一种用redv多肽修饰的双亲梳型基因载体及制备方法_3

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II-2)。
[0091] 采用N,N-二甲基甲酰胺做溶剂,利用乌式粘度计在30°C恒温水浴中测定PHEMA 的粘度,通过Mark-Houwink方程= 计算得到PHEMA的粘均分子量(α = 〇. 78, K = 7· 9Χ 10 2cm3/g)为 15023。x+y = (15023-184)/130 = 114。
[0092] 4 NMR(DMS0-d6, δ,ppm) :4. 812 (OH),3· 905 (C00CH2),3· 595 (CH20H),1· 783 (CH2CC H3),0· 776 (CH2CCH3)。
[0093] (2)疏水性聚酯内核(III-2)的制备:
[0094] 在氮气氛保护下,将制得的lmmol PHEMA(II-2)加入到无水二甲基亚砜中使溶解, 搅拌均匀后加入ε -己内酯和催化剂辛酸亚锡密封后,反复进行抽真空,通氮气操作4次 后,在120°C聚合反应24小时,冷却到室温,用三氯甲烷溶解得到粗产物,粗产物经冰甲醇 沉析、分离,沉淀物真空干燥后得到白色的PHEMA-PCL(III-2)。
[0095] ε -己内酯与PHEMA的摩尔比为38:1,为38mmol ;所述辛酸亚锡与ε -己内酯的 摩尔比为 1:1000,为 〇· 〇38mmol。
[0096] NMR (CDCl3-d, δ , ppm) :4.079 (CO (CH2) (CH2) 3 (CH2) 0C0) ,3.668 (CO (CH2) (CH2) 3 (CH2) OH), 2. 327 (CO (CH2) (CH2) 3 (CH2) 0C0), 1. 400, 1. 664 (CO (CH2) (CH2) 3 (CH2) 0C0), x+y =95。
[0097] 通过聚ε -己内酯上的亚甲基(C0(CH2) (CH2)3(CH2)0C0)的特征吸收峰面积和末 端ε-己内酯上的亚甲基(C0(CH2)(CH2)3(CH2)0H)的特征吸收峰面积比得到主链上连接 ε -己内酯的重复单元数为32,即η = 32。
[0098] (3)羧基端疏水性聚酯内核(IV-2)的制备:
[0099] 在氮气氛保护下,将 lmmol PHEMA-PCL(III-2),250mmol 丁二酸酐,250mmol 催化 剂4-二甲氨基吡啶和200mmol缚酸剂三乙胺加入到无水吡啶中使溶解,在室温搅拌反应 35小时,在冰甲醇中沉析得到粗产物,真空干燥,干燥物用二甲基亚砜溶解,用截留分子量 为14000的透析管在蒸馏水中透析60h,冷冻干燥,得到白色的PHEMA-PCL-C00H(IV-2)。4 NMR (CDCl3-d,δ,ppm) : 4. 079 (CO (CH2) (CH2) 3 (CH2) 0C0),2. 670 (C0CH2CH2C0),2. 327 (CO (CH2) (CH2) 3 (CH2) 0C0),1. 402, 1. 663 (CO (CH2) (CH2) 3 (CH2) 0C0);
[0100] x+y = 114, n = 32。
[0101] (4)带两种亲水段修饰的梳型聚合物(V-2)的制备:
[0102] 在氮气氛保护下,将 lmmol PHEMA-PCL-C00H(IV-2), 200mmol 1-(3-二甲氨基丙 基)-3_乙基碳二亚胺,135mmol N-羟基丁二酰亚胺,65mmol 4-二甲氨基批陡,60mmol分 子量为3500的聚乙二醇单甲醚和113mmol分子量为1800的支链的聚乙烯亚胺加入到5mL 二甲基亚砜和lmL三氯甲烷的混合溶剂中使溶解,在室温搅拌反应18h,用截留分子量为 14000的透析管在蒸馏水中透析60h,冷冻干燥,得到白色的PHEMA-PCL-PEI-PEG(V-2)。4 NMR(CDCl3-d,δ,ppm) :4· 081 (C0(CH2) (CH2)3(CH2)0⑶),3. 681 (0CH2CH2),3. 401 (CH30),3. 1 56-2. 408 (NHCH2CH2NH),2. 327 (CO (CH2) (CH2) 3 (CH2) 0⑶),1. 665, 1. 403 (CO (CH2) (CH2) 3 (CH2) 〇H);
[0103] 通过聚乙二醇单甲醚上的亚甲基(0CH2CH2)的特征吸收峰面积和聚乙烯亚胺上的 亚甲基(NHCH2CH2NH)的特征吸收峰面积比得到x:y = 3:1。
[0104] 其中 x+y = 114, η = 32, m = 80, 43ml+86m2 = 1740。
[0105] 实验证明,用二氯甲烷替代本步骤中的三氯甲烷,其它同本步骤,可以完成本步 骤。
[0106] (5)在氮气氛保护下,将 10mg PHEMA-PCL-PEI-PEG(V-2)和 2mg 分子量为 2000 的0PSS-PEG-NHS用3mL pH = 7. 4的0. lmol/L磷酸缓冲溶液和3mL二甲基亚砜的混合 溶剂溶解,在暗室中于室温下反应3h,加入0. 34mg CREDVW多肽,室温下反应6h,产物 用截留分子量为14000的透析管在蒸馏水中透析60h,冷冻干燥,得到白色的用REDV多 肽修饰的双亲梳形基因载体PHEMA-PCL-PEI-PEG-REDV (I-2)。在激发波长为290nm时, PHEMA-PCL-PEI-PEG-REDV在360nm处有明显的荧光发射峰。
[0107] 反应路线同实施例 1,其中:x+y = 114, x:y = 3:1,η = 32, m = 80, 43ml+86m2 = 1740。
[0108] 经测定:CREDVW多肽的质量占式(1-2)总质量的1%。
[0109] 实施例3:用REDV多肽修饰的双亲梳形基因载体的制备方法,包括如下步骤:
[0110] (1)带苯环基的聚甲基丙烯酸羟乙酯梳型大分子引发剂(Π -3)的制备:
[0111] 在氮气氛保护下,将聚合管高温烘烤除水,自然冷却后在鼓吹氮气流的同时,依次 加入20mmol甲基丙烯酸轻乙酯反应单体,0. lmmol溴化亚铜和0. 2mmol 2, 2' -联批陡催 化剂以及〇. lmmol 1-溴乙基苯引发剂到无水丁酮溶剂中使溶解,密封后在液氮冷却下, 反复进行抽真空,通氮气操作4次,在70°C反应16小时得混合液,混合液用二氯甲烷稀 释后过中性氧化铝柱除去未反应的溴化亚铜,然后用冰乙醚沉淀后真空干燥得白色产物 PHEMA(II-3) 〇
[0112] 采用N,N_二甲基甲酰胺做溶剂,利用乌式粘度计在30°C恒温水浴中测定PHEMA的 粘度,通过Mark-Houwink方程= 计算得到PHEMA的粘均分子量(α = 〇. 78, K = 7. 9 X 10 2cm3/g)为 15023。x+y = (1484-184)/130 = 10。
[0113] 4 NMR(DMS0-d6, δ,ppm) :4. 810(0H), 3. 905(C00CH2),3. 596(CH20H),1. 783(CH2CC H3),0· 778 (CH2CCH3)。
[0114] (2)疏水性聚酯内核(III-3)的制备:
[0115] 在氮气氛保护下,将制得的lmmol PHEMA(II-3)加入到无水二甲基亚砜溶剂中使 溶解,搅拌均匀后加入ε -己内酯和催化剂辛酸亚锡密封后,反复进行抽真空,通氮气操作 5次后,在140°C聚合反应20小时,冷却到室温,用三氯甲烷溶解得到粗产物,粗产物经冰乙 醚沉析、分离,沉淀物真空干燥后得到白色的PHEMA-PCL(III-3)。
[0116] ε -己内酯与PHEMA的摩尔比为45:1,为45mmol ;所述辛酸亚锡与ε -己内酯的 摩尔比为 1:1200,为 0· 038 μ mol。
[0117] NMR (CDCl3-d, δ , ppm) : 4. 080 (CO (CH2) (CH2) 3 (CH2) 0C0) ,3.668 (CO (CH2) (CH2) 3 (CH2) OH), 2. 327 (CO (CH2) (CH2) 3 (CH2) 0C0), 1. 400, 1. 664 (CO (CH2) (CH2) 3 (CH2) OH), x+y =10〇
[0118] 通过通过聚ε -己内酯上的亚甲基(C0(CH2) (CH2)3(CH2)0C0)的特征吸收峰面积和 末端ε-己内酯上的亚甲基(C0(CH2)(CH2)3(CH2)0H)的特征吸收峰面积比得到主链上连接 ε -己内酯的重复单元数为40,即η = 40。
[0119] (3)羧基端疏水性聚酯内核(IV-3)的制备:
[0120] 在氮气氛保护下,将 lmmol PHEMA-PCL(III-3),50mmol 丁二酸酐,50mmol 催化剂 4-二甲氨基吡啶和17mmol缚酸剂三乙胺加入到无水二氧六环中使溶解,在室温搅拌反应 20小时,在冰乙醚中沉析得到粗产物,真空干燥,干燥物用二甲基亚砜溶解,用截留分子量 为5000的透析管在蒸馏水中透析50h,冷冻干燥,得到白色的PHEMA-PCL-C00H(IV-3)。4 NMR(CDCl3-d,S,ppm):4.082(C0(CH2)(CH 2)3(CH2)0C0),2.671(raCH2CH 2C0),2.327(ra(CH2) (CH2) 3 (CH2) 0C0), 1. 402, 1. 664 (CO (CH2) (CH2) 3 (CH2) 0C0);
[0121] x+y = 10, n = 40〇
[0122] (4)带两种亲水段修饰的梳型聚合物(V-3)的制备:
[0123] 在氮气氛保护下,将 lmmol PHEMA-PCL-C00H(IV-3),30mmol 1-(3-二甲氨基丙 基)-3_乙基碳二亚胺,20mmol N-羟基丁二酰亚胺,lOmmol 4-二甲氨基批陡,lOmmol分 子量为5000的聚乙二醇单甲醚和17mmol分子量为1800的支链的聚乙烯亚胺加入到3mL 三氯甲烷和3mL二甲基亚砜的混合溶剂中使溶解,在室温搅拌反应28h,用截留分子量为 5000的透析管在蒸馏水中透析50h,冷冻干燥,得到白色的PHEMA-PCL-PEI-PEG(V-3)。4 NMR (CDCl3-d,δ,ppm) : 4. 081 (CO (CH2) (CH2) 3 (CH2) 0⑶),3. 680 (0CH2CH2),3. 401 (CH30),3. 1 54-2. 400 (NHCH2CH2NH),2. 327 (CO (CH2) (CH2) 3 (CH2) 0⑶),1. 6
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