专利名称：新的重组型抗体及其cdr氨基酸序列和编码它们的基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有抑制人TNFα活性的参与抗体的抗原结合的新的氨基酸序列和编码该序列的基因，以及含有这些序列的基因重组型抗体，特别是人源化抗体，该抗体的生产方法以及含有该抗体的药物组合物。
先有技术肿瘤坏死因子α(TNFα)是对细胞具有多方面生物活性的炎性细胞因子(Proc Natl Acad Sci USA 72，3666，1975)。TNFα由巨噬细胞、肥大细胞和淋巴细胞等多种细胞产生，通过与细胞表面的特异受体结合发挥作用(Anu Rev Biochem 57，505，1988)。在TNFα的作用中，既有破坏肿瘤细胞和病毒感染细胞的有益作用，也存在对生物体的明显伤害作用。例如，已知TNFα是败血性休克的主要起因物质(Science234，470，1986)，另外，在慢性关节风湿病或多发性硬化症、疟疾等疾病中，人们认为全身性的或局部的TNFα量过剩是这些病的病因(Proc NatlAcad Sci USA 89，9784，1992，J.Infect.Dis.161，1148，1990，J.Exp.Med.170，607，1989)。人们认为对于这样的疾病通过抑制TNFα过量生成，或通过抑制TNFα的生物活性来缓解病情是有效果的。
抗体与抗原的亲和性一般都很强，而且特异性高，特别是抑制抗原生物活性的中和抗体人们期待它能用作药物。以前，制备的抗体有来自兔抗血清的多克隆抗体和小鼠或大鼠的单克隆抗体，有各种用途。然而，这些不是来自人的抗体对于人有很高的免疫原性，这些抗体如果进入人体，结果会产生人抗这些非人抗体的抗体，这些抗体不仅妨碍所期望的效果，而且还存在着在患者中诱发源于免疫反应的严重的副作用等问题。因此，这样的抗体作为药物用于患者受到很大的制约。
抗体分子是由两种多肽链构成，分子量大的多肽链称之为H链，分子量小的称之为L链。而各个多肽链由形成抗原结合部位的可变区和在每类抗体中大致都具有一定结构的稳定区组成的。可变区由与抗原结合部位的形成密切相关的互补决定区(CDR)和插在CDR区之间的称之为框架组织的区构成。CDR分别位于H和L链的3个部位(共6个部位)，从N末端起分别命名为CDR-1、CDR-2和CDR-3。抗体对抗原的亲和性和特异性主要由这些CDR的氨基酸序列决定的。
近年来，用抗体作为药物的新的方法已报道过人鼠嵌合抗体或人源化抗体的制作方法(Nature 328，323，1988)。在人鼠嵌合抗体中，含有抗原结合部位的可变区来自小鼠的单克隆抗体，而稳定区来自适当的人抗体。由于嵌合抗体含有原来鼠抗体的完整的可变区，所以可以预料嵌合抗体与抗原结合的亲和性和特异性与原来鼠抗体一样。另外，由于嵌合抗体来自鼠的氨基酸序列只限于可变区，所以与原来鼠抗体相比，其免疫原性降低了。另外，人源化抗体是通过将鼠抗体的CDR移植到人抗体可变区制备的(Immunol.Today，14，243，1993，Int Rev Immunol10，241，1993)。人源化抗体中来自人以外的氨基酸序列只是CDR，所以移植了鼠CDR的人源化抗体比嵌合抗体对人的免疫原性进一步降低。
对于TNFα的中和抗体到目前为止已有很多报道。例如，通过鼠慢性关节风湿病模型显示出效果的TNFα抗体(Proc Natl Acad Sci USA89，9784，1992)、通过鼠败血病模型显示出缓解病情的TNFα抗体(Nature330，662，1987)、含有通过实际人慢性关节风湿病模型显示出效果的TNFα抗体(Lancet 344，1105，1994)等。但是，这些抗体无论是来自鼠的单克隆抗体，还是人鼠嵌合抗体，他们的氨基酸序列和编码这些序列的基因，特别是参与识别抗原TNFα的CDR的氨基酸序列和编码这些序列的基因还不知道。
发明内容
本发明的课题在于提供抗人TNFα人源化抗体及其生产方法，另外还提供由这些抗体和医药上容许的载体组成的药物组合物。
本发明人开发了特异识别有活性的TNFα的鼠单克隆抗体MAB-3B10，并在特开昭63-253099号上公布了。本发明人进一步深入研究，解析了MAB-3B10的H链可变区和L链可变区的氨基酸序列，根据解析的氨基酸序列提供抗TNFα重组型抗体及其生产方法。本发明优选的重组型抗体是人源化抗体。
图2是抗人TNFα人鼠嵌合抗体的表达载体的模式图。A表示抗人TNFα人鼠嵌合抗体的H链的表达载体，B表示抗人TNFα人鼠嵌合抗体的L链的表达载体。VH表示H链的可变区；SH表示H链的信号区；CH1、CH2、CH3分别表示H链的3个稳定区；而VL表示L链的可变区；SL表示L链的信号区；CL表示L链的稳定区。
图3是人源化抗人TNFα抗体的构建程序图。用星号表示的部位表示在h3B10-1框架组织中变换成了鼠3B10的氨基酸残基的部位。L1～L6代表制作h3B10-1的L链用的PCR引物，H1～H6代表制作h3B10-1的H链用的PCR引物。该方法按已经公开的方法(Cancer Res 53，851，1993)。
图4是表示人源化抗人TNFα抗体与人TNFα结合特性曲线图。表示分别导入了编码各种人源化抗人TNFα抗体的基因的COS-1细胞、以及导入基因48小时后的培养上清与人TNFα的结合特性。首先，利用FCA法对带有人IgG Fc的IgG进行定量，然后利用ELISA法研究于各种IgG浓度下各种人源化抗人TNFα抗体与人TNFα的结合特性，用450nm波长的吸光度表示他们的结合强度。
图5是表示人源化抗人TNFα抗体与人TNFα结合特性的曲线图。表示分别导入了编码各个人源化抗人TNFα抗体基因的COS-1细胞、以及导入基因48小时后的培养上清与人TNFα的结合特性。首先，利用FCA法对带有人IgG Fc的IgG进行定量，然后利用ELISA法研究于各种IgG浓度(A)或1.0ng/ml(B)浓度下各种人源化抗人TNFα抗体与人TNFα的结合特性，用450nm波长的吸光度表示他们的结合强度。(B)浓度的测量的数据是用平均±标准偏差表示。
发明详细说明本发明的抗TNFα的重组型抗体至少含有由以下氨基酸序列构成的H链可变区以及L链可变区的CDR-1、CDR-2和CDR-3中的一个，优选的抗体应都含有。
H链的CDR-H1Gly-Tyr-Thr-Phe-Thr-Asn-Tyr-Gly-Met-Asn(序列号1)H链的CDR-H2Trp-Ile-Asn-Thr-Tyr-Thr-Gly-Glu-Pro-Thr-Tyr-Ala-Asp-Asp-Phe-Lys-Gly(序列号2)H链的CDR-H3Tyr-Asp-Tyr-Asp-Gly-Phe-Asp-Tyr(序列号3)L链的CDR-L1Thr-Ala-Ser-Ser-Ser-Val-Ser-Phe-Ser-Tyr-Leu-His(序列号4)L链的CDR-L2Tyr-Ser-Thr-Ser-Asn-Leu-Ala-Ser(序列号5)L链的CDR-L3His-Gln-Tyr-Leu-Arg-Ser-Pro-Tyr-Thr(序列号6)。
本发明的抗体的一种构成方式是H链可变区含有
图1(A)的3B10行氨基酸序列中的1～113位的氨基酸序列(序列7)或含有实质上与该序列具有同样功能的氨基酸序列，而L链可变区含有图1(B)的3B10行氨基酸序列中的1～107位的氨基酸序列(序列8)或含有实质上与该序列具有同样功能的氨基酸序列，而且能识别人TNFα。(这些序列作为MAB-3B10的H链和L链的可变区的序列在本发明中已进行了鉴定)在本发明说明书中，所谓「抗体」除了含有通常生物体内存在的抗体形式以外，还包括至少含有一个由抗体的H链或L链可变区或通过它们的组合形成的抗原结合部位的分子。例如，由通常存在于生物体内的抗体经木瓜蛋白酶酶切得到的象Fab那样的1组H链片段与L链构成的蛋白质，或者是由同样通过木瓜蛋白酶酶切制备的象F(ab’)2那样的两组H链片段与L链构成的蛋白质，或者是由H链片段和L链直线排列在同一肽链上构成的一条链抗体ScFv等也都包括在内。这些存在于生物体内的形式以外的「抗体」有时是通过用蛋白分解酶酶切生物体内抗体得到的，有时是通过基因重组方法制作的。
在本发明中，作为上述本发明的抗体分子的片段也至少含有上述CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3中的一个片段。例如，含有图1(A)的3B10行氨基酸序列中的1～113位的氨基酸序列的H链可变区或含有实质上与该序列具有同样功能的氨基酸序列的肽也包括在内，含有图1(B)的3B10行氨基酸序列中的1～107位的氨基酸序列的L链可变区或含有实质上与该序列具有同样功能的氨基酸序列的肽也包括在内。将这样的抗体单独或进行各种组合有可能制造出模仿抗体的人工构建抗体。
在本发明说明书中，所谓的「实质上具有同样功能」的意思是指抗体分子上的互补决定区的氨基酸序列与抗原的亲和性实质上是相同的，以及随场合变化亲和性更大。即有时将可变区的框架组织或稳定区的一个乃至数个氨基酸换成其他氨基酸时也可以制作实质上具有同样功能的抗体，或者制作的人源化抗体对抗原的亲和性变得更大。因此，可以制作出CDR的氨基酸序列保持一定，而可变区框架组织或稳定区的氨基酸中的几个氨基酸换成别的氨基酸那样的「实质上具有同样功能」的几个抗体的「衍生物」。进行这样的氨基酸取代可以在性质类似的氨基酸之间进行，这是人们最熟悉的，例如在碱性氨基酸之间进行取代、在酸性氨基酸之间进行取代、或在芳香族氨基酸之间进行取代。
可以预料在可变区的框架组织或稳定区内即使缺失或附加一个乃至数个氨基酸也能够制作「实质上具有同样功能」的几个抗体的「衍生物」，这些实质上具有同样功能的衍生物也包括在本发明的范围内。
本发明的抗体或其片段可以通过基因重组手法制备。
本发明抗体的互补决定区以外的结构可以选择抗人TNFα单克隆抗体MAB-3B10以外的任一个抗体作为基本结构。如果以人抗体作为基本结构制造本发明抗体为例进行说明的话，首先准备适当的人单克隆抗体，然后将该抗体的H链以及L链的可变区分别取代成上述的抗人TNFα单克隆抗体(MAB-3B10)的H链和L链的可变区，就可制造出嵌合抗体。使用的人单克隆抗体并没有特别限制，例如可以使用称之为HBS-1的人抗HBs抗体(Gastroenterol Jpn 19，344，1984；J Immunol Methods222，83，1999))。嵌合抗体的制造方法在Proc Natl Acad Sci USA81，6951，1984中已有详细记载。
接下来，要将嵌合抗体改造成人源化抗体。即，嵌合抗体的H链和L链的可变区中的互补决定区以外的框架组织部分变为人抗体框架组织部分。为此，象实施例3记载的那样利用Sato等人的方法(CancerRes，53，851，1993)，分别以编码HBS-1的L链和H链可变区的DNA为模板，根据MAB-3B10的CDR-L1～CDR-L3和CDR-H1～CDR-H3的序列制作适当的引物(例如序列号9～14的引物L1～引物L6和序列号15～19的引物H1～引物H5)，使用该引物扩增编码框架组织部分已人源化的MAB-3B10的L链以及H链的各个可变区的DNA。利用扩增获得的分别编码L链以及H链的各个可变区的DNA，再次使用嵌合抗体制造法取代分别编码上述嵌合抗体的L链以及H链的DNA可变区。
将得到的分别编码人源化抗体的L链以及H链的DNA导入表达载体，使两者转化同一宿主细胞或分别转化不同的宿主细胞，通过使L链和H链分别表达或同时表达，分泌出人源化抗体是有可能的(Proc Natl AcadSci USA 84，241，1987；Cancer Res，47，999，1987)。
作为重组抗体的生产方法，例如可以通过将编码重组抗体的基因导入COS-1细胞(来自非洲绿猴肾脏的细胞)或CHO细胞(来自日本仓鼠卵巢的细胞)进行分泌表达。在导入基因时可以使用各种载体，例如可以利用对真核细胞用表达载体pdKCR-dhfr(Biochem Biophys Res Commun164，39，1989)进行象实施例记载的那样的改造过的载体。为了使载体在宿主细胞中表达编码L链或H链的DNA，载体要含有启动子、终止子、以及其他要素。而为了使宿主分泌L链和/或H链，可以将编码L链和/或H链的DNA安插在编码与宿主细胞相适合的信号肽基因的下游。
例如，使用COS-1细胞，要使用象加有10％胎牛血清(FCS)的Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM培养基)那样的培养基，于5％ CO2、37℃条件下进行培养。至于向COS-1细胞导入基因的方法和导入基因后的细胞培养方法在Molecular Cloning，A Laboratory Manual(Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)等实验书中已有记载。
生产医药用的抗体时，为了避免混入来自血清的牛抗体，希望用无血清的培养基进行培养。如果这样操作的话，分泌到培养上清的抗TNFα抗体通过使用诸如可使蛋白A结合的树脂等一般的抗体纯化方法(Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1988)很容易纯化。工业生产用的宿主细胞可以使用CHO细胞或鼠骨髓瘤细胞Sp2/0等细胞。例如使用CHO细胞，通过MTX等药物可选择出生产效率高的菌落(Immunol Lett 64，139，1998)，如果能获得稳定的高产菌株，那该菌株可用于重组型抗人TNFα抗体的工业化生产中。
本发明的抗体通过将可变区的框架组织部分中的一部分氨基酸取代为别的氨基酸，有时可提高对人TNFα的亲和性。这样的氨基酸取代就象实施例4所示的那样，使用导入适当突变的引物借助PCR是有可能实现的。
医药用的抗体形式可以直接利用生产出的抗体分子，也可以利用经蛋白酶处理后获得的含有抗原结合部位的片段。如上所述，抗体的形式除了通常存在于生物体的抗体形式以外只要是还至少含有一个由抗体的H链或L链可变区或通过它们的组合形成的抗原结合部位的片段就可以。这些抗体可以利用基因重组手法制作，也可以利用基因重组手法制作后再使用蛋白分解酶进行有限地降解来制作，这些方法并没有特别地限定。
另外，本发明提供由上述本发明的重组抗体和医药上容许的载体构成的药物组合物。
在本发明的药物组合物中，为了使本发明的抗体在用于人体时使它保持活性也可以同时含有医药上容许的载体或稳定剂等物质，例如可以使用人血清白蛋白、明胶等。所谓医药上容许意思是指不能伴有恶心、目眩、呕吐等不希望出现的副作用，以及多次服用时不引起对制剂的免疫应答等。另外，使用医药上容许的适当的溶剂或稀释剂、随稳定剂一起溶解的液态的药物组合物也可以。还有即使是含有在上述药物组合物中以调节体内浓度为目的的中心体、脂质体等缓释移植体的药物用组合物也可以。
本发明的药物组合物可以用于诸如败血性休克症状、慢性关节风湿病、多发性硬化症、疟疾等患者，预防或治疗与TNFα或TNFα生产过剩有关的疾病和症状。投药方式根据需要进行选择，如果全身投药，可以经静脉投药、口服、腹腔内投药、皮下投药、鼻内投药、经皮投药等方式，如果局部投药，可以通过软膏、洗剂等投药方式。投药量医生可以根据症状、患者的年龄、以及其他因素确定。
实施例以下对本发明的实施例进行说明，是以具体的例子说明本发明，但对本发明并没有限定。实施例1.抗人TNFα鼠中和抗体3B10的H链和L链可变区cDNA克隆使用RNAzol B试剂(BIOTEX Laboratories公司)分离分泌抗人TNFα鼠单克隆抗体的3B10细胞(J Immunol Methods 96，57，1987)的总RNA，用总RNA随机杂化和使用逆转录酶(SuperScript PreamplificationSystem、GIBCO BRL公司生产)合成cDNA。由获得的cDNA通过聚合酶链式反应(PCR)扩增编码H链以及L链可变区的cDNA。L链可变区的cDNA利用根据Huse等人的报道的序列(Science 246，1275，1989)合成扩增用的的引物进行扩增，而H链可变区的cDNA利用根据Kabat等人的报道的H链氨基酸序列(US Dept.Health and Human Services，US GovernmentPrinting Offices，1991)设计5’端引物(5’-AGGTGAAGCTNGTGGAG/ATCTGG-3’)和Huse等人的3’端引物通过PCR方法进行扩增。在进行PCR时使用了耐热DNA聚合酶(AmpliTaq DNA polymerase、Perkin-Elmer公司生产)和热循环仪(TRIO-Thermo-block、Biometra公司生产)。将得到的cDNA的碱基序列按照Sanger等人方法进行解析(Proc Natl Acad Sci USA74，5463，1977)。图1给出了获得的3B10抗体的H链和L链可变区的碱基序列。按照Kabat等人的方法(US Dept.Health and Human Services，US Government Printing Offices，1991)或Chothia等人的方法(J MolBiol 196，901，1987)鉴定CDR区，在本发明中任一个CDR区所包含的氨基酸序列都视为「CDR区」。实施例2.抗抗人TNFα的人鼠嵌合抗体的表达载体的制作在真核细胞用表达载体pdKCR-dhfr(Biochem Biophys Res Commun164，39，1989)中导入多克隆位点(Eco RI，Mlu I，Spe I，Sal I)(以下称之为pKDEMSS载体)。然后将pKDEMSS的二氢叶酸还原酶(DHFR)区取代为pMAMneoCAT(CLONTECH公司生产)的抗新霉素(neor)区(以下称之为pKNEMSS载体)。嵌合H链表达载体是通过从N末端依次将称之为HBS-1的人抗HBs抗体(Gastroenterol Jpn 19，344，1984，J ImmunolMethods 222，83，1999)的γ1链的信号序列和实施例1得到的3B10的H链可变区以及HBS-1的γ1链的稳定区插入到pKNEMSS载体制作的(以下称之为pKNH-c3B10)，同样，通过从N末端依次将HBS-1的κ链的信号序列和实施例1得到的3B10的L链可变区以及HBS-1的κ链的稳定区插入到pKDEMSS载体制作嵌合L链表达载体(以下称之为pKDL-c3B10)。图2给出了pKNH-c3B10和pKDL-c3B10的构建图。实施例3.人源化抗人TNFα抗体的构建按照Sato等人的方法(Cancer Res，53，851，1993)，构建将鼠抗体3B10的6个CDR换成人IgG对应的位置的抗体基因。就象图3表示的那样，首先以HBS-1抗体的L链的cDNA作为模板进行5次PCR来制备L链可变区的cDNA片段。在第1次PCR中，是用引物L1和L2进行扩增的。用扩增的片段作为5’引物与L3引物一起进行第2次PCR。依次类推，直至使用L6引物为止再进行3次PCR扩增，制作最终的L链可变区的cDNA片段。H链可变区的cDNA片段以HBS-1抗体的H链的cDNA作为模板也通过反复进行PCR来制作。但是，第2次PCR用的3’引物是通过使用彼此重叠的两种引物经PCR制作的。通过将最终扩增得到的这些L链和H链可变区cDNA片段换成抗抗人TNFα人鼠嵌合抗体的表达载体pKDL-c3B10和pKNH-c3B10的可变区来构建人源化抗体表达载体。通过用各个载体同时转化适当的宿主细胞，然后在表达条件下进行培养，可以分泌抗人TNFα人源化抗体(参照实施例4)。以上得到的人源化抗体命名为h3B10-1。
表1给出了本实施例使用的引物。而在这些引物中，L链的框架组织部分的第4位、36位、48位、71位的氨基酸以及H链的71位、93位的氨基酸分别换成了鼠3B10对应的氨基酸残基。
表1轻链L1 5’-AGG TGT GAC GTC CAG TTG ACC CAG TCT CCA (序列号9)L2 5’-CTG ATA CCA GTG TAA ATA ACT GAA GCT AAC GCT CGAACT CGC CGT ACA AGT GAT (序列号10)L3 5’-GAC CCC ACT TGC CAA ATT GGA TGT AGA ATA GAT CAG GAG CTT(序列号11)L4 5’-TGT GAG AGT GTA TTC TGT CCC AGA TCC ACT (序列号12)L5 5’-GCC GAA AGT GTA CGG GGA ACG AAG ATA CTG GTG ACA GTA(序列号13)L6 5’-CTC ATC AGA TGG CGG GAA GA(序列号14)重链H1 5’-CAG AAT TCA CCA TGG AGT TTG GGC TGA GCT (序列号15)H2 5’-GAC CCA GTT CAT ACC ATA GTT AGT GAA GGT GTA TCC AGA(序列号16)H3 5’-GAG TGG GTG GCA TGG ATA AAC ACT TAT ACA GGT GAG CCA ACC TAC GCA(序列号17)H4 5’-GTC TAA GGA AAT GGT GAA TCG GCC CTT GAA GTC GTC TGC GTA GGT TGG(序列号18)H5 5’-TCC CTG GCC CCA GTA GTC AAA TCC GTC ATA ATC ATA TCT TGC ACA GTA(序列号19)实施例4.抗人TNFα人源化抗体衍生物的构建通过对h3B10-1进一步实施突变制作了8种人源化3B10抗体，在H链和L链的框架组织部分导入了突变。即以h3B10-1为模板，通过利用导入突变的引物进行PCR实施突变的。在进行PCR时使用了耐热DNA聚合酶(AmpliTaq DNA polymerase、Perkin-Elmer公司生产)和热循环仪(TRIO-Thermo-block、Biometra公司生产)。表2中归纳了制作的8种人源化抗体(命名为h3B10-2～9)、h3B10-1H以及h3B10-1L中氨基酸序列的不同部分。将L链与h3B10-1相同，H链的框架组织区是HBS-1自身的抗体命名为h3B10-1H，将H链与h3B10-1相同，L链的框架组织区是HBS-1自身的抗体命名为h3B10-1L。
表2人源化抗人TNFα抗体框架区的构建H链的氨基酸残基 L链的氨基酸残基抗体3 46 71 78 933 4 36 46 47 71m3B10 K K L A A E L Y L W Yc3B10 K K L A A E L Y L W YHBS-1 Q E R L I Q M F R L Fh3B10-1 Q E L L A Q L Y L L Yh3B10-1HQ E R L I Q L Y L L Yh3B10-1LQ E L L A Q M F R L Fh3B10-2 K E L L A Q L Y L L Yh3B10-3 Q K L L A Q L Y L L Yh3B10-4 Q E L A A Q L Y L L Yh3B10-5 K K L A A Q L Y L L Yh3B10-6 Q E L L A E L Y L L Yh3B10-7 Q E L L A Q L Y L W Yh3B10-8 Q E L L A E L Y L W Yh3B10-9 K K L A A Q L Y L W Y
表2中，氨基酸用单字母表示，按照Kabat等人的方法(US Dept.Healthand Human Services，US Government Printing Offices，1991)加以编号。而来自鼠的序列用下划线标出。
m3B10原来的鼠抗TNFα抗体；c3B10人鼠嵌合抗TNFα抗体；HBS-1人抗HBs抗体；h3B10-1HL链与h3B10-1相同，H链的框架组织区是HBS-1自身的抗体；h3B10-1LH链与h3B10-1相同，L链的框架组织区是HBS-1自身的抗体。实施例5.人源化抗人TNFα抗体及其衍生物的表达和解析将3.0×105个COS-1细胞(从ATCC获得)接种于35mm培养皿中进行18小时前培养。使用10μl的脂(质)转染胺试剂(GIBCO BRL公司生产)同时将在实施例2～4中构建的共计9种对应于人源化抗人TNFα抗体和人鼠嵌合抗体的各个H链表达载体和L链表达载体成对(各2μg)导入COS-1细胞。在通过ELISA方法对从导入基因的细胞分泌出的各个重组型抗体对人TNFα的结合特性进行检测的同时，利用FCA(Fluorescence Concentration Analyzer)方法对培养上清中的人IgG的量进行定量。ELISA按如下方法进行。首先，向96孔板的中央区的60孔加满10μg/ml的人TNFα，于室温下温育18小时，使其固化。用洗净缓冲液(含有0.1％ Tween-20的磷酸缓冲盐溶液(PBS))将孔洗3次后，用含有1％ BSA的PBS进行2小时封闭。然后用PBS-T洗3次，与各个COS-1细胞的上清进行2小时反应。同样洗过后，使结合TNF α的抗体与过氧化物酶标记的羊抗人IgG Fc(Jackson ImmunoResearch Laboratories公司生产)或过氧化物酶标记的羊抗鼠IgGFc抗体(Caltag Laboratories公司生产)反应，利用文献(J Immunol Methods 143，89，1991)记载的方法进行检测。另外，FCA法根据已经报道的方法(Biochem Biophys ResCommun 193，886，1993)使用包裹羊抗人IgG Fc抗体的FCA用颗粒和用FITC标记的羊抗人IgG Fc抗体，以已知浓度的人IgG作为标准物质进行定量。各个COS-1细胞表达的各人源化抗体与人TNFα的结合特性用对各种浓度的IgG的ELISA反应量表示。
各种抗体对人TNFα的结合特性就象图4和图5表示的那样，无论那一种人源化抗体都具有与TNFα的结合活性，而h3B10-9的结合活性最强，其结合强度与人鼠嵌合抗体相当。而h3B10-1虽然也具有结合活性，但比人鼠嵌合抗体弱。而作为对照制作的h3B10-1H和h3B10-1L经检测确认没有结合人TNFα的特性。
发明效果本发明首次提供的6个氨基酸序列和编码这些序列的基因通过将这些序列换成人IgG的对应位置可获得对人TNFα保持结合活性的人源化抗体。本发明得到的人源化抗TNFα抗体用作药品时在人体内的免疫原性比来自鼠等动物的抗体带来的免疫原性低得多，安全性进一步提高。如果利用本发明，可以大量制备识别TNFα的人源化抗体，该抗体可以用于治疗与TNFα有关的各种疾病。
序列表<110>Suntory Limited<120>新的重组抗体，它的CDR区的氨基酸序列和编码CDR区的DNA。<130>YCT-588<160>19<210>SEQ ID NO1<211>10<212>PRT<213>mouse<220><223>抗人TNFα抗体的CDR-H1<400>1Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn5 10<210>SEQ ID NO2<211>17<212>PRT<213>mouse<220><223>抗人TNFα抗体的CDR-H2<400>2Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe5 10 15Lys Gly<210>SEQ ID NO3<211>8<212>PRT<213>mouse<220><223>抗人TNFα抗体的CDR-H3<400>3Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr5<210>SEQ ID NO4<211>12<212>PRT<213>mouse<220><223>抗人TNFα抗体的CDR-L1<400>4Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Phe Ser Tyr Leu His5 10<210>SEQ ID NO5<211>8<212>PRT<213>mouse<220><223>抗人TNFα抗体的CDR-L2<400>5Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser<210>SEQ ID NO6<211>9<212>PRT<213>mouse<220><223>抗人TNFα抗体的CDR-L3<400>6His Gln Tyr Leu Arg Ser Pro Tyr Thr5<210>SEQ ID NO7<211>351<212>DNA<213>mouse<220><223>抗人TNFα抗体的H-链CDR区<400>7cag gtg aag ctg ctc gag tct ggg gga ggc gtg gtc cag cct ggg agg 48Gln Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1 5 10 15tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga tac acc ttt act aac tat 96Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr20 25 30ggt atg aac tgg gtc cgc cag gct cca ggc aag ggg ttg aag tgg gtg144Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Val35 40 45gca tgg ata aac act tat aca ggt gag cca acc tac gca gac gac ttc192Ala Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe50 55 60aag ggc cga ttc acc att tcc tta gac aat tcc aag aac aca gcg tat240Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Leu Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ala Tyr65 70 75 80ctg gaa gtg aag agc ctg caa act gag gac acg ggt gtc tat tac tgt288Leu Glu Val Lys Ser Leu Gln Thr Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys85 90 95gca aga tat gat tat gac gga ttt gac tac tgg ggc cag gga acc ctg336Ala Arg Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu100 105 110gtc acc gtc tcc tca351Val Thr Val Ser Ser115<210>SEQ ID NO8<211>324<212>DNA<213>mouse<220><223>抗人TNFα抗体的L-链CDR区<400>8gac gtc cag ttg acc cag tct cca tct gcc atg gct gca tct gta gga 48Asp Val Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Met Ala Ala Ser Val Gly1 5 10 15gac aga gtc acc atc act tgt acg gcg agt tcg agc gtt agc ttc agt 96Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Phe Ser20 25 30tat tta cac tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa gtc cct aag ctc tgg144Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Trp35 40 45atc tat tct aca tcc aat ttg gca agt ggg gtc cca tcg agg ttc agc192Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser50 55 60ggc agt gga tct ggg aca gaa tac act ctc aca atc agc agc ctg cag240Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln65 70 75 80cct gaa gat ttt gca act tat tac tgt cac cag tat ctt cgt tcc ccg288Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Leu Arg Ser Pro85 90 95tac act ttc ggc gga ggg acc aag gtg gag atc aaa324Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105<210>SEQ ID NO9<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>Primer L1<400>9aggtgtgacg tccagttgac ccagtctcca 30<210>SEQ ID NO10<211>54<212>DNA<213>人工序列<220><223>Primer L2<400>10ctgataccag tgtaaataac tgaagctaac gctcgaactc gccgtacaag tgat 54<210>SEQ ID NO11<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>Primer L3<400>11gaccccactt gccaaattgg atgtagaata gatcaggagc tt 42<210>SEQ ID NO12<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>Primer L4<400>12tgtgagagtg tattctgtcc cagatccact 30<210>SEQ ID NO13<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>Primer L5<400>13gccgaaagtg tacggggaac gaagatactg gtgacagta 39<210>SEQ ID NO14<211><212>DNA<213>人工序列<220>20<223>Primer L6<400>14ctcatcagat ggcgggaaga 20<210>SEQ ID NO15<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>Primer H1<400>15cagaattcac catggagttt gggctgagct 30<210>SEQ ID NO16<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>Primer H2<400>16gacccagttc ataccatagt tagtgaaggt gtatccaga 39<210>SEQ ID NO17<211>48<212>DNA<213>人工序列<220><223>Primer H3<400>17gagtgggtgg catggataaa cacttataca ggtgagccaa cctacgca48<210>SEQ ID NO18<211>48<212>DNA<213>人工序列<220><223>Primer H4<400>18gtctaaggaa atggtgaatc ggcccttgaa gtcgtctgcg taggttgg48<210>SEQ ID NO19<211>48<212>DNA<213>人工序列<220><223>Primer H5<400>19tccctggccc cagtagtcaa atccgtcata atcatatctt gcacagta48
权利要求
1.抗人TNFα的重组型抗体的H链多肽或其片段，至少含有以下任一个氨基酸序列a)CDR-H1为作为CDR-H1记载于序列号1的氨基酸序列；b)CDR-H2为作为CDR-H2记载于序列号2的氨基酸序列；c)CDR-H3为作为CDR-H3记载于序列号3的氨基酸序列
2.抗人TNFα的重组型抗体的H链多肽或其片段，含有抗人TNFα的抗体的H链可变区，该H链可变区由序列号7记载的氨基酸序列构成或由在该氨基酸序列中的序列号1至3记载的氨基酸序列以外的部分进行1或数个氨基酸的缺失、附加或取代的氨基酸序列构成。
3.抗人TNFα的重组型抗体的L链多肽，至少含有以下任一个氨基酸序列d)CDR-L1为作为CDR-L1记载于序列号4的氨基酸序列；e)CDR-L2为作为CDR-L2记载于序列号5的氨基酸序列；f)CDR-L3为作为CDR-L3记载于序列号6的氨基酸序列
4.抗人TNFα的重组型抗体的L链多肽，含有抗人TNFα的抗体的L链可变区，该L链可变区由序列号8记载的氨基酸序列构成或由在该氨基酸序列中的序列号4至6记载的氨基酸序列以外的部分进行1或数个氨基酸的缺失、附加或取代的氨基酸序列构成。
5.编码权利要求1或2记载的H链多肽或其片段的基因。
6.编码权利要求3或4记载的L链多肽的基因。
7.插入了权利要求5和/或6记载的基因的表达载体。
8.抗人TNFα的重组型抗体的制造方法，用权利要求7记载的表达载体转化宿主细胞，在表达抗人TNFα抗体的条件下培养该宿主细胞，然后回收由宿主细胞产生的抗体。
9.抗人TNFα的重组型抗体或其片段，是利用权利要求5和/或6记载的基因，或权利要求8记载的方法，通过基因重组手法获得的。
10.药物组合物，由权利要求9记载的抗体或其片段与医药上容许的载体构成。
全文摘要
提供至少含有以下一个氨基酸序列的抗人TNFα重组型抗体的H链多肽或其片段:a)以CDR－H1记载的氨基酸序列:Gly－Tyr－Thr－Phe－Thr－Asn－Tyr－Gly－Met－Asn，b)以CDR－H2记载的氨基酸序列:Trp－Ile－Asn－Thr－Tyr－Thr－Gly－Glu－Pro－Thr－Tyr－Ala－Asp－Asp－Phe－Lys－Gly，c)以CDR－H3记载的氨基酸序列:Tyr－Asp－Tyr－Asp－Gly－Phe－Asp－Tyr提供至少含有以下一个氨基酸序列的抗人TNFα重组型抗体的L链多肽a’)以CDR－L1记载的氨基酸序列:Thr－Ala－Ser－Ser－Ser－Val－Ser－Phe－Ser－Tyr－Leu－His，b’)以CDR－L2记载的氨基酸序列:Tyr－Ser－Thr－Ser－Asn－Leu－Ala－Ser，c’)以CDR－L3记载的氨基酸序列:His－Gln－Tyr－Leu－Arg－Ser－Pro－Tyr－Thr提供由上述H链多肽或其片段和L链多肽构成的抗人TNFα人源化抗体或其片段。同时还提供用含有编码该抗体的基因的表达载体转化宿主细胞,然后进行培养,制造人源化抗TNFα抗体的方法。
文档编号A61P25/00GK1380884SQ01801502
公开日2002年11月20日 申请日期2001年4月18日 优先权日2000年4月19日
发明者福田好晃, 永平和广, 中西俊博 申请人:三得利株式会社