一种检测肝癌标志物bmi1抗原表位氨基酸序列及应用
【专利说明】一种检测肝癌标志物BM11抗原表位氨基酸序列及应用
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技术领域
[0002] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种通过生物信息学模拟筛选的具有检测肝 癌标志物BMIl多肽片段。
【背景技术】
[0003] 肝癌是目前我国发病率和致死率位居第二位的恶性肿瘤，每年约有30万例新发 肝癌，占全球50%以上。肝癌发展迅速、易转移，是目前治疗最困难、预后最差的恶性肿瘤之 一。然而，相对于乳腺癌、肺癌和前列腺癌等其他类型的恶性肿瘤，至今仍缺乏对肝癌发病 相关肿瘤标志物分子认识。大量研究表明，血清或血浆中的肿瘤相关抗原能诱导机体产生 自身抗体，在肿瘤患者血清中既存在肿瘤抗原，也存在针对该肿瘤抗原的自身抗体。因此， 既可以利用抗体检测肿瘤抗原，也可以利用抗原检测肿瘤抗原的自身抗体，但利用肿瘤自 身抗体检测肿瘤的特异性和敏感性均比利用肿瘤抗原检测肿瘤要高得多。很多肿瘤相关抗 原不仅在肿瘤患者体内存在，在正常人体内也存在，因此检测肿瘤相关抗原作为诊断依据 可信性差。而肿瘤自身抗体在正常人体内含量很低检测不到或根本不存在，若体内肿瘤自 身抗体水平明显增高，则表明体内存在异常免疫情况，表明体内相关抗原水平发生波动，预 示疾病的存在或原有疾病加重。
[0004] 近年来的研究表明，在恶性肿瘤体积发展到可用现代影像学技术检出之前3-5 年，患者血中可出现高浓度的肿瘤相关抗原自身抗体。因此，检测血中肿瘤相关抗原自身抗 体具有预测肿瘤发病风险和早期诊断肿瘤的重要价值。是肿瘤临床诊断领域的重点发展方 向之一。在国外已有诊断肺癌和乳腺癌的早期诊断试剂盒市售。然而，目前所报道的自身 抗体检测方法敏感度低，特异性差，假阴性比率可高达50%以上。其主要原因是由于每一种 肿瘤相关抗原自身抗体在癌症患者中的阳性检测率平均在10%左右。如何提高诊断试剂敏 感度是当前需要亟待解决的关键问题。比较行之有效的方法是寻找新的可充当肿瘤标志物 的自身抗体，然后与现有已知的肿瘤相关抗原自身抗体组合成具有敏感度高和特异性强的 诊断试剂盒。
[0005] BMIl是PcG基因家族的核心成员之一，1991年在鼠淋巴瘤中首次被发现，它作为 一种原癌基因与另一种癌基因 c-myc协同作用，引起细胞转化和肿瘤形成。BMI在肿瘤的 发生、发展、浸润转移中起着非常重要的作用。研究发现BMIl介导肿瘤进展的机制如下： ① BMI1可抑制InkVArf基因位点。InkVARF位点是BMI1基因的关键下游靶点，位于人体 染色体9P21位点，编码细胞周期中两个相互联系的蛋白P16Ink4A和PHArf ;②端粒酶逆 转录酶可诱导端粒酶活性，在人正常组织细胞中，端粒酶逆转录酶的表达在出生后即被抑 制，因此端粒酶活性呈现阴性。BMIl基因可诱导下游基因端粒酶逆转录酶表达，在端粒酶 激活、细胞永生化、阻止细胞衰老、介导细胞恶性转化中起作用；③PcG调控同源盒基因家 族的表达，BMI1作为PcG家族的重要成员，与各种PcG蛋白一起共同参与同源盒基因的转 录调节，使其保持抑制状态，并可将此抑制状态遗传给子代；④介导多种肿瘤干细胞自我更 新和扩增，促进肿瘤的恶性进展。⑤BMIl可诱导上皮细胞发生上皮间质转化（epithelial mesenchymal transition, EMT)，而EMT是恶性转化和肿瘤侵袭转移重要的早期标志； ⑥BMIl还可通过P16Ink4A/Arf非依赖性途径直接或间接促进细胞恶性转化、凋亡抵抗、运 动和新生血液循环的生成，利于肿瘤细胞的播散及在远端靶器官的增殖和生存。
[0006] 基于BMIl在肿瘤组织和正常组织间表达的巨大差异和其在肿瘤发展中的重要作 用，BMIl作为一个预测、预后指标和抗癌治疗靶点吸引了越来越多的关注。同时提示我们 其在肝癌早期诊断的应用价值较好，以及作为潜在生物标志物的可能。本发明通过自行设 计的BMI1抗原表位多肽，检测肿瘤患者血清及血浆中自身抗体水平并开发相应的试剂，预 测肝癌发生的危险性及预后预测，并为肝癌新药研究提供可靠的数据。
[0007] 本发明通过自行设计的BMIl抗原表位多肽，检测肝癌患者血清及血浆中自身抗 体表达水平并开发相应的试剂，预测肝癌发生的危险性，并为制备肝癌早期诊断及预后预 测试剂盒奠定基础。
【发明内容】
[0008] 本发明要解决的技术问题是公开一种检测肝癌标志物BMIl自身抗体的抗原表位 序列。
[0009] 本发明同时公开了 BMIl抗原表位的用途。
[0010] 本发明提供的一种检测肝癌标志物BMIl自身抗体的抗原表位氨基酸序列为： H-DSIEFFDQNRLDRKVNKATTIIECLHSFCKTCI-OH 其纯度 >95%，pH>7. 0。
[0011] 本发明所述的BMIl抗原表位多肽在制备肝癌早期诊断试剂盒中的应用。
[0012] 本发明利用自行设计的BMIl蛋白的线性多肽，采用ELISA法检测肝癌患者血清 及血浆中抗BMIl蛋白的特异性自身IgG抗体。自身IgG抗体水平升高表明肿瘤患者体内 BMIl蛋白的表达量增加，预示患者可能出现原发性或继发性肝癌，可以预测肝癌发生与复 发的危险性，指导临床医生对肝癌的早期诊断及预后预测。
抗原抗体的结合实际上只发生在抗原决定簇和抗体的抗原结合位点之间，两者在空间 结构和空间构型上完全互补。因此抗原决定簇就可以代表整个蛋白与抗体结合的状态与亲 和特性。另外，以重组蛋白为抗原，要经过载体构建、转染、表达、筛选、纯化等繁琐的过程， 蛋白空间结构复杂，抗原表位不易暴露，因此抗原抗体结合的特异性差。此外，ELISA法的 高灵敏性对纯化技术的稳定性要求极高，成本昂贵。
[0014] 发明人遵循以下原则设计线性多肽抗原：①选择细胞膜蛋白表面区域；②选择不 形成a-helix的序列；③两端的肽段比中间的排列合理；④避免蛋白内部重复；⑤避免同源 性强的肽段；⑥序列中尽量避免Cys和Glu，不可以有太多的Pro,但有1-2个Pro利于肽链 结构稳定，对产生特异性抗体有益。此外，该多肽抗原必须含有人类白细胞二类抗原（HLA) 系统的限制性表位，包括HLA-DR，HLA-DP and HLA-DQ的限制性表位。这些表位可被90% 以