一种用redv多肽修饰的双亲梳型基因载体及制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用REDV多肽修饰的双亲梳形基因载体及制备方法，属于具有生 物靶向识别功能的基因载体技术领域。
【背景技术】
[0002] 心血管疾病已经成为威胁人类生命的最主要疾病之一。目前对心血管疾病的治疗 主要是采用生物支架材料进行人工血管构建。但是随着弹性回缩、内膜增生和血管重构等 机制的作用，支架材料术后往往引起再狭窄及血栓的发生，危及患者生命。对植入材料表 面实现良好的快速原位内皮化是治疗再狭窄及血栓的有效方法。由于血管内皮细胞具有 区别于其他种类细胞的细胞膜表面膜蛋白，因此利用这些特征的细胞表面膜蛋白构建内皮 细胞特异性识别支架材料，可以有效促进其在体内的特异性识别和快速粘附、增殖与分化。 REDV(精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-缬氨酸）多肽能够与内皮细胞膜表面的α4β 1整合素 发生特异性的识别作用，使得REDV多肽在内皮细胞中可以有效表达，从而提高支架材料在 内皮细胞表面的粘附与增殖。
[0003] 使用带有荧光活性的多肽，不仅能有效控制支架材料表面的多肽含量，而且为支 架材料在体内的示踪、成像提供了可能。
[0004] 基因治疗是一种通过将目的基因转移入机体的靶细胞而治疗疾病的疗法。采用转 基因技术在促进血管材料表面的内皮细胞生长方面的研究越来越受到广泛关注。ZNF580基 因的表达可以促进血管内皮生长因子（VEGF)的表达，并使内皮细胞迁移和增殖活性明显 增强。目前用于基因递送的载体主要分为病毒类和非病毒类。由于非病毒类载体在性能及 安全方面的优势，在实际应用中受到更多青睐。聚乙烯亚胺作为一种非病毒型阳离子基因 载体，具有较高的转运能力和转染效率。但是高分子量的聚乙烯亚胺对生物体具有很高的 毒性，因此设计多位点的基因载体体系，使之能够有效链接小分子量的聚乙烯亚胺，既能保 证有效运载DNA，又能降低体系毒性，是广大基因治疗工作者努力的方向。
[0005] 聚合物类纳米载体，由疏水性聚酯内核和亲水壳层组成，内核的大小和壳层的长 短，都可以通过调节聚合物的分子量得到很好的控制。而且选择生物可降解的高分子聚合 物纳米载体，在体内降解过程中不会影响生物体内的微环境，从而不会对生物体产生一系 列毒副作用。同时，亲水壳层在体内可以屏蔽多余的正电荷，有效促进DNA从溶酶体中解离 出来，使其具有较高的转染效率。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是在提供一种具有转染活性高，生物靶向识别性能好，生物降解性 能佳，生物毒性低，体外检测快捷方便的用REDV多肽修饰的双亲梳形基因载体。
[0007] 本发明的第二个目的是提供一种用REDV多肽修饰的双亲梳形基因载体的制备方 法。
[0008] 本发明的技术方案概述如下：
[0009] -种用REDV多肽修饰的双亲梳形基因载体，是用式（I)所示：
[0011] 其中：x+y = 10-114, x:y = (1-7) :1 ;
[0012] η = 27-40 ；
[0013] m = 45-114 ；
[0014] 43ml+86m2 = 1740 ；
[0015] REDVW是由精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-缬氨酸-色氨酸构成的多肽；
[0017] -种用REDV多肽修饰的双亲梳形基因载体的制备方法，包括如下步骤：
[0018] (1)带苯环基的聚甲基丙烯酸羟乙酯梳型大分子引发剂（II)的制备：
[0019] 在氮气氛保护下，将甲基丙烯酸羟乙酯，催化剂溴化亚铜和2, 2' -联吡啶，以及引 发剂1-溴乙基苯加入到溶剂无水丁酮中使溶解，密封后在液氮冷却下，反复进行抽真空、 通氮气操作3-5次，在60-80°C反应16-24h得混合液，混合液用二氯甲烷稀释后过硅胶柱 或中性氧化铝柱除去未反应的溴化亚铜，然后用冰乙醚沉淀后真空干燥得到式（II)所示 的带苯环基的聚甲基丙烯酸羟乙酯梳型大分子引发剂，所述甲基丙烯酸羟乙酯、溴化亚铜、 2, 2'-联吡啶和1-溴乙基苯的摩尔比为（200-600) : (0· 8-1. 2) : (1. 6-2. 4) :1，其中x+y = 10-114 ；
[0020] (2)疏水性聚酯内核（III)的制备：
[0021] 在氮气氛保护下，将式（II)所示的大分子引发剂加入到溶剂无水N，N_二甲基甲 酰胺或无水二甲基亚砜中使溶解，加入ε -己内酯和起催化作用的辛酸亚锡密封后，反复 进行抽真空、通氮气操作3-5次，在110-140°C聚合反应20-26h，冷却到室温，用二氯甲烷或 三氯甲烷溶解得到粗产物，粗产物经冰甲醇或冰乙醚沉析、分离，沉淀物真空干燥后得到白 色的式（III)所示的疏水性聚酯内核，所述ε -己内酯与式（II)所示的大分子引发剂的 摩尔比为（30-45) :1,所述辛酸亚锡与ε-己内酯的摩尔比为1 :(800-1200),其中：x+y = 10-114, η = 27-40 ；
[0022] (3)羧基端疏水性聚酯内核（IV)的制备：
[0023] 在氮气氛保护下，将式（III)所示的疏水性聚酯内核，丁二酸酐以及催化剂4-二 甲氨基吡啶，缚酸剂三乙胺加入到溶剂无水二氧六环或无水吡啶中使溶解，在室温搅拌反 应20-35 h，在冰甲醇或冰乙醚中沉析得到粗产物，真空干燥，干燥物用N，N-二甲基甲酰 胺或二甲基亚砜溶解，用截留分子量为5000-14000的透析管在蒸馏水中透析48-60h，冷冻 干燥，得到白色的羧基端疏水性聚酯内核（IV)，所述（III)所示的疏水性聚酯内核、丁二酸 酐、4-二甲氨基吡啶和三乙胺的摩尔比为1: (50-250) : (50-250) : (17-200)，其中：x+y = 10-114, η = 27-40 ;
[0024] (4)带两种亲水段修饰的梳型聚合物（V)的制备：
[0025] 在氮气氛保护下，将式（IV)所示的羧基端疏水性聚酯内核、（1-(3-二甲氨基丙 基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺、4-二甲氨基吡啶、分子量为2000-5000 的聚乙二醇单甲醚、分子量为1800的支链的聚乙烯亚胺以摩尔比1 :(30-200) :(20-135): (10-65) :(10-60) :(17-113)加入到混合溶剂中使溶解，在室温搅拌反应18-28h，用截留分 子量为5000-14000的透析管在蒸馏水中透析48-60h，冷冻干燥，得到白色的带两种亲水 段修饰的梳型聚合物（V);其中 x+y = 10-114, x:y = (1-7) :1，η = 27-40, m = 45-114 ; 43ml+86m2 = 1740 ;所述混合溶剂由体积比为（1-5) :1的二甲基亚砜和二氯甲烷，或由体 积比为（1-5) :1的二甲基亚砜和三氯甲烷组成；
[0026] (5)在氮气氛保护下，按比例将1质量份的式（V)所示的带两种亲水段修饰的梳型 聚合物和〇. 1-0. 2质量份的分子量为2000的端基为吡啶二硫基和琥珀酰亚胺酯基修饰的 异端聚乙二醇，加入到混合溶剂中使溶解，在暗室中于室温下反应2-4h，加入CREDVW多肽， 室温下反应4-6h，产物用截留分子量为5000-14000的透析管在蒸馏水中透析48-60h，冷冻 干燥，得到白色的用REDV多肽修饰的双亲梳形基因载体（I)，所述混合溶剂为体积比1:1的 pH = 7. 4的0. lmol/L磷酸缓冲溶液和二甲基亚砜；所述CREDVW为半胱氨酸-精氨酸-谷 氨酸-天冬氨酸-缬氨酸-色氨酸；所述CREDVW多肽与所述分子量为2000的端基为吡啶 二硫基和琥珀酰亚胺酯基修饰的异端聚乙二醇的质量比为（0. 17-0. 35) :1 ;
[0027] 反应路线为：
[0029] 其中：x+y = 10-114, x:y = (1-7) : 1 ;
[0030] η = 27-40 ；
[0031] m = 45-114 ;
[0032] 43ml+86m2 = 1740 ；
[0034] REDVW是由精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-缬氨酸-色氨酸构成的多肽。
[0035] 本发明的一种用REDV多肽修饰的双亲梳形基因载体可以负载基因，生物毒性低， 靶向识别性能好。由聚甲基丙烯酸羟乙酯构成的大分子主链可以有效链接小分子量的聚乙 烯亚胺阳离子载体，使其可以高效负载基因。聚合物表面的亲水壳层聚乙二醇可以屏蔽多 余的正电荷，有效促进DNA从溶酶体中解离出来，提高其转染效率。REDV多肽可以有效与内 皮细胞膜表面的蛋白结合，提高聚合物材料在内皮细胞表面的粘附。同时可以通过荧光的 方法检测链接在聚合物表面的多肽含量，为本发明的基因载体在生物体内的示踪、成像提 供了可能。
【附图说明】
[0036] 图1为带苯环基的聚甲基丙烯酸羟乙酯梳型大分子引发剂（II)的1H NMR图，图 中出现了该引发剂结构中存在的各种氢质子核磁共振峰，证明了所制备产物的结构组成。
[0037] 图2为疏水性聚酯内核（III)的1H NMR图，图中出现了该疏水性聚酯内核结构中 存在的各种氢质子核磁共振峰，证明了所制备产物的结构组成。
[0038] 图3为羧基端疏水性聚酯内核（IV)的1H NMR图，图中出现了该羧基端疏水性聚 酯内核结构中存在的各种氢质子核磁共振峰，证明了所制备产物的结构组成。
[0039] 图4为带两种亲水段修饰的的梳型聚合物（V)的1H NMR图，图中出现了这种带两 种亲水段修饰的梳型基因载体结构中存在的各种氢质子核磁共振峰，证明了所制备产物的 结构组成。
[0040] 图5为用REDV多肽修饰的双亲梳形基因载体的动态光散射粒径分布图。从图中 可以看出纳米粒粒径分布均匀，平均粒径在l〇〇nm左右。
[0041] 图6为用REDV多肽修饰的双亲梳形基因载体的透射电镜图。从图中可以看出纳 米粒呈近圆形分布，干态下的平均粒径在50nm左右。
[0042] 图7为荧光性能比较图，其中：1为带两种亲水段修饰的梳型聚合物（V) ;2为用 REDV多肽修饰的双亲梳形基因载体（I) ;3为CREDVW多肽；从图中可以看出用REDV多肽修 饰的双亲梳形基因载体（I)在360nm处出现REDV多肽中色氨酸的发射峰，而未载多肽的带 两种亲水段修饰的梳型聚合物（V)则在此处没有发射峰出现，证明了 CREDVW多肽连接成 功。
[0043] 图8为不同氮（载体）磷（基因）比时，用REDV多肽修饰的双亲梳形基因载体 与ZNF580基因混合物的凝胶成像电泳图。从1-7分别是氮磷比为0,1，3, 5,10,15, 20