的用 REDV多肽修饰的双亲梳形基因载体与ZNF580基因的混合物。从图中可以看出当氮磷比大 于等于10时用REDV多肽修饰的双亲梳形基因载体就可以很好的阻滞ZNF580基因的迁移， 说明当氮磷比大于等于10时用REDV多肽修饰的双亲梳形基因载体可以和ZNF580基因形 成稳定的包结物。
[0044] 图9为实施例6中PHEMA-PCL-PEI-PEG-REDV基因载体与ZNF580基因复合物对 EA. hy926细胞的转染结果。PHEMA-PCL-PEI-PEG-REDV基因载体与DNA的N/P比为20。
【具体实施方式】
[0045] 半胱氨酸-精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-缬氨酸-色氨酸的多肽简称为CREDVW， 委托上海吉尔生化有限公司制备。
[0046] 分子量为2000的端基为吡啶二硫基和琥珀酰亚胺酯基修饰的异端聚乙二醇简称 为0PSS-PEG-NHS，购于北京键凯科技有限公司。
[0047] 分子量为2000-5000的聚乙二醇单甲醚，购于天津希恩思生化科技有限公司。
[0048] 分子量为1800的支链的聚乙烯亚胺，购于天津希恩思生化科技有限公司。
[0049] 1-溴乙基苯购于百灵威科技有限公司。
[0050] 式（II)所示的带苯环基的聚甲基丙烯酸羟乙酯梳型大分子引发剂简称为PHEMA。
[0051] 式（III)所示的疏水性聚酯内核简称为PHEMA-PCL。
[0052] 式（IV)所示的羧基端疏水性聚酯内核简称为PHEMA-PCL-C00H。
[0053] 式（V)所示的带两种亲水段修饰的梳型聚合物简称为PHEMA-PCL-PEI-PEG。
[0054] 式⑴所示的用REDV多肽修饰的双亲梳形基因载体简称为 PHEMA-PCL-PEI-PEG-REDV。
[0055] 式（I)中的
代表没有连接巯基的半胱氨酸C。
[0056] 带两种亲水段修饰的梳型聚合物（V)通过聚乙烯亚胺的氨基与0PSS-PEG-NHS中 的琥珀酰亚胺酯反应，将0PSS-PEG-NHS引入到带两种亲水段修饰的梳型聚合物（V)表面， 再通过半胱氨酸的巯基与0PSS-PEG-NHS的吡啶二硫基反应，从而制备得到用REDV多肽修 饰的双亲梳形基因载体。通过检测色氨酸的荧光发射峰，判断CREDVW多肽成功连接。
[0057] 实施例1:用REDV多肽修饰的双亲梳形基因载体的制备方法，包括如下步骤：
[0058] (1)带苯环基的聚甲基丙烯酸羟乙酯梳型大分子引发剂（II-1)的制备：
[0059] 在氮气氛保护下，将聚合管高温烘烤除水，自然冷却后在鼓吹氮气流的同时，依次 加入37.0臟〇1甲基丙烯酸轻乙酯反应单体，0.0581111]1〇1溴化亚铜和0.1171111]1〇12,2'-联 吡啶催化剂以及〇.〇73mmol 1-溴乙基苯引发剂到无水丁酮溶剂中使溶解，密封后在液氮 冷却下，反复进行抽真空，通氮气操作3次，在60°C反应20小时得混合液，混合液用二氯 甲烷稀释后过硅胶柱除去未反应的溴化亚铜，然后用冰乙醚沉淀后真空干燥得白色产物 PHEMA(II-l) 〇
[0060] 采用N，N-二甲基甲酰胺做溶剂，利用乌式粘度计在30°C恒温水浴中测定PHEMA的 粘度，通过Mark-Houwink方程=人计算得到PHEMA的粘均分子量（α = 〇. 78, K = 7.9X102cm3/g)为 12500。x+y= (12500-184)/130 = 95。
[0061] 4 NMR(DMS0-d6, δ，ppm) :4. 810 (0H)，3. 905 (C00CH2)，3. 585 (CH20H)，1. 783 (CH2CC H3), 0· 775(CH2CCH3)。见图 1。
[0062] (2)疏水性聚酯内核（III-l)的制备：
[0063] 在氮气氛保护下，将制得的0. 0133mmol PHEMA(II-l)加入到无水Ν,Ν-二甲基甲 酰胺溶剂中使溶解，搅拌均匀后加入ε -己内酯和催化剂辛酸亚锡密封后，反复进行抽真 空，通氮气操作3次后，在11(TC聚合反应26小时，冷却到室温，用二氯甲烷溶解得到粗产 物，粗产物经冰乙醚沉析、分离，沉淀物真空干燥后得到白色的PHEMA-PCL(ΙΙΙ-1)。
[0064] ε-己内酯与ΡΗΕΜΑ的摩尔比为30:1，为0. 399mmol ;所述辛酸亚锡与ε-己内酯 的摩尔比为1:800,为0. 5 μ mol。
[0065] NMR (CDCl3-d, δ , ppm) :4.079 (CO (CH2) (CH2) 3 (CH2) 0C0) ,3.668 (CO (CH2) (CH2) 3 (CH2) OH), 2. 327 (CO (CH2) (CH2) 3 (CH2) OCO), 1. 400, 1. 664 (CO (CH2) (CH2) 3 (CH2) OCO), x+y =95。
[0066] 通过聚ε -己内酯上的亚甲基（C0(CH2) (CH2)3(CH2)0C0)的特征吸收峰面积和末 端ε-己内酯上的亚甲基（C0(CH2)(CH2)3(CH2)0H)的特征吸收峰面积比得到主链上连接 ε -己内酯的重复单元数为27,即η = 27。见图2。
[0067] (3)羧基端疏水性聚酯内核（IV-1)的制备：
[0068] 在氮气氛保护下，将 13. Ομπιο? PHEMA-PCL(III-l)，0· 976mmol 丁二酸酐， 0. 976mmol催化剂4-二甲氨基吡啶和326 μ mol缚酸剂三乙胺加入到30mL无水二氧六环中 使溶解，在室温搅拌反应24小时，在冰乙醚中沉析得到粗产物，真空干燥，干燥物用N，N-二 甲基甲酰胺溶解，用截留分子量为7000的透析管在蒸馏水中透析48h，冷冻干燥，得到白色 的 PHEMA-PCL-C00H (IV-1)。4 NMR (CDCl3-d，δ，ppm) : 4. 081 (CO (CH2) (CH2) 3 (CH2) 0C0)，2. 6 71 (C0CH2CH2C0)，2. 327 (CO (CH2) (CH2) 3 (CH2) OCO)，1. 402, 1. 665 (CO (CH2) (CH2) 3 (CH2) OCO);见 图3。
[0069] x+y = 95, η = 27。
[0070] (4)带两种亲水段修饰的梳型聚合物（V-l)的制备：
[0071] 在氮气氛保护下，将 1. 22μπιο1 PHEMA-PCL-C00H(IV-1)，0. 122mmol 1-(3-二 甲氨基丙基）_3_乙基碳二亚胺，0. 073mmol N-羟基丁二酰亚胺，0. 049mmol 4-二甲氨 基吡啶，0. 0245mmol分子量为2000的聚乙二醇单甲醚和0. 067mmol分子量为1800的 支链的聚乙烯亚胺加入到4mL二甲基亚砜和2mL三氯甲烷的混合溶剂中使溶解，在室温 搅拌反应24h，用截留分子量为7000的透析管在蒸馏水中透析48h，冷冻干燥，得到白色 的 PHEMA-PCL-PEI-PEG(V-l)。4 匪R(CDCl3-d, S，ppm):4.081〇：0(CH2)(CH2)3(CH 2)(XO )，3. 680(0CH2CH2)，3· 401 (CH30)，3· 154-2. 401 (NHCH2CH2NH), 2. 327(C0(CH2) (CH2)3(CH2) 0C0), 1. 665, 1. 403(C0(CH2) (CH2)3(CH2)0C0);见图 4。
[0072] 通过聚乙二醇单甲醚上的亚甲基（0CH2CH2)的特征吸收峰面积和聚乙烯亚胺上的 亚甲基（NHCH2CH2NH)的特征吸收峰面积比得到x:y = 7:1。
[0073] 其中 x+y = 95, η = 27, m = 45, 43ml+86m2 = 1740 ;
[0074] 实验证明，用二氯甲烷替代本步骤中的三氯甲烷，其它同本步骤，可以完成本步 骤；
[0075] (5)在氮气氛保护下，将 60mg PHEMA-PCL-PEI-PEG(V-l)和 7. 5mg 分子量为 2000 的0PSS-PEG-NHS用3mL pH = 7. 4的0. lmol/L磷酸缓冲溶液和3mL二甲基亚砜的混合 溶剂溶解，在暗室中于室温下反应4h，加入2. 63mg CREDVW多肽，室温下反应4h，产物 用截留分子量为10000的透析管在蒸馏水中透析48h，冷冻干燥，得到白色的用REDV多 肽修饰的双亲梳形基因载体PHEMA-PCL-PEI-PEG-REDV (I-1)。在激发波长为290nm时， PHEMA-PCL-PEI-PEG-REDV在360nm处有明显的荧光发射峰。见图7。
[0076] 反应路线为：
[0077]
[0083] REDVW是由精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-缬氨酸-色氨酸构成的多肽。
[0084] 通过测定不同浓度的纯CREDVW多肽在360nm处的荧光发射峰强度，得到荧光发射 峰强度和CREDVW多肽浓度的标准曲线方程：Y = 5429. 3C(mg/mL)+12. 3(R2 = 0. 999)，
[0085] 测定式（1-1)所示物质在360nm处的荧光发射峰强度，通过以上标准曲线方程计 算出式（1-1)中含有的CREDVW多肽的质量，从而测定得到：CREDVW多肽的质量占式（1-1) 总质量的2%。
[0086] 检测实施例1制备的用REDV多肽修饰的双亲梳形基因载体（1-1)在水溶液中的 粒径分布，其范围在30-200nm之间，平均粒径在100nm左右，见图5。在干态下的粒径在 30-100nm之间，平均粒径在50nm左右，见图6。
[0087] 在中性水溶液中表面Zeta电位为15_33mv。
[0088] 实施例2:用REDV多肽修饰的双亲梳形基因载体的制备方法，包括如下步骤：
[0089] (1)带苯环基的聚甲基丙烯酸羟乙酯梳型大分子引发剂（II-2)的制备：
[0090] 在氮气氛保护下，将聚合管高温烘烤除水，自然冷却后在鼓吹氮气流的同时，依次 加入600mmol甲基丙烯酸轻乙酯反应单体，1. 2mmol溴化亚铜和2. 4mmol 2, 2' -联批陡催化 剂以及lmmol 1-溴乙基苯引发剂到无水丁酮溶剂中使溶解，密封后在液氮冷却下，反复进 行抽真空，通氮气操作5次，在80°C反应24小时得混合液，混合液用二氯甲烷稀释后过中性 氧化铝柱除去未反应的溴化亚铜，然后用冰乙醚沉淀后真空干燥得白色产物PHEMA(