1B，CXCL2, LIF，CCL20 ;还有一些基因 如AP0BEC3G，FSCNl，ISG20，GPR153，MANlAl，TNC等与TGFβ和TNFα信号通路不相关。与 MDA-MB-231细胞相比，这些基因在LM2-4175细胞中的表达有明显的升高。而在三氧化二砷 处理之后，这些基因在MDA-MB-231细胞和LM2-4175细胞中又都有明显的下降（图3)。
[0225] 实施例4、三氧化二砷抑制肿瘤的肺转移过程而对肿瘤生长没有明显影响
[0226] 本发明人发现三氧化二砷可以抑制乳腺癌肺转移相关signature基因的表达，那 么三氧化二砷是否可以抑制肿瘤的转移呢？首先在体外的划痕实验中，本发明人发现三氧 化二砷能明显的抑制乳腺癌MDA-MB-231和LM2-4175细胞迁移能力（图4A)。同样在体外 的小室侵袭实验中，三氧化二砷能够抑制穿过小室的肿瘤细胞的数目（图4B-C)。
[0227] 为更好的模拟体内肿瘤侵袭和转移，本发明人建立实验性肺转移模型。将肺转移 亚克隆LM-4175细胞注射于裸鼠尾静脉，然后将小鼠分为PBS对照组和三氧化二砷治疗组。 其中三氧化二砷治疗组小鼠每天注射5mg/kg三氧化二砷，持续注射一个月，8-9周后观察 肺转移情况。与PBS对照组相比，三氧化二砷治疗组小鼠肺转移结点显著减少（图4D)。通 过H&E染色分析，同样的，PBS组可以看到明显的乳腺癌细胞的肺转移的结点，而在三氧化 二砷处理组中，这些结点明显的减少（图4E)。总而言之，细胞水平和动物水平的实验结果 均证实三氧化二砷可以抑制乳腺癌细胞向肺部转移的能力。
[0228] 同时本发明人还检测三氧化二砷是否能够抑制肿瘤的生长。将LM2-4175细胞注 射于小鼠皮下，在肿瘤长到可见的大小时，将小鼠分为两组。PBS对照组和三氧化二砷治疗 组。其中三氧化二砷治疗组小鼠每天注射5mg/kg三氧化二砷，并每隔6天测量肿瘤的大小。 在30天的处理之后，PBS对照组和三氧化二砷处理组之间，小鼠的肿瘤大小没有明显的差 别（图4F和G)。
[0229] 实施例5、三氧化二砷表达谱特征与临床肿瘤病人样本的相关性分析
[0230] 为了进一步验证三氧化二砷在临床上抑制肿瘤细胞转移的可能性，本发明人选择 在三氧化二砷处理后发生两倍调变的基因作为三氧化二砷作用的靶基因，并用这些基因与 临床病人发生转移的数据进行基因表达量和病人肿瘤转移时间的双向聚类分析。本发明人 采用的网上的临床数据是Joan Massagu6分析肺转移的signature时用的数据。根据三氧 化二砷作用靶基因在病人样本中的表达量，本发明人可以将所有的病人分成两组。红色代 表一组病人，蓝色代表一组病人（图5A)。然后分析这两组病人在发生肺转移和骨转移的可 能性。本发明人看到，红色的这组病人有很高的肺转移发生的可能性，而蓝色的这组病人的 肺转移发生的可能性低。而在骨转移上，这两组病人没有明显的区别（图5B)。
[0231] 随后，本发明人又分析HER2，ER，PR在这两组病人中的表达量。可以看到ER，PR在 这两组病人中有明显的差异。而HER2在两组病人中无明显差异（图5C)。并且发现TGF3 信号通路的三个靶基因 ANGPTL4, VEGFA和C/EBP β在这两组病人中的表达量同样具有明显 的差异（图5C)。
[0232] 实施例6、转录因子C/ΕΒΡβ参与三氧化二砷对乳腺癌肺转移相关signature的调 控
[0233] 三氧化二砷可以同时影响乳腺癌肺转移相关signature的多个基因，本发明人认 为三氧化二砷的作用可能是通过影响乳腺癌肺转移中某个重要的转录因子来实现的。尽管 乳腺癌骨转移，肺转移，脑转移的signature相继被鉴定出来，但是什么因素可以特异的调 节这些signature基因还不清楚。本发明人通过motif软件分析乳腺癌肺转移signature 基因的启动子（promoter)区域，筛选可能结合到这些启动子区域的转录因子。经过分析， 本发明人共富集到四个转录因子P〇U3F2，PAX2，NKX62和CEBP (图6A)。通过三氧化二砷对 MDA-MB-231调控的芯片分析，本发明人发现P0U3F2，PAX2和NKX62这三个转录因子在三氧 化二砷处理之后的MDA-MB-231细胞中都没有明显的变化。
[0234] C/EBP (CCAAT 增强子结合蛋白，CCAAT enhancer binding protein)家族包括 C/ EBP a，C/EBP β，C/EBP γ，C/EBP δ，C/EBP ε 和 C/EBP ζ 6 个成员。这 6 个成员中 C/EBP β 和C/EBP Υ在三氧化二砷处理后有明显的上升，而其他的C/EBP家族成员没有明显的变化。 通过荧光实时定量PCR，本发明人进一步验证在三氧化二砷处理之后的MDA-MB-231中，C/ EBP β和C/EBP γ的表达量有明显的升高（图6B)。并且在三氧化二砷处理之后的LM2-4175 细胞中，C/ΕΒΡβ和C/ΕΒΡγ的表达量有明显的升高（图6C)。那么C/ΕΒΡβ和C/ΕΒΡγ中哪 一个在影响乳腺癌的肺转移？本发明人通过Joan Massagu6已经发表的GSE2603这套芯片 数据分析在LM2细胞和MDA-MB-231细胞中C/ΕΒΡβ和C/ΕΒΡγ的表达。与母代MDA-MB-231 相比，在 LM2 细胞中，包括 LM2-4180, LM2-4175, LM2-4173 和 LM2-4142, C/EBP β 的表达量有 明显的升高，而C/EBP γ的表达量没有明显的变化（图6Ε)。通过荧光实时定量PCR，本发 明人进一步发现，跟MDA-MB-231相比，LM2-4175中C/ΕΒΡβ大概有两倍的升高，而C/EBP γ 基本没有变化（图6F)。值得注意的是，在MDA-MB-231来源的，特异性骨转移的BoM-1834 和BoM-1833 (根据互联网已发表的芯片数据）细胞中，C/EBP β和C/EBP γ的表达量都没 有明显的变化。这些结果提示，C/ΕΒΡβ特异性地在肺转移的细胞中高表达，并且参与肿瘤 的肺转移过程。
[0235] 接下来本发明人检测C/ΕΒΡβ在三氧化二砷处理之后的蛋白表达情况。在蛋白水 平上，C/ΕΒΡβ有长的激活形式（LAPl和LAP2)和截短型的抑制形式（LIP)三种。这三种蛋 白是由同一个mRNA，通过不同的翻译起始位点所形成的。其中LAPl和LAP2含有C/ΕΒΡβ 的DNA结合区域和转录激活区域，属于C/ΕΒΡβ的激活形式。而LIP缺少C/ΕΒΡβ的DNA 结合区域，通过与其他C/EBP β isofrom相互作用，以显性负抑制的方式抑制C/EBP β的作 用，属于C/ΕΒΡβ的抑制形式。
[0236] 通过Western Blot实验，检测MDA-MB-231和LM2-4175细胞在5 μ M三氧化二砷 处理0小时，6小时，12小时，24小时和36小时后C/EBP β蛋白的含量。在MDA-MB-231细 胞中，C/ΕΒΡβ蛋白主要以激活的LAP形式存在，并在三氧化二砷处理后，C/ΕΒΡβ三种形式 都有明显的增加（图6G)。在LM2-4175细胞中，C/ΕΒΡβ蛋白的两种形式LAP和LIP均存 在，并且比MDA-MB-231细胞中的表达水平高。在三氧化二砷处理之后，LM-4175在蛋白水 平上C/ΕΒΡβ的表达量也有明显增加（图6G)。
[0237] 实施例7、缺失C/EBP β促进乳腺癌细胞向肺部的转移但不影响肿瘤的生长
[0238] 本发明人采用慢病毒介导的siRNA来敲除MDA-MB-231和LM2-4175中C/EBP β的 表达。利用两对特异性针对C/ΕΒΡβ的siRNA(siRNAl和siRNA2)，以及没有特异性的阴性 对照序列（NC)，转染MDA-MB-231和LM2-4175细胞，48h后检测C/EBP β的干扰效果。
[0239] 结果显示，在MDA-MB-231细胞中C/ΕΒΡβ的mRNA的表达量有明显的下降，跟NC相 t匕，C/ΕΒΡβ的表达量下降80%。而在LM2-4175细胞中，由于C/ΕΒΡβ的本底的表达量比 MDA-MB-231高，因此在同样的病毒滴度下只有40%的下降（图7A)。进一步通过Western 实验，在MDA-MB-231中，跟NC相比，C/ΕΒΡβ三种蛋白的形式都有明显的下降，几乎检测不 到C/ΕΒΡβ的表达。而在LM2-4175细胞中，虽然跟NC相比，C/ΕΒΡβ的表达量有明显的下 降，但是仍有部分的C/ΕΒΡβ的表达（图7B)。
[0240] 为了验证C/ΕΒΡβ缺失对乳腺癌肺转移的影响，本发明人将分别应用SiRNAl和 siRNA2敲除C/EBP β的MDA-MB-231的细胞，以及对应的NC细胞注射到裸鼠的尾静脉，然后 观察小鼠肺转移的情况。当注射4X IO5个细胞时，在8只注射NC细胞的小鼠中都没有发 现肺部的转移结点，而在8只注射SiRNAl和8只注射siRNA2的小鼠中，分别有四只小鼠发 现有肺部的转移灶（图7C)。而当注射IX IO6个细胞时，在9只注射NC细胞的小鼠中，有 4只发现肺部的转移结点，而在6只注射SiRNAl和6只注射siRNA2的小鼠中，所有的小鼠 都发现在肺部有乳腺癌细胞的转移结点。通过计数统计分析，当注射IX IO6个细胞时，每 只NC的小鼠平均有2个肺转移的结点，而当C/ΕΒΡβ缺失后，每只小鼠的肺部转移灶增加 到20多个，明显高于NC小鼠的转移灶（图7D)。这说明C/ΕΒΡβ的缺失有利于乳腺癌细胞 的肺转移过程。
[0241] C/ΕΒΡβ的作用跟肿瘤的免疫环境密切相关，为了排除小鼠的免疫缺陷对实验的 影响，本发明人采用NOD-SCID小鼠重复上述实验。在NOD-SCID小鼠中，本发明人得到类似 的实验结果。在每只NC的小鼠平均有2个肺转移的结点，而当C/ΕΒΡβ缺失后，每只小鼠 的肺部转移灶增加到20多个，明显高于NC小鼠的转移灶（图7E)。
[0242] 本发明人还进一步研究C/ΕΒΡβ的缺失对肿瘤细胞生长的影响。本发明人将分别 应用siRNAl和siRNA2敲除C/EBP β的MDA-MB-231细胞，以及对应的NC细胞注射到裸鼠 的皮下，然后观察肿瘤生长的情况。发现在C/EBP β SiRNA和NC细胞之间没有明显的肿瘤 大小的差别。因此提示C/ΕΒΡβ缺失只影响到肿瘤的肺转移的能力，还没有影响肿瘤皮下 生长的能力（图7F)。
[0243] 实施例8、MDA-MB-231细胞缺失C/EBP β后转录组水平的变化
[0244] 为了了解C/ΕΒΡβ缺失之后的整个转录组水平的变化，本发明人提取 MDA-MB-231NC 细胞，siRNAl 和 siRNA2 细胞的 RNA，并与 Affymetrix (Santa Clara，CA)公司 的Human Genome-U133Plus2.0array芯片杂交。MDA-MB-231的芯片结果有三次重复。通过 数据归一化和数据挖掘，选取P〈〇. 01的基因作为C/ΕΒΡβ调控的靶基因。在MDA-MB-231中 共有3356个基因发生调变。通过heatmap的聚类分析，在MDA-MB-231调变的3356个基因 中有1164个基因被激活，而1692个基因被抑制（图8A)。通过GSEA (Gene Set Enrichment Analysis)分析C/ΕΒΡβ缺失后影响的转录因子。采用FDR q〈0. 25和p value〈0. 05的标 准。首先可以富集到转录因子C/ΕΒΡβ，芯片结果证明确实跟C/ΕΒΡβ有关（图8B)。
[0245] C/ΕΒΡβ也称为核因子白细胞介素-6表达式（NF-IL6)，最初被确定为一个ILl诱 导反式激活因子的IL6基因。早期研究表明，C/ΕΒΡβ和NF-κ B可以实现协同激活IL6的 表达。在GSEA转录因子分析时，除C/ΕΒΡβ，还可以富集到转录因子NF-κΒ (图8B)。这个 结果说明，C/EBP β和NF- κ B协同调控某些基因的表达。也证实本发明人前面的C/EBP β 参与TNFa信号通路的调节作用的结论。但并没有很明显地富集到TGFi3下游的转录因子 SMAD2/3。
[0246] 通过GSEA，本发明人还分析在MDA-MB-231缺失C/ΕΒΡβ之后相关的信号通路。 本发明人发现大部分的信号通路都与免疫反应有关。其中包括抗原加工以及递呈（the antigen processing and presentation)信号通路和 IgA 表达的调控（immune network for IgA production)与B淋巴细胞的功能有关。Toll和NOD样受体通路（Toll，NOD like receptor signaling pathway)以及 T 细胞受体通路（T cell receptor signaling pathway)与T淋巴细胞的功能有关。与自然杀伤性NK细胞有关的自然杀伤性细胞介导的 细胞毒性反应（Natural killer cell mediated cytotoxicity)同样有富集（图 8C)。在 这些通路中，本发明人发现细胞因子和细胞因子受体相互作用（cytokine and cytokine receptor interaction)这条通路有最为明显的富集，因此着重研究参加 C/ΕΒΡβ调控 的细胞因子。这些细胞因子包括TNFa家族如：TNFSF15, TNFRSF9, TNFRSF1B，TNFRSF25， TNFRSFIOD，TNFRSFIOA，TNFRSFIOB 在 C/EBP β 缺失之后有明显的降低，而 TNFRSF21， TNFSF10, RNFRSF14, TNFRSF11B，TNFRSF11A，TNFRSF9 在 C/ΕΒΡβ 缺失之后有明显的升高。 白介素家族中ILIA，IL1B，IL6, IL24, IL7, IL12A，IL7R等在C/ΕΒΡβ缺失之后有明显的降 低，而 IL17RA，IL13RA1，IL11RA，IL2RB，IL15, IL18 在 C/ΕΒΡβ 缺失之后升高。VEGF 家族 VEGFA，VEGFB，VEGFC 和 TGF β 家族基因，包括 ΒΜΡ2, TGFBRl，TGFB2, TGFBl，TGFBR2, BMPR1A， BMPR2, BMPRIB ;以及 CXCL 族包括 CXCL1，CXCL2, CXCL3, CXCLll 等（图 8D)。
[0247] 实施例9、C/EBP β靶基因与临床病人样本的关系分析
[0248] 为了进一步验证C/EBP β在肿瘤转移，特别是乳腺癌肺转移过程中的作用，本发 明人选择在C/EBP β缺失后发生两倍调变的基因作为C/EBP β的靶基因，并用这些基因与 临床病人发生转移的数据进行基因量和病人肿瘤转移时间的双向聚类分析。本发明人采用 网上的临床数据分析肺转移的signature时用的数据。根据C/ΕΒΡβ的靶基因在病人样本 中的表达量，可以将所有的病人分成两组。红色代表一组病人，蓝色代表一组病人（图9A)。 然后分析这两组病人在发生肺转移和发生骨转移的可能性。本发明人发现红色的这组病人 有很高的肺转移发生的可能性，而蓝色的这组病人的肺转移发生的可能性低（图9B)。而在 骨转移上着两组病人没有明显的区别（图9B)。
[0249] 随后，本发明人又分析HER2，ER，PR在这两组病人中的表达量。可以看到ER，PR在 这两组病人中有明显的差异。而HER2没有差异（图9C)。并且本发明人发现C/ΕΒΡβ的 靶基因 ANGPTL4，VEGFA以及和C/EBP β本身在这两组病人中的表达量同样具有明显的差异 (图 9C)。
[0250] 实施例10、C/EBP β通过直接结合到基因的启动子区从而发挥调节作用
[0251] C/ΕΒΡβ是一个转录因子，那么C/ΕΒΡβ是否直接与乳腺癌肺转移相关基因的启 动子区域结合，从而调节这些基因的表达。首先通过荧光素酶实验，检测C/ΕΒΡβ对转移 signature 基因如：ANGPTL4, VCAM1，TNC，ISG20,以及 TNFa 信号通路相关的基因 IL1A， IL1B，CCL20,以及两个在缺失C/ΕΒΡβ之后明显上升的基因 BMP4, IFITl的启动子的影响。 本发明人克隆这些基因的启动子区域，把它们连接到PGL3-basic载体上。并与C/ΕΒΡβ的 表达载体pcDNA3. 0以及作为内参的phRL-SV40共同转染MDA-MB-231细胞
[0252] 因为C/ΕΒΡβ有激活和抑制的两种蛋白亚型，因此，本发明人在pcDNA3. 0上分别 构建这两种不同的C/ΕΒΡβ的形式，包括激活型LAP和抑制型的LIP。本发明人发现，LAPl 的表达能明显激活 ANGPTL4, VCAM1，TNC，ISG20, ILIA，IL1B，CCL20,以及 BMP4, IFITl 的荧 光素酶活性（图10A)。而LIP的表达对这些基因荧光素酶的活性的影响相对比较复杂。在 ANGPTL4中，本发明人没有发现LIP对其启动子的激活作用，而在VCAM1，ILIA，ILlB以及 BMP4, IFITl的启动子区域，本发明人