控作用。在三氧化二砷处理 的MDA-MB-231细胞中，C/ΕΒΡβ的表达量有明显的升高。因此，本发明人认为三氧化二砷 对 ANGPTL4, VCAM1，TNC，ISG20, L1A，IL1B，CCL20, ΒΜΡ4, IFITl 的启动子的荧光素酶活性也 有明显的影响。本发明人用三氧化二砷处理转染这些基因启动子的MDA-MB-231细胞，然后 检测荧光素酶活性的活性。实验结果显示，与三氧化二砷的未处理组相比，三氧化二砷能明 显的激活这些基因的荧光素酶活性（图10Α)。
[0255] 通过染色质免疫共沉淀及荧光定量PCR技术，本发明人进一步发现C/ΕΒΡβ对这 些基因启动子区域的直接结合作用。首先，通过TRANSFEC软件对这些基因的启动子区域进 行分析，并预测C/EBP β可能结合的DNA片段。之后通过染色质免疫共沉淀，分离出C/EBP β 结合的DNA片段，并用荧光实时定量PCR方法检测。结果显示，在MDA-MB-231和LM2-4175 细胞中，与阴性 IgG 相比，C/EBP β 明显的结合到 ANGPTL4, EREG，ISG20, PTGS2, TNC，VCAM1， IL6, ΤΕΤ1，TNFSF15, ΒΡΜ4 的启动子区域（图 10Β)。
[0256] 这个结果说明，虽然C/ΕΒΡβ作为一个专门的增强子结合蛋白（CCAAT增强子结合 蛋白），但仍可以结合到基因的启动子区域，从而对下游的基因进行调控。进一步说明C/ EBP β调控下游靶基因的复杂性。
[0257] 实施例11、三氧化二砷和ρ53抑制剂PFT α协同作用抑制Ρ53野生型肿瘤细胞的 生长
[0258] 为比较ρ53野生型细胞和ρ53功能缺失型细胞对三氧化二砷敏感性的不同，本发 明人选择8种实体瘤的肿瘤细胞系，其中乳腺癌MCF7细胞系，结肠癌HCT116细胞系和肺癌 Α549细胞系为ρ53野生型细胞；乳腺癌SKBR3, SUM159, MDA-MB-231细胞系，结肠癌ΗΤ29， SW480细胞系以及肺癌H1299细胞系为p53功能缺失型细胞。图IlA展示各个细胞系的来 源以及细胞中P53的情况。三氧化二砷2. 5 μ M和5 μ M处理48小时后，乳腺癌，结肠癌和 肺癌细胞系中的Ρ53功能缺失型细胞如SKBR3, SUM159, MDA-MAB-231，ΗΤ29和Η1299的生 长受到明显的抑制。而相对来说，三氧化二砷处理对Ρ53野生型肿瘤细胞MCF7, HCT116和 Α549的活性无明显影响（图11Β)。为了进一步验证ρ53功能的缺失可能增强三氧化二砷 的作用，本发明人通过siRNA(序列为：5' -GGAAGACTCCAGTGGTAATCT-3'）在HCT116中干扰 P53蛋白的表达，并筛选p53稳定敲除的HCT116细胞系，HCT116p53-/-。与原来对三氧化 二砷不敏感的HCTl 16细胞相比，在敲除p53之后的HCTl 16p53-/_中，三氧化二砷处理后细 胞生长有明显的抑制（图11B)。
[0259] 本发明人注意到，在相同浓度下三氧化二砷能特异性地抑制p53功能缺失型肿瘤 细胞的生长，但对于P53野生型肿瘤细胞无明显影响。因此本发明人提出，在p53野生型肿 瘤细胞中通过抑制P53的活性来增强三氧化二砷的作用。p53是一个抑癌基因，以抑制p53 作为肿瘤治疗的方式与传统的肿瘤治疗方法相违背，因此一直都没有引起人们的重视。p53 抑制剂PFTa最初用来降低在化疗过程所产生的副反应。但在随后的研究中发现P53抑制 剂PFT a能增强某些抗肿瘤药物的作用，并且没有明显的毒副作用。
[0260] 在p53野生型肿瘤细胞MCF7, HCT116和A549中单独使用三氧化二砷或p53抑制 剂PFT a对肿瘤细胞都无明显影响，但三氧化二砷和P53抑制剂PFT a的合用能明显抑制 肿瘤细胞的生长（图11C)。而在p53突变的SKBR3细胞中，三氧化二砷和p53抑制剂PFT a 没有表现出明显的合用效果（图11C)。
[0261] 三氧化二砷和p53抑制剂PFT a的合用主要通过诱导细胞的凋亡和调节细胞周期 来实现的。在P53野生型肿瘤细胞MCF7, HCTl 16中，与单独使用三氧化二砷或p53抑制剂 PFTa相比，三氧化二砷和P53抑制剂PFT a的合用能明显的增加 Annexin V-PI阳性细胞 的比例（图11D)，并且可以诱导剪切型PARP的出现和降低BCL2的表达（图11E)。在调节 细胞周期方面，三氧化二砷和P53抑制剂PFT a的合用能明显降低HCTl 16和A549细胞中 S期细胞的比例（图11F)。
[0262] 在三氧化二砷处理之后，p53蛋白水平上没有明显的变化，那么p53的存在是如 何抑制三氧化二砷的功能的呢？本发明人发现，三氧化二砷可以激活P53磷酸化形式的表 达，并且这种磷酸化的激活形式可以被P53抑制剂PFT a所抑制（图11G)。
[0263] 实施例12、三氧化二砷和p53抑制剂PFT a协同抑制小鼠皮下肿瘤的生长。
[0264] 本发明人进一步验证在小鼠皮下成瘤的实验中，三氧化二砷和p53抑制剂PFTa 同样具有明显的协同作用。虽然体外实验中，三氧化二砷对HCT116细胞无明显的生长抑制 作用，但在体内的实验中，三氧化二砷可以明显的抑制肿瘤细胞的生长（P = 0.0054)(图 12A和B)。更重要的是，与单独使用三氧化二砷相比，三氧化二砷和p53抑制剂PFT a的合 用更能明显抑制小鼠皮下肿瘤的生长速度（P = 〇. 0002)(图12A和B)。并且与单独使用 三氧化二砷相比，三氧化二砷和P53抑制剂PFT a的合用并没有导致明显的小鼠毒副作用 (图 12C)。
[0265] 本发明人采用乳腺癌细胞系SKBR3作为阳性对照。SKBR3细胞为p53突变型的细 胞，在体外对三氧化二砷的处理表现出明显的凋亡的作用。同样的，在小鼠体内，三氧化二 砷几乎可以完全抑制SKBR3细胞的成瘤作用（图12D)。
[0266] 实施例13、三氧化二砷及三氧化二砷和p53抑制剂PFT a的合用后的表达谱分析
[0267] 为了了解三氧化二砷和p53抑制剂PFT a怎样协同作用抑制肿瘤细胞的生长，本 发明人进行三氧化二砷单用之后HCT116细胞的转录组水平的变化和三氧化二砷联合p53 抑制剂PFT a处理之后的HCTl 16细胞的转录组变化。图13A通过CPP-SOM分析展示top5000 的基因，并且这些基因可以根据其表达量的聚类分为27个cluster(图13B)。可以看出，单 用三氧化二砷之后，基因调变的数目很少，并且变化的程度很小。而三氧化二砷与 P53抑制 剂PFT a联合处理之后，在单独用三氧化二砷中有调变的基因又进一步的变化，并且产生 很多单用三氧化二砷没有调变的基因。
[0268] 通过进一步的数据分析，发现三氧化二砷处理HCT116细胞之后，共178个基因的 表达发生两倍的调变（图13E)，而与p53抑制剂PFT a合用之后，其两倍调变的基因达到 1071个（图13E)。三氧化二砷处理HCT116细胞之后的178个中，153个基因也在p53抑制 剂PFT a合用之后发生调变（图13E)。进一步，通过heatmap图显示这些调变的基因（图 13C 和 D) ο
[0269] 从上面的结果，本发明人可以看出，PFTa通过两方面的机制增强三氧化二砷的作 用。首先，PFTa的加入激活很大一部分在三氧化二砷单独作用时所没有激活的基因，而这 部分基因可能促进细胞的凋亡。还有一部分基因是在三氧化二砷单独作用和三氧化二砷与 PFTa合用时都调变的基因。而这部分基因在三氧化二砷与PFT a合用时的调变的程度要 远比三氧化二砷单独作用时调变的程度高。
[0270] 为了预测三氧化二砷与PFTa合用在结肠癌病人中的治疗效果，本发明人选择三 氧化二砷与PFT a合用调变的基因与临床上结肠癌病人的无病生存时间进行分析。选择在 三氧化二砷与PFT a合用后发生两倍调变的基因作为靶基因，并用这些基因与临床病人的 生存年限进行基因量和病人肿瘤无病生存时间的双向聚类分析。本发明人采用的是网上的 结肠癌病人数据GSE14333。根据三氧化二砷与PFTa合用的靶基因在病人样本中的表达 量，可以将所有的病人分成两组。红色代表一组病人，蓝色代表一组病人（图13F)。然后分 析这两组病人的无病生存期。结果，红色的这组病人有很高的死亡率，而蓝色的这组病人的 死亡率发生的可能性比较低（图13G)。
[0271] 这些数据说明，本发明人提出的三氧化二砷与PFTa合用确实能很好的与病人的 临床数据结合起来，比单独应用三氧化二砷可能具有很好的临床治疗的效果。
[0272] 实施例14、通过sphere体外富集肿瘤干细胞
[0273] 肿瘤细胞具有异质性，在同一肿瘤中，只有部分细胞具有无限增殖、分化和体外 形成克隆的能力，这部分细胞命名为肿瘤干细胞或肿瘤起始细胞（cancer stem cell or cancer initiating cell, CSC)。肿瘤的发生主要是由这群干细胞引起，并且赋予肿瘤侵 袭，转移以及肿瘤的高复发性和高抗药性。在肿瘤疾病的靶向治疗中，肿瘤干细胞已经成为 备受关注的药物设计与筛选的靶点。
[0274] 然而，肿瘤干细胞在肿瘤中的数目很少，为了大量的富集肿瘤干细胞，本发明人采 用sphere的肿瘤干细胞体外富集的方式。本发明人从耐药性以及成瘤能力两个方面验证 富集到的sphere细胞具有肿瘤干细胞的特性。发现，来自卵巢癌A2780的sphere细胞对传 统的肿瘤化疗药物顺钼有明显的耐药性（图14A)。并且与母系的A2780细胞相比，sphere 来源的A2780细胞在NOD-SCID小鼠体内有明显的强的成瘤能力（图14B)。这些结果说明， 本发明人富集到的sphere细胞确实具体肿瘤干细胞的能力。
[0275] 采用sphere体外肿瘤干细胞的模型，本发明人发现芬维A胺（4HPR)能特异性的 抑制卵巢癌，乳腺癌和结肠癌肿瘤干细胞体外模型sphere细胞的形成（图14C)。并且通过 流式细胞仪检测，发现4HPR能特异性的诱导sphere细胞的凋亡，而对母系的细胞没有明显 的影响（图14D)。在AML和CML中，4HPR诱导的肿瘤干细胞的凋亡都与4HPR诱导的ROS 水平的升高有关，那么在实体瘤中4HPR的作用是否也与ROS有关呢？
[0276] 通过DAF-DA的荧光强度，本发明人检测4HPR作用之后的细胞内的ROS的水平。与 未处理组相比，母系细胞和sphere细胞在4HPR处理后，ROS水平都有明显的升高，并且这 种ROS的升高可以被还原剂维生素 C所抑制（图14E)。并且伴随着ROS被维生素 C所抑 制，4HPR诱导的sphere细胞的凋亡也可以被维生素 C所抑制，进一步说明，4HPR是通过诱 导ROS来诱导细胞的凋亡过程（图14F)。
[0277] 实施例15、三氧化二砷，p53抑制剂PFT α以及4HPR的联合作用
[0278] 三氧化二砷也可以作为ROS的诱导剂，从而诱导肿瘤细胞的凋亡。那么三氧化二 砷和4HPR在诱导肿瘤细胞的凋亡上是否有一定的相似性呢？本发明人从4HPR相对敏感的 HT29中选择出4HPR的耐药株HT29/HPR。结果显示，与HT29相比，HT29/HPR对4HPR不敏 感（图15A)。有趣的是，HT29/HPR细胞同样对三氧化二砷有类似的耐药性，而对传统的化 疗药物5-氟尿嘧啶（5Fu)和表阿霉素（EPB)没有耐药性（图15A)。
[0279] 进一步，本发明人比较p53野生型细胞和p53功能缺失型细胞对4HPR敏感性的不 同。与三氧化二砷的作用类似，P53功能缺失型细胞如SKBR3, MDA-MB-231，HT29和H1299的 生长受到明显的抑制。而相对来说，4HPR处理对p53野生型肿瘤细胞MCF7，HCT116和A549 无明显影响（图15B)。
[0280] 为了达到最好的肿瘤治疗的效果，本发明人提出联合三氧化二砷，p53抑制剂 PFTa与芬维A胺4HPR的三联肿瘤治疗模式。在HCTl 16和MCF7细胞中，本发明人发现三 氧化二砷，P53抑制剂PFT a联合芬维A胺比两者的合用都有更明显的肿瘤生长抑制作用 (图15C)。在诱导细胞凋亡方面，三氧化二砷，p53抑制剂PFT a联合芬维A胺比三氧化二 砷与P53抑制剂PFT a两者联合更能诱导AnnexinV-PI凋亡的发生（图15D)。
[0281] 最终，结合以前的结果，三氧化二砷与p53抑制剂PFTa与芬维A胺4HPR可联合用 于抑制肿瘤细胞（图15E)。
[0282] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。
【主权项】
1. 一种用于治疗肿瘤的药盒，其特征在于，所述药盒包括： 三氧化二砷；和 P53抑制剂。2. 如权利要求1所述的药盒，其特征在于，所述药盒中还包括： 芬维A胺或雷帕霉素。3. 如权利要求1所述的药盒，其特征在于，所述的p53抑制剂包括：PFTa;PFTμ;以Ρ53作为沉默靶标的干扰分子。4. 如权利要求1所述的药盒，其特征在于，所述的以ρ53作为沉默靶标的干扰分子是 Ρ53为靶点的小干扰RNA;较佳地，所述的小干扰RNA是序列如SEQIDNO: 1的核酸；更佳 地，所述的小干扰RNA藉由病毒介导进入细胞内发挥干扰作用。5. 如权利要求1所述的药盒，其特征在于，所述的肿瘤是表达p53蛋白的肿瘤，以及缺 失P53蛋白的肿瘤。6. 如权利要求5所述的药盒，其特征在于，所述的肿瘤包括：乳腺癌，肺癌，肠癌，前列 腺癌，淋巴瘤，黑色素瘤，肾癌，胰腺癌，卵巢癌，骨髓瘤。7. 药物组合在制备治疗肿瘤的药盒中的用途；所述的药物组合包括三氧化二砷和p53 抑制剂。8. 如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的药物组合还包括：芬维A胺或雷帕霉 素。9. 如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的p53抑制剂包括：PFTa;PFTy;以 P53作为沉默靶标的干扰分子。10. 如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的治疗肿瘤包括：抑制肿瘤的转移以 及抑制肿瘤的生长。11. 如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤包括：乳腺癌，肺癌，肠癌，前列 腺癌，淋巴瘤，黑色素瘤，肾癌，胰腺癌，卵巢癌，骨髓瘤。12. 三氧化二砷在制备抑制肿瘤转移的药物中的用途。13. 如权利要求12所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤转移是乳腺癌转移。14. 三氧化二砷在制备TGF0或TNFa信号通路的抑制剂中的用途；较佳地，所述的 TGFi3和TNFa信号通路抑制剂抑制肿瘤转移。15. 三氧化二砷在制备治疗p53功能缺失型肿瘤的药物中的用途。16. 如权利要求15所述的用途，其特征在于，所述的p53功能缺失型肿瘤包括：乳腺 癌、结肠癌或肺癌。 17. p53抑制剂在制备抑制肿瘤转移的药物中的用途；较佳地，所述的肿瘤包括：乳腺 癌。18. 如权利要求17所述的用途，其特征在于，所述的p53抑制剂包括：PFTa;PFTy;以 P53作为沉默靶标的干扰分子。 19.C/EBPi3以及C/ΕΒΡβ调控的靶基因在制备诊断乳腺癌转移的诊断试剂中的用途。20. 芬维A胺在制备抑制肿瘤干细胞的药物中的用途；较佳地，所述的肿瘤干细胞是卵 巢癌，乳腺癌和结肠癌的肿瘤干细胞。
【专利摘要】本发明涉及三氧化二砷的抗肿瘤新用途及抗肿瘤制剂。本发明首次揭示了三氧化二砷的抗肿瘤新机制，在此基础上提供了对于抗肿瘤有用的药物或药盒，以及三氧化二砷或相关制剂的新用途。
【IPC分类】A61P35/04, A61P35/00, A61K31/436, A61K49/00, A61K45/00, A61K31/167, A61K33/36, A61K48/00
【公开号】CN105435228
【申请号】CN201410401292
【发明人】张济, 杜艳芝, 王海伟
【申请人】中国科学院上海生命科学研究院
【公开日】2016年3月30日
【申请日】2014年8月14日