针对CXCR4和其他GPCRs的氨基酸序列以及包含所述氨基酸序列的多肽的制作方法

专利名称：针对CXCR4和其他GPCRs的氨基酸序列以及包含所述氨基酸序列的多肽的制作方法
针对CXCR4和其他GPCRs的氨基酸序列以及包含所述氨基
酸序列的多肽本发明涉及针对(如本文所定义)G蛋白偶联受体(GPCRs)和具体地针对CXCR4 和CXCR7的氨基酸序列，以及涉及包含一个或多个所述氨基酸序列或基本上由其组成的化 合物或构建体，并且特别是蛋白和多肽(在本文中还分别地称为“本发明的氨基酸序列”、 “本发明的化合物”和“本发明的多肽”)。此外，本发明提供一种制备针对跨膜蛋白，和具体 地针对在其他"体外"系统中无法复制其天然构象的多次跨膜的跨膜蛋白(例如，一般， GPCRs)的氨基酸序列的新方法。本发明还涉及编码所述氨基酸序列和多肽的核酸(在本文中还称为“本发明的核 酸”或“本发明的核苷酸序列”)；制备所述氨基酸序列和多肽的方法；表达或能够表达所 述氨基酸序列或多肽的宿主细胞；包含所述氨基酸序列、多肽、核酸和/或宿主细胞的组合 物、且特别是药物组合物；以及所述氨基酸序列或多肽、核酸、宿主细胞和/或组合物的应 用，特别是用于预防、治疗或诊断目的，诸如本文所提到的预防、治疗或诊断目的的应用。本发明的其它方面、实施方案、优点和应用将从本发明的进一步描述中变得显而 易见。GPCRs是公知的受体类型。参考例如针对以下综述进行=Surgand等，Proteins (蛋 白质)62 :509-538^006) ；Vassilatis 等，Proc Natl Acad Sci U S A(美国国家科学院
) 100 :4903-4908 (2003)和 Pierce 等，Nat Rev MolCellBiol (分子细胞生物学自然 评论)3 :639-65(K2002)；以及针对例如George 等，Nat Rev Drug Discov(药物发现 自然评论)1 :808-82(K2002) ；Kenakin, Trends Pharmacol ki (药理学科学趋势)25 186-192(2002) ；Rios 等，Pharmacol Ther (药理学和治疗学)92 :71-87 Q001) Jacoby 等， ChemMedChem 2006，1，760-782 ；以及 khlyer 和Horuk，Drug Discoveryhday (今日药物发 现)，11，11/12. 2006 年 6 月，481 ；且还例如针对 Rosenkilde, Oncogene (癌基因)(2001)， 20，1582-1593 和 Sadee 等，AAPSPharmSci (AAPS 药学科学)2001 ；3 ；1-16 ；以及针对其中引 用的其他参考文献。G蛋白偶联受体(GPCRs)是最大的细胞表面受体类型(人基因组中存在多于1000 个基因)。它们可以通过多种多样系列的刺激，例如激酶、肽、氨基酸、可见光子来激活，且这 些受体在中枢神经系统和在外周中起重要作用。GPCRs是含有7个具有高度保守结构域的 跨膜结构域的蛋白。因为全部已知的药物的一半通过G蛋白偶联受体工作，因此选择针对该蛋白家族 的纳米抗体在商业上非常吸引人。估计在2000年中，全部现代药物的一半和200种最畅销 药物的几乎四分之一均针对或调节GPCR靶标(总共约30个)。然而，由于其7次跨膜螺旋 结构和其强烈的聚集倾向，使得它是一个非常具有挑战性的靶标类型。GPCR可以基于序列同源性分组为若干不同的家族。尽管全部GPCR都具有类似的 7次跨膜α -螺旋结构，但是该受体类型中的不同家族彼此间表现出无序列同源性，由此提 示它们的跨膜结构域结构的相似性可能确定共有的功能要求。根据胞外结构域的尺寸来区 分三个家族。
-家族1(也称为家族A或视紫红质样家族)的成员仅具有小的胞外环且与跨膜 裂沟内的残基发生配体的相互作用。这是迄今为止最大的组(>90%的GPCRs)并包含嗅 觉受体，小分子诸如儿茶酚胺和胺、(神经)肽和糖蛋白激素。属于该家族的视紫红质是其 结构问题已经解决的唯一 GPCR。-家族2或家族BGPCR的特征在于参与至配体结合中的相对长的氨基末端胞外 结构域。关于跨膜结构域的定位几乎毫无所知，但是它可能与视紫红质非常不同。这些GPCR 的配体是激素，诸如胰高血糖素、促性腺激素释放激素和甲状旁腺激素。-家族3成员也具有大胞外结构域，其类似“维纳斯捕蝇草(Venusflytrap) ”起 作用，因为它可以打开和关闭，使激动剂结合在其内部。家族成员有代谢型谷氨酸受体、 Ca2+-感受受体和Y -氨基丁酸(GABA)B受体。传统上，使用小分子来开发针对GPCR的药物，不仅因为制药公司具有对其研究 的历史原因，而且更重要的是因为家族1 GPCR的结构限制，所述家族1 GPCR具有跨膜 裂沟内的配体结合位点(Nat Rev Drug Discov(药物发现自然评论M2004)The state of GPCR research in 2004 (2004 ^Ξ GPCR). Nature Reviews Drug Discovery GPCR QuestionnaireParticipants (药物发现自然评论 GPCR 调查表参与者)3(7) :575， 577-626)。由于该原因，证实很难或不可能生成针对该靶标类型的单克隆抗体。本发明的 氨基酸序列(和具体地，本发明的纳米抗体)可以通过它们经由延伸至腔(cavities)内的 CDR环结合的固有性质来解决该具体问题。治疗相关GPCR的一些非限制性实例是例如以下，它们都是已经被批准或处于临 床开发中的已知药物的靶标。括号之间的文字表示本发明氨基酸序列、纳米抗体或多肽的 预期作用(例如，作为激动剂或拮抗剂)A 型 GPCRs-毒蕈碱性Ml受体-肾上腺素受体-组胺受体-5-HT GPCR-大麻素受体-A型激素蛋白GPCR-趋化因子-甘丙肽-黑皮质素-神经肽Y受体-神经降压肽受体-阿片样物质-促生长素抑制素-血管升压素样受体-前列腺素类物质受体B 型 GPCRs-ACTH释放因子受体(调节剂)；
C 型 GPCRs-GABAB受体(激动剂)；-代谢型谷氨酸受体治疗相关GPCR的一些其他非限制性实例在表C中提及。人GPCR的更广泛列表在 表D中给出。CXCR4，( 一种CXC趋化因子受体)，也称融合素，是对基质衍生因子_1 (SDF-1，也 称CXCLU)特异的α-趋化因子受体，所述基质衍生因子-1是赋予淋巴细胞有效趋化活性 的分子。该受体是可以被HIV分离株用来感染CD4+T细胞的若干趋化因子受体之一。传统 上，使用CXCR4的HIV分离株被称为T细胞向性分离株。典型地，这些病毒感染中很晚出现。 不清楚使用CXCR4的HIV的出现是免疫缺陷的结果还是原因。CXCR4的配体SDF-I被认为在造血干细胞归巢至骨髓中和在造血干细胞静止中很重要。通常关于趋化因子，SDF-I和CXCR4是相对"单配的"配体-受体对(其他趋化 因子倾向于以相当“混杂的”方式利用若干不同趋化因子受体)。因为SDF-I和CXCR4之间的相互作用在保持骨髓中的造血干细胞中起重要作用， 所以阻断CXCR4受体的药物似乎能够使造血干细胞“移动”至血流中作为外周血干细胞。外 周血干细胞动员在造血干细胞移植中非常重要(作为近年来用于手术收获的骨髓的移植 的替代方案)并且目前利用药物诸如G-CSF来进行。G-CSF是嗜中性粒细胞(常见的白细 胞类型)的生长因子，并可以通过增加骨髓中嗜中性粒细胞-来源的蛋白酶诸如嗜中性粒 细胞弹性蛋白酶的活性，由此导致SDF-I的蛋白水解性降解来发挥作用。本发明的多肽和组合物通常可以用于调节，且具体地抑制和/或防止，GPCR介导 的信号传导和/或用于调节GPCR参与的生物学途径，和/或用于调节与所述信号传导或这 些途径相关的生物学机制、反应和作用。同样地，本发明的多肽和组合物可以用于预防和治疗(如本文中定义)GPCR相关 的疾病和紊乱。一般地，“GPCR相关疾病和紊乱”可以定义为可以分别通过对有此需要(即， 患有所述疾病或紊乱或其至少一种症状和/或处于引起或发生所述疾病或紊乱的风险)的 受试者适当地施用本发明的多肽或组合物(且具体地，其药物有效量)和/或针对GPCR或 GPCR参与的生物学途径或机制的已知活性的有效成分(且具体地，其药物有效量)来预防 和/或治疗的疾病和紊乱。基于本文中的公开内容，所述GPCR相关的疾病和紊乱的实例对 于技术人员应该是清楚的。因此，在不受其限制的条件下，本发明的氨基酸序列和多肽可以例如用于预防和 /或治疗目前使用可以调节GPCR介导的信号传导的有效成分预防或治疗的全部疾病和紊 乱，诸如以上引用的现有技术中提及的那些。还设想，本发明的多肽可以用于预防和/或治 疗所有这样的疾病和紊乱，对于所述疾病和紊乱使用所述有效成分的治疗目前正在开发、 已经提议、或将来应该提议或开发。另外，设想，由于其如本文中进一步所述的有利性质，本 发明的多肽可以用于预防和治疗除对其正在使用或将提议或开发这些已知有效成分的疾 病和紊乱以外的其他疾病和紊乱；和/或本发明的多肽可以提供用于治疗本文中所述疾病 和紊乱的新方法和方案。
从本文的进一步公开内容，对于专业技术人员来说本发明的氨基酸序列和多肽的 其他应用和用途将变得显而易见。—般地，本发明的一个目的是提供药理学活性剂，以及包含其的组合物，它们可用 于GPCR相关疾病和紊乱以及本文提到的其他疾病和紊乱的诊断、预防和/或治疗中；以及 提供用于这些疾病和紊乱的诊断、预防和/或治疗的方法，这些方法涉及这些药剂和组合 物的施用和/或应用。特别地，本发明的一个目的是提供与本领域中目前所用的和/或所知的药剂、组 合物和/或方法相比具有某些优点的此类药理学活性剂、组合物和/或方法。这些优点将 从下文的进一步描述而变得显而易见。更特别地，本发明的一个目的是提供可以用作药理学活性剂的治疗性蛋白，以及 包括其的组合物，其用于诊断、预防和/或治疗GPCR相关的疾病和紊乱以及本文提及的其 他的疾病和紊乱；和提供用于诊断、预防和/或治疗所述疾病和紊乱的方法，所述方法涉及 所述治疗性蛋白和组合物的施用和/或应用。因此，本发明的具体目的是提供针对(如本文所定义)GPCR、特别是针对来自温血 动物的GPCR、更特别是针对来自哺乳动物的GPCR、并且尤其是针对人GPCR的氨基酸序列； 并且提供包括至少一种所述氨基酸序列或基本上由其组成的蛋白和多肽。特别地，本发明的具体目的是提供适合在温血动物、并且特别是在哺乳动物、且更 特别是在人中用于预防、治疗和/或诊断应用的所述氨基酸序列和所述蛋白和/或多肽。更特别地，本发明的具体目的是提供可以在温血动物、特别是在哺乳动物、且更特 别是在人中用于预防、治疗、减轻和/或诊断一种或多种与GPCR相关和/或由GPCR介导的 疾病、紊乱或病症(如本文所提及的疾病、紊乱和病症)的所述氨基酸序列和所述蛋白和/ 或多肽。本发明还有一个具体目的是提供可以用于制备用于预防和/或治疗温血动物、特 别是哺乳动物、且更特别是人中的一种或多种与GPCR相关的和/或由GPCR介导的疾病、紊 乱或病症(如本文所提及的疾病、紊乱和病症)的药物或兽医用组合物的所述氨基酸序列 和所述蛋白和/或多肽。 在本发明中，通常，这些目的通过利用本文所述的氨基酸序列、蛋白、多肽和组合 物实现。一般地，本发明提供针对(如本文所定义)和/或可以特异性结合(如本文所定 义)GPCR的氨基酸序列；以及包括至少一个所述氨基酸序列的化合物和构建体、且特别是 蛋白和多肽。更特别地，本发明提供可以以如本文所定义的亲和力(适当测量和/或表示为 Kd-值(实际的或表观的)，Ka-值(实际的或表观的)，k。n-速率和/或k。ff-速率，或备选 地为IC5tl值，如本文进一步所述)与GPCR结合的氨基酸序列；以及包括至少一个所述氨基 酸序列的化合物和构建体、且特别是蛋白和多肽。特别地，本发明的氨基酸序列和多肽优选是这样的，即，它们-以10_5-10_12摩尔/升或更小、并且优选地10_7-10_12摩尔/升或更小、并且更优选 地10_8-10_12摩尔/升的解离常数(Kd)(即，以IO5-IO12升/摩尔或更大、并且优选地IO7-IO12 升/摩尔或更大、且更优选地IO8-IO12升/摩尔的缔合常数(Ka))与GPCR结合；
和/或是这样的，S卩，它们-以IO2M-1S-1-约 IO7MW 优选 ΙΟ^ΤΥ^ΙΟ 、-1，更优选 ΙΟ Υ Ο'Μ 诸如 IO5M-1S-LlO7M-1S-1的k。n-速率与GPCR结合；和/或是这样的，即，它们-以Is—1(t1/2 = 0. 69s) -KTfV1 (假定具有多天的t1/2的几乎不可逆的复合体)，优 选 IO-2S-LlO-6S-1,更优选 IO-3S-LlO-6S-1,诸如 IOYU 的 k。ff 速率与 GPCR 结合。优选地，本发明的单价氨基酸序列(或包含仅一个本发明的氨基酸序列的多肽) 优选是这样的，即，它将以小于500nM，优选小于200nM，更优选小于ΙΟηΜ，诸如小于500pM的 亲和力与GPCR结合。对于本发明的氨基酸序列或多肽与GPCR结合的一些优选的IC50值将从本发明的 进一步描述和实施例中变得显而易见。对于与GPCR合，本发明的氨基酸序列通常将在其氨基酸序列内包含一个或多个 氨基酸残基、或氨基酸残基的一个或多个序列(即，每个“序列(stretch) ”包括彼此相邻或 彼此紧邻的两个(或多个)氨基酸残基，即，在该氨基酸序列的一级或三级结构上)，通过其 本发明的氨基酸序列可以与GPCR结合，因此所述氨基酸残基或氨基酸残基的序列形成结 合GPCR的“位点”(本文还称为“抗原结合位点”)。本发明提供的氨基酸序列优选地基本上采用分离形式(如本文所定义)、或形成 本发明的蛋白或多肽的一部分(如本文所定义)，其可以包括一个或多个本发明的氨基酸 序列或基本上由其组成，并且其可以任选地还包括一个或多个其它的氨基酸序列(全部任 选地通过一个或多个适当的接头连接)。例如，并且不限于，本发明的一个或多个氨基酸序 列可以用作在这样的蛋白或多肽内的结合单位，所述蛋白或多肽可以任选地包含可以充当 结合单位的一个或多个其它的氨基酸序列(即，针对除GPCR外的一个或多个其它靶标)，以 便分别提供单价、多价或多特异性的本发明的多肽，全如本发明所述。这样的蛋白或多肽还 可以采用基本上分离的形式(如本文所定义)。因此，本发明的氨基酸序列和多肽优选地基本上由不通过二硫键与任一另一氨基 酸序列或链连接(但是其可以或可以不包含一个或多个分子内二硫键。例如，已知纳米抗 体如本文所述有时可以含有在CDR3和CDRl或FR2之间的二硫键)的单个氨基 酸链组成。然而，应该注意，一个或多个本发明的氨基酸序列可以彼此连接和/或与其他氨 基酸序列连接(例如，通过二硫键)，以提供也可以用于本发明的肽构建体(例如，Fab'片 段，F(ab’)2片段，ScFv构建体，“双抗体”和其他多特异性构建体。例如，参考Holliger和 Hudson, Nat Biotechnol.(自然生物技术)2005 年 9 月；23 (9) :11洸_36 的综述)。一般地，当本发明的氨基酸序列(或包含其的化合物、构建体或多肽)意欲施用给 受试者时(例如，为了如本文所述的治疗和/或诊断目的)，优选其是在所述受试者内天然 不存在的氨基酸序列；或当它在所述受试者内天然存在时，采用基本上分离的形式(如本 文所定义)。专业技术人员还应该清楚，对于药物应用，本发明的氨基酸序列(以及包含其的 化合物、构建体和多肽)优选地针对GPCR ；而对于兽医用目的，本发明的氨基酸序列和多肽 优选地针对来自待治疗的物种的GPCR，或至少与来自待治疗的物种的GPCR交叉反应。此外，本发明的氨基酸序列可以任选地，并且除了所述至少一个针对GPCR结合的 结合位点之外，包含针对其它抗原、蛋白或靶标结合的一个或多个其它的结合位点。本发明的氨基酸序列和多肽的功效、以及包含其的组合物的功效可以使用任何适合的体外测定、 基于细胞的测定、体内测定和/或本身已知的动物模型、或它们的任何组合进行检测，这取 决于所涉及的具体的疾病或紊乱。适当的测定和动物模型对于专业技术人员来说将是清楚 的，并且例如，包括爪蟾卵母细胞中受体的表达，其后使许多GPCR与离子通道的偶联容许 通过电压钳技术在卵母细胞中监测的这些GPCR的活化或抑制。异源GPCR可以通过将外 源性GPCR-编码mRNA注射到卵母细胞中而在卵母细胞中功能性表达，并然后容许20种卵 母细胞内源性细胞机器将受体翻译并插入到质膜中(参见，例如，Houamed等，kience (科 学)252 :1318-21,1991 ；Dahmen 等，J. Neurochem.(神经化学杂志)58 :1176-79,1992.)。 在受体功能性表达后，配体诱导跨膜电导变化的能力可以通过两电极电压钳系统(Dahmen 等，见上)观察到，这可以检测膜电势的去极化或超极化。用于筛选GPCR的其他技术是专业技术人员清楚的，例如，来自本文中引用的手 册、综述和现有技术。这些包括例如放射性配体结合测定，如例如在Lundstrom等，J Struct Funct Genomics.(结构功能遗传学杂志)2006年11月22日；[在出版前的电子公开]中 使用的和如在 Andre 等，Protein Sci (蛋白质科学)5 :1115 (2006) ；Hassaine 等，(2006) Prot Purif Expr (蛋白质纯化表达)45 :343 ；Nicholson 等 J Pharmacol Exp Ther.(药理 学实验治疗杂志)2006 May ；317 (2) :771-7. [2006年1月25日电子公开]和Vilardaga 等，JBiol Chem.(生物化学杂志)2001 年 9 月 7 日；276 (36) :33435-43. 2001 年 5 月 31 日 电子公开中所述的，其例如利用可以如Hovius等，(1998) JNeurochem(神经化学杂志)70 824中所述制备的膜制剂。用于筛选GPCR的一些HTS技术在由Jacoby等综述的表4中提 及。并且，根据本发明，针对来自第一温血动物物种的GPCR的氨基酸序列和多肽可 以或可以不表现出与来自一种或多种其它温血动物物种的GPCR的交叉反应性。例如， 针对人GPCR的氨基酸序列和多肽可以或可以不表现出与来自一种或多种其它灵长类 物种(诸如，不限于，来自猕猴属(Macaca)的猴子(诸如，并且特别地，食蟹猴(食蟹猴 (Macacafascicularis))和/或恒河猴(恒河猴(Macaca mulatta)))和狒狒(豚尾狒狒 (Papio ursinus)))的GPCR的交叉反应性，和/或与来自通常用于疾病的动物模型中(例 如小鼠、大鼠、兔、猪或狗)、且特别是用于与GPCR相关的疾病和紊乱的动物模型中的一种 或多种动物物种(诸如本文提及的物种和动物模型)的GPCR的交叉反应性。在这一方面， 对于专业技术人员应该清楚，从药物开发观点来看，所述交叉反应性，当存在时，可能具有 优点，因为它允许所述针对人GPCR的氨基酸序列和多肽在所述疾病模型中被检测到。更一般地，与来自多个哺乳动物物种的GPCR交叉反应的本发明的氨基酸序列和 多肽将通常有利于用于兽医应用，原因在于它将允许在多种物种之间使用相同的氨基酸序 列或多肽。因此，在本发明的范围内还包括，针对来自一个动物物种的GPCR的氨基酸序列 和多肽(诸如针对人GPCR的氨基酸序列和多肽)可以用于治疗另一个动物物种，只要所述 氨基酸序列和/或多肽的应用在待治疗的物种中提供所需要的作用。本发明在其最广泛意义上也不特别限于或限定于本发明的氨基酸序列和多肽所 针对的GPCR的特异性抗原决定簇、表位、部分、结构域、亚单位或构象(confirmation)(在 适用时)。例如，本发明的氨基酸序列可以通过用已经在合适表达系统中表达的或已经由合 适细胞或细胞级分分离的GPCR适当免疫哺乳动物(诸如骆驼科动物(Camelid))产生。具体地，本发明的氨基酸序列可以(例如利用Kiefer, Biochim. Biophys. Acta, 1610(2003)， 57-62的综述中描述的技术)针对已经重折叠的GPCR产生，并且针对和/或已经针对重折 叠的GPCR产生的氨基酸序列、纳米抗体和多肽形成本发明的另一方面。
本发明的氨基酸序列和多肽通常可以针对任何需要的GPCR，且可以具体地针对具 有至少一个胞外环或胞外结构域的GPCR。所述GPCR的实例基于本文中引用的现有技术对 专业技术人员应该是清楚的。根据本发明的特殊方面，本发明的氨基酸序列和多肽可以针对(如本文所定义) 在细胞表面上表达的GPCR和/或针对GPCR的至少一个胞外区、胞外结构域、胞外环或其他 胞外表位。例如，这样的氨基酸序列可以通过用具有GPCR或其表面的细胞或细胞级分适当 地免疫哺乳动物(诸如骆驼科动物)产生。特别地，根据该方面，本发明的氨基酸序列和多肽针对(如本文所定义)GPCR，例 如人CXCR4和/或人CXCR7的至少一个胞外区、胞外结构域、胞外环或其他胞外表位，且优 选进一步是这样的，即所述本发明的氨基酸序列和多肽能够调节(如本文所定义)所述 GPCR,例如人CXCR4和/或人CXCR7。更特别地，根据该方面，本发明的氨基酸序列和多肽针 对(如本文所定义)GPCR，例如人CXCR4和/或人CXCR7的至少一个胞外区、胞外结构域、 胞外环或其他胞外表位；且优选进一步是这样的，即所述本发明的氨基酸序列和多肽能够 (完全地或部分地)阻断所述GPCR，例如人CXCR4和/或人CXCR7。根据本发明的这个方面，本发明的氨基酸序列和多肽可以针对GPCR，例如人 CXCR4和/或人CXCR7的任何合适胞外部分、胞外区、胞外结构域、胞外环或其他胞外表位， 但优选针对跨膜结构域的一个胞外部分或更优选针对连接跨膜结构域的一个胞外环。所述合适的胞外区、胞外结构域、胞外环或表位的氨基酸序列可以通过相关GPCR， 例如人CXCR4和/或人CXCR7的氨基酸序列的Kyte-Doolittle分析；通过比对属于相同 (亚)家族的GPCR和识别各种跨膜结构域和胞外部分、胞外区、胞外结构域或胞外环；通过 TMAP分析；或通过其任何合适的组合获得。本发明还涉及针对所述胞外部分、胞外区、胞外 结构域、胞外环或表位的和/或已经针对其产生(和/或针对所述胞外部分、胞外区、胞外 结构域、胞外环或表位的合适部分或片段的和/或已经针对其和/或针对基于所述胞外部 分、胞外区、胞外结构域、胞外环或表位获得的合成或半合成肽产生)的氨基酸序列(如本 文中进一步所定义)。特别地，本发明的氨基酸序列和多肽优选是这样的，即，它们-以KT5-IO-12摩尔/升或更小、并且优选地KT7-IO-12摩尔/升或更小、并且更优选 地10_8-10_12摩尔/升的解离常数(Kd)(即，以IO5-IO12升/摩尔或更大、并且优选地IO7-IO12 升/摩尔或更大、且更优选地IO8-IO12升/摩尔的缔合常数(Ka))与GPCR(如本文中所述) 的胞外部分、胞外区、胞外结构域、胞外环或其他胞外表位结合或针对由其获得的肽结合；和/或是这样的，S卩，它们-以IO2M-1S-1-约 IO7MW 优选 ΙΟ^ΤΥ^ΙΟ 、-1，更优选 ΙΟ Υ Ο'Μ 诸如 ΙΟ^ΤΥΜΟΙΥ1的k。n-速率与GPCR(如本文中所述)的胞外部分、胞外区、胞外结构域、胞 外环或其他胞外表位结合或针对由其获得的肽结合；和/或是这样的，S卩，它们-以Is—1 (t1/2 = 0. 69s)-IO-6S-1 (提供具有多天的t1/2的几乎不可逆的复合体)，优选IOYU，更优选IOYU，诸如IOYU的k。ff速率与GPCR(如本文中 所述)的胞外部分、胞外区、胞外结构域、胞外环或其他胞外表位结合或针对由其获得的肽结合。优选地，本发明的单价氨基酸序列(或包含仅一个本发明的氨基酸序列的多肽) 优选是这样的，即，它将以小于500nM，优选小于200nM，更优选小于ΙΟηΜ，诸如小于500pM的 亲和力与GPCR(如本文中所述)的胞外部分、胞外区、胞外结构域、胞外环或其他胞外表位结合。而且，根据该方面，本发明的任何多价或多特异性(如本文所定义)多肽也可以适 当地针对同一抗原上的两个或更多不同的胞外部分、胞外区、胞外结构域、胞外环或其他胞 外表位，例如针对两个不同的胞外环、针对跨膜结构域的两个不同的胞外部分或针对一个 胞外环和一个胞外环。本发明的这样的多价或多特异性多肽还可以具有(或被改造和/或 被选择为)对于所需GPCR的增加的抗体亲抗原性(avidity)和/或提高的选择性，和/或 对于可以通过使用所述多价或单特异性多肽获得的任何其他所需性质或所需性质的组合。通常，预期本发明的针对GPCR的胞外环或胞外结构域(或针对源自其或基于其的 小肽)，和/或已经针对GPCR的胞外环或胞外结构域(或针对源自其或基于其的小肽)筛 选、利用其选择和/或针对其产生的氨基酸序列和多肽也应该能够结合(且特别地，特异性 结合，如本文中定义)所述形成存在于细胞表面上的GPCR的一部分(或其至少一个亚单 位)的胞外环或胞外结构域(或源自其的肽)。因此，所述胞外环或胞外结构域(或源自其 的肽)可以在用于生成本发明的氨基酸序列和多肽(如本文所定义)的方法中存在用途； 且所述方法和用途形成本发明的其他方面；针对胞外环或胞外结构域或源自其的肽或针对 其产生的本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽也形成本发明的其他方面。例如，所述方法可以包括以下a)用包含所需胞外部分、胞外区、胞外结构域、胞外环或其他胞外表位的合适抗 原，或用源自其或基于其的合适肽适当地免疫骆驼科动物，从而产生针对所需胞外部分、胞 外区、胞外结构域、胞外环或其他胞外表位的免疫应答的步骤。抗原可以是能够产生针对所 需胞外部分、胞外区、胞外结构域、胞外环或其他一个或多个胞外表位的免疫应答的任何合 适抗原；诸如，例如且不限于，有生命的并以其天然构象在其表面上过表达所需胞外部分、 胞外区、胞外结构域、胞外环或其他一个或多个胞外表位的完整细胞，其细胞壁片段或源自 所述细胞的任何其他制剂，在其表面上具有所需胞外部分、胞外区、胞外结构域、胞外环或 其他一个或多个胞外表位的囊泡，包含所需胞外部分、胞外区、胞外结构域、胞外环或其他 一个或多个胞外表位的GPCR例如人CXCR4和/或人CXCR7亚单位或亚单位的片段，或包 含和/或基于所需胞外部分、胞外区、胞外结构域、胞外环或其他一个或多个胞外表位(的 氨基酸序列)的合成或半合成肽；更优选地，有生命的并以其天然构象在其表面上过表达 所需胞外部分、胞外区、胞外结构域、胞外环或其他一个或多个胞外表位的完整细胞(例如 HEK293)；和b)利用过表达所述GPCR，例如人CXCR4和/或人CXCR7的不同(与免疫中使用 的那种不同)和若干细胞类型的细胞膜制剂来选择用于结合所需胞外部分、胞外区、胞外 结构域、胞外环或其他一个或多个胞外表位的步骤。这可以通过从在其表面上表达重链抗 体的细胞的组、集合或文库(例如获自适当免疫的骆驼科动物的B细胞)选择和使用例如用于第一轮选择的第一类细胞诸如例如CHO和例如用于第二轮选择的第二类细胞诸如例 如C0S-7细胞的细胞膜制剂来实现，通过使用例如用于第一轮选择的第一类细胞诸如例如 CHO和例如用于第二轮选择的第二类细胞诸如例如C0S-7细胞的细胞膜制剂从VHH序列或 纳米抗体序列的(幼稚或免疫)库中选择来实现，或通过使用例如用于第一轮选择的第一 类细胞诸如例如CHO和例如用于第二轮选择的第二类细胞诸如例如C0S-7细胞的细胞膜制 剂从编码VHH序列或纳米抗体序列的核苷酸序列的(幼稚或免疫)文库中选择来实现；其 都可以以本身已知的方式进行；和任选地c)用缓冲液诸如无去污剂的PBS仅适度洗涤；且该方法可以任选地进一步包括一 个或多个本身已知的其他合适步骤，诸如，例如且不限于，亲和力成熟的步骤，表达所需氨 基酸序列的步骤，筛选针对所需抗原(在该情形中，GPCR)结合和/或针对所需抗原(在该 情形中，GPCR)的活性的步骤，确定所需氨基酸序列或核苷酸序列的步骤，引入一个或多个 人源化取代(例如如本文中进一步所述)的步骤，以合适的多价和/或多特异性形式格式 化的步骤，筛选所需生物学和/或生理学性质(即利用合适的测定，诸如本文中所述的那 些)的步骤；和/或一个或多个所述步骤以任何合适顺序的任何合适组合。所述方法和通过所述方法获得的氨基酸序列，以及包含所述氨基酸序列或基本由 其组成的蛋白和多肽形成本发明的其他方面。本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽还可以在与内源性激动剂相同的位点(即 正构(orthosteric)位点)处结合GPCR，由此激活或增加受体信号传导；或备选地由此减 少或抑制受体信号传导。本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽还可以以这样方式结合GPCR，所述方式是 它们阻断GPCR的组成型活性。本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽还可以以这样的方法结合GPCR，所述方 式是它们介导变构调节(例如在变构位点处结合GPCR)。这样，本发明的氨基酸序列、纳 米抗体和多肽可以通过结合受体中的不同区域(例如在变构位点处)来调节受体功能。 参考例如针对George等，Nat RevDrug Discov (药物发现自然评论)1 :808-820 (2002)； Kenakin, TrendsPharmacol ki (药理学科学趋势)25 :186-192(2002)和 Rios 等， PharmacolTher (药理学治疗)92 :71-87(2001))进行。本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽还可以以这样的方法结合GPCR，所述方式 是它们抑制或增强GPCR功能性同二聚体或异二聚体的装配。本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽还可以以这样的方法结合GPCR，所述方式 是它们延长GPCR介导的信号传导的持续时间。本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽还可以通过增加受体-配体亲和力来增强 受体信号传导。针对GPCR及其配体的本发明多肽还可以通过使配体与正构位点交联；和/或稳定 配体与正构位点的结合而提供配体与GPCR增强的结合。因此，本发明的另一方面涉及本发 明的多特异性多肽(如本文所定义)，其包含至少一个本发明的针对GPCR蛋白酶的氨基酸 序列(诸如纳米抗体)和至少一个针对其天然配体的结合单元。所述多特异性蛋白也可以 进一步如本文中所述。而且，如由本文中进一步的公开内容应该清楚地，且取决于它们针对的GPCR和它们所需的(治疗)作用，本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽可以担当GPCR(和/或GPCR 的配体)和/或与其相关的生物学功能、途径、机制、作用、信号传导或反应的(完全的或部 分的)激动剂，(完全的或部分的，且竞争性的或非竞争性的)拮抗剂或反向激动剂。它们 可以以不可逆的方式执行这些作用，但优选以可逆的方式执行。在优选的实施方案中，本发明的氨基酸序列和多肽是本发明GPCR的(完全的或部 分的，且竞争性或非竞争性的)拮抗剂或反向激动剂，更优选地，本发明的氨基酸序列和多 肽是纳米抗体，其是本发明GPCR的(完全的或部分的，且竞争性或非竞争性的)拮抗剂或 反向激动剂。我们的结果显示单价和/或多价形式的纳米抗体，和可能地，还有本发明的氨基 酸序列和多肽，可以担当表现出纳米抗体平台的广阔适用性的针对组成型活性GPCR的中 性拮抗剂或反向激动剂。最畅销的GPCR药物中大部分表现为反向激动剂而非中性拮抗 剂(Milligan G. (2003). Mol. Pharmacol.(分子药理学)64 :1271-1276)并且已经声称 反向激动剂与中性拮抗剂相比，可以对若干疾病包括癌症具有特定的治疗益处(Kenakin T. (2004). Mol. Pharmacol.(分子药理学)65 :2-11)。此外，反向激动剂可以优于中性拮抗 剂来抑制其他功能。在优选的实施方案中，本发明的氨基酸序列和多肽是“单克隆”氨基酸序列或多 肽，这意味着所述针对所述蛋白或多肽中存在的GPCR(且优选所述蛋白或多肽中存在的全 部免疫球蛋白序列)的一个或多个氨基酸序列至少每一个是“单克隆”，如专业技术人员通 常理解地。然而，在该方面，应该注意到，如进一步在本文中所述，本发明明确地涵盖包含两 个或更多个免疫球蛋白序列(且特别地，单克隆免疫球蛋白序列)的多价或多特异性蛋白， 所述两个或更多个免疫球蛋白序列针对相同GPCR的不同部分、区、结构域、环或表位，且特 别地，针对相同GPCR的不同胞外部分、胞外区、胞外结构域、胞外环或表位。在适用时，本发明的氨基酸序列可以结合于GPCR的两个以上的抗原决定簇、表 位、部分、结构域、亚单位或构象，这也在本发明范围内。在此情况下，本发明的氨基酸序列 和/或多肽结合的GPCR的抗原决定簇、表位、部分、结构域或亚单位可以基本上是相同的 (例如，如果GPCR包含重复的结构基序或以多聚体形式存在)，或可以是不同的(并且在后 一种情况下，本发明的氨基酸序列和多肽可以以可能相同或不同的亲和力和/或特异性结 合于GPCR的所述不同的抗原决定簇、表位、部分、结构域、亚单位)。此外，例如，当GPCR以 活化构象存在和以无活性构象存在时，本发明的氨基酸序列和多肽可以结合于这些构象中 的任一种，或者可以结合于这两种构象(即，以可能是相同的或不同的亲和力和/或特异 性)。此外，例如，本发明的氨基酸序列和多肽可以这样地结合于GPCR的构象，即，在所述构 象中其与相关配体结合；可以这样地结合于GPCR的构象，S卩，在所述构象中其不与相关配 体结合，或者可以结合于所述两种构象(同样以可能是相同的或不同的亲和力和/或特异 性)。还期望本发明的氨基酸序列和多肽通常将结合于GPCR的所有天然存在的或合成 的类似物、变体、突变体、等位基因、部分和片段；或至少结合于GPCR的下面的那些类似物、 变体、突变体、等位基因、部分和片段，即它们包含与在GPCR中(例如在野生型异二聚体细 胞因子和/或它们的受体中)与本发明的氨基酸序列和多肽结合的(一个或多个)抗原决 定簇或(一个或多个)表位基本上相同的一个或多个抗原决定簇或表位。同样地，在此情况下，本发明的氨基酸序列和多肽可以以本发明的氨基酸序列与(野生型)GPCR结合的亲 和力和特异性相同或不同(即，高于或低于其)的亲和力和/或特异性结合于所述类似物、 变体、突变体、等位基因、部分和片段。本发明的氨基酸序列和多肽结合于GPCR的一些类似 物、变体、突变体、等位基因、部分和片段而不结合于另一些，这也包括在本发明的范围内。当GPCR以单体形式存在和以一个或多个多聚体形式存在时，本发明的氨基酸序 列和多肽只与单体形式的GPCR结合，只与多聚体形式的GPCR结合，或均与单体和多聚体形 式二者结合，在本发明的范围内。同样地，在这样的情形中，本发明的氨基酸序列和多肽可 以以与本发明的氨基酸序列和所述多聚体形式结合的亲和力和特异性相同，或不同(即， 高于或低于其)的亲和力和/或特异性与单体形式结合。此外，当GPCR可以与其他蛋白或多肽缔合以形成蛋白复合体(例如，具有多个亚 基)时，本发明的氨基酸序列和多肽与处于其非缔合状态的GPCR结合，与处于其缔合状态 的GPCR结合，或与二者均结合，这在本发明的范围内。在所有这些情形中，本发明的氨基酸 序列和多肽可以以与本发明的氨基酸序列和多肽与处于其单体和非缔合状态的GPCR结合 的亲和力和/或特异性可能是相同的或不同(即，高于或低于其)的亲和力和/或特异性 与所述多聚体或缔合的蛋白复合体结合。此外，对于专业技术人员应该是清楚的，包含两个或更多个针对GPCR的氨基酸序 列的蛋白或多肽可以以比相对应的一个或多个单体氨基酸序列更高的亲和力与GPCR结 合。例如，但不限于，包含两个或更多个针对GPCR的不同表位的氨基酸序列的蛋白或多肽 可以(并且通常将)以比不同单体的每一个更高的抗体亲抗原性结合，并且包含两个或更 多个针对GPCR的氨基酸序列的蛋白或多肽还可以(并且通常将)以更高的抗体亲抗原性 结合GPCR的多聚体。一般地，本发明的氨基酸序列和多肽将至少结合那些形式的GPCR(包括单体、多 聚体和缔合形式)，从生物学和/或治疗观点看来，这些形式是最相关的，这对于专业技术 人员将是清楚的。使用本发明的氨基酸序列和多肽的部分、片段、类似物、突变体、变体、等位基因和 /或衍生物，和/或使用包括一个或多个所述部分、片段、类似物、突变体、变体、等位基因和 /或衍生物或基本上由其组成的蛋白或多肽，也在本发明的范围内，只要这些适用于本发 明考虑的应用。所述部分、片段、类似物、突变体、变体、等位基因和/或衍生物通常将包含 (至少部分地)针对GPCR结合的功能性抗原-结合位点；并且更优选地将能够特异性结合 GPCR，并且甚至更优选地能够以如本发明所定义的亲和力(适当地测量和/或表示为Kd-值 (实际的或表观的)，Ka-值(实际的或表观的)，k。n-速率和/或k。ff-速率，或备选地作为 IC5tl值，如本发明进一步所述)结合GPCR。所述部分、片段、类似物、突变体、变体、等位基 因、衍生物、蛋白和/或多肽的一些非限制性实例将通过本发明的进一步描述变得清楚。还 可以通过适当组合(即，通过连接或基因融合)一个或多个(更小的)本发明所述的部分 或片段而提供本发明的其他片段或多肽。在本发明的一个具体而非限制性方面中，其将在本发明中进一步描述，与它们衍 生而来的氨基酸序列相比，所述类似物、突变体、变体、等位基因、衍生物具有增加的半衰期 (如本发明进一步所述)。例如，可以将本发明的氨基酸序列连接到(化学或其他方式)一 个或多个延长半衰期的基团或结构部分(诸如PEG)上，以提供具有增加的半衰期的本发明的氨基酸序列的衍生物。在一个具体而非限制性的方面中，本发明的氨基酸序列可以是包括免疫球蛋白 折叠的氨基酸序列，或可以是在适当条件(诸如生理条件)下能够形成免疫球蛋白折叠 (即，通过折叠)的氨基酸序列。其中特别参考Halaby等，J. (1999)蛋白质工程(Protein Eng.) 12，563-71的综述。优选地，当正确折叠以形成免疫球蛋白折叠时，这样的氨基酸序列 能够特异性结合(如本发明所定义)GPCR ；并且更优选地能够以如本发明所定义的亲和力 (适当地测量和/或表示为Kd-值(实际的或表观的)，Ka-值(实际的或表观的)，k。n-速 率和/或k。ff-速率，或备选地作为IC5tl值，如本发明进一步所述)结合GPCR。此外，所述氨 基酸序列的部分、片段、类似物、突变体、变体、等位基因和/或衍生物优选是这样的，以致 它们包括免疫球蛋白折叠或者能够在适当的条件下形成免疫球蛋白折叠。特别地，但不限于，本发明的氨基酸序列可以是基本上由4个构架区(分别为 FR1-FR4)和3个互补性决定区(分别为CDR1-CDR3)组成的氨基酸序列；或所述氨基酸序 列的任何适当的片段(那么其通常将包含至少一些形成至少一个CDR的氨基酸残基，如本 文进一步所述)。本发明的氨基酸序列可以特别是免疫球蛋白序列或其适当的片段，并且更特别地 是免疫球蛋白可变结构域序列或其适当的片段，诸如轻链可变结构域序列(例如，Vf序 列)或其适当的片段；或重链可变结构域序列(例如，Vh-序列)或其适当的片段。当本发 明的氨基酸序列是重链可变结构域序列时，它可以是来源于常规四链抗体的重链可变结构 域序列(诸如，不限于，来源于人抗体的Vh序列)，或是来源于所谓的“重链抗体”(如本文 所定义)的所谓的Vhh-序列(如本文所定义)。然而，应该注意到，本发明不限制本发明的氨基酸序列的来源(或用于表达其的 本发明的核苷酸序列的来源)，也不限制产生或获得(或已经产生或获得)本发明的氨基酸 序列或核苷酸序列的方法。因此，本发明的氨基酸序列可以是天然存在的氨基酸序列(来 自任何适当的物种)或合成的或半合成的氨基酸序列。在本发明的具体而非限制性方面， 所述氨基酸序列是天然存在的免疫球蛋白序列(来自任何适当的物种)或合成的或半合成 的免疫球蛋白序列，包括但不限于“人源化的”(如本文所定义)免疫球蛋白序列(诸如部 分或完全人源化的小鼠或兔免疫球蛋白序列，并且特别是部分或完全人源化的Vra序列或 纳米抗体)，“骆驼源化的(camelized)”(如本文所定义的)免疫球蛋白序列，以及已经通 过下列技术获得的免疫球蛋白序列诸如亲和力成熟(例如，起始于合成的、随机的或天然 存在的免疫球蛋白序列)，CDR移植，镶盖术(veneering)，组合来源于不同的免疫球蛋白序 列的片段，利用重叠的引物进行的PCR装配，以及专业技术人员公知的加工免疫球蛋白序 列的相似技术；或前述任一项的任何适当的组合。例如，参考标准手册，以及进一步描述和 本文提及的现有技术。类似地，本发明的核苷酸序列可以是天然存在的核苷酸序列或合成的或半合成的 序列，并且例如，可以是通过PCR从适当的天然存在的模板(例如，从细胞分离的DNA或 RNA)分离的序列，已经从文库(并且特别是表达文库)分离的核苷酸序列，已经通过向天然 存在的核苷酸序列中引入突变(利用任何适当的本身已知的技术，诸如错配PCR)而制备的 核苷酸序列，已经使用重叠的引物通过PCR制备的核苷酸序列，或已经利用本身已知的DNA 合成技术制备的核苷酸序列。
本发明的氨基酸序列可以特别是结构域抗体(或适合用作结构域抗体的氨基酸 序列)，单结构域抗体(或适合用作单结构域抗体的氨基酸序列)，“dAb"(或适合用作 dAb的氨基酸序列)或纳米抗体TM(NanobodyTM)(如本文所定义，并且包括但不限于Vhh序 列)；其它单可变结构域，或它们中任一种的任何适当的片段。对于(单)结构域抗体的 概括描述，参考上文引用的现有技术，以及参考EP 0 368 684。对于术语“dAb，s”，例如， 参考 Ward 等(自然(Nature) 1989 年 10 月 12 日；341 (6242) :544-6)，参考 Holt 等，生物 技术趋势(Trends Biotechnol.)，2003，21 (11) :484-490 ；以及例如参考 W006/030220，WO 06/003388与Domantis (Domantis Ltd.)有限公司的其它公布的专利申请。还应该注意 到，尽管由于它们不是哺乳动物来源的，在本发明的情形中较不优选，但是单结构域抗体或 单可变结构域可以来源于某些鲨鱼(shark)物种(例如，所谓的“IgNAR结构域”，参见例如 W005/18629)。特别地，本发明的氨基酸序列可以是纳米抗体 (如本文所定义)或其适当 的片段。[注意纳米抗体1￥^皿0130(^ )，纳米抗体“⑴^！！^！^肚⑶ ) 和纳米克隆 (Nanoclone )为埃博灵克斯股份有限公司(AblynxN. V.)的商标。]所述针对GPCR的纳 米抗体在本文也称为“本发明的纳米抗体”。对于纳米抗体的概括描述，参考下文的进一步描述，以及参考本文所引用的现有 技术。在这一方面，然而，应该注意到，本文描述和现有技术主要描述所谓“Vh3种类”的纳 米抗体(即，与VH3种类的人种系序列如DP-47、DP-51或DP-四具有高度序列同源性的纳 米抗体)，所述纳米抗体形成本发明的优选方面。然而，应该注意到，本发明在其最广泛意义 上通常涵盖任何类型的针对GPCR的纳米抗体，并且例如，还涵盖属于所谓的“Vh4种类”的 纳米抗体(即，与Vh4种类的人种系序列如DP-78具有高度序列同源性的纳米抗体)，例如， 如在埃博灵克斯股份有限公司(AblynxN. V.)于2006年4月14日提交的题目为“DP-78样 纳米抗体(DP-78-likeNanobodies)，，的美国临时申请60/792，279中描述。一般地，纳米抗体(特别是Vhh序列和部分人源化的纳米抗体)可以特别地特征 在于，在一个或多个构架序列(同样如本文进一步所述)中存在一个或多个“标志残基 (hallmark residues) ” (如本文所述)。因此，通常，纳米抗体可以定义为具有下述(通用)结构的氨基酸序列FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中FR1-FR4分别是指构架区1_4，并且其中⑶Rl-⑶R3分别是指互补性决定区 1-3，并且其中一个或多个标志残基如本文进一步所定义。特别地，纳米抗体可以是具有下述(通用)结构的氨基酸序列FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中FR1-FR4分别是指构架区1_4，并且其中⑶Rl-⑶R3分别是指互补性决定区 1-3，并且其中所述构架序列如本文进一步所定义。更特别地，纳米抗体可以是具有下述(通用)结构的氨基酸序列FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中FR1-FR4分别是指构架区1_4，并且其中⑶Rl-⑶R3分别是指互补性决定区 1-3，并且其中i)优选地，在按照 Kabat 编号的位置 11，37，44，45，47，83，84，103，104 和 108 的氨基酸残基的一个或多个选自下表A-3中提及的标志残基；并且其中ii)所述氨基酸序列与SEQ ID NO，s :1-22中的至少一种氨基酸序列具有至少 80%的氨基酸同一性，其中为了确定氨基酸同一性程度的目的，忽略形成CDR序列的氨基 酸残基(在序列SEQ ID NO，s 1-22中表示为X)。在这些纳米抗体中，所述⑶R序列通常如本文进一步所定义。因此，本发明还涉及这样的纳米抗体，其可以结合(如本文定义)和/或针对 GPCR，涉及其适当的片段，以及涉及包含一种或多种所述纳米抗体和/或适当的片段或基 本上由其组成的多肽。SEQ ID NO，s 238-253给出了已经针对人CXCR4产生的许多Vhh序列的氨基酸序 列(表1)。表1 针对人CXCR4(SEQ ID NO 254)的纳米抗体
权利要求
1.多肽，其包含一种或多种特异性结合人CXCR4(SEQ ID NO 254)的纳米抗体和可能 包含一种或多种特异性结合血清蛋白的纳米抗体，且其中所述一种或多种特异性结合人CXCR4的纳米抗体通过包括至少以下步骤的方 法生成a)用有生命的并在其表面上表达人CXCR4的完整细胞免疫美洲驼；和b)关于针对人CXCR4的结合进行选择；和任选地c)在所述选择步骤中，仅使用缓冲液诸如无去污剂的PBS温和洗涤； 且其中a)所述多肽在竞争结合测定中结合人CXCR4时，在高浓度下(》IOOnM)替代超过 50 %，更优选60 %，甚至更优选70 %，甚至更优选80 %，甚至更优选90 %，最优选95 %的人 CXCL12(SEQ ID NO :267)，和 / 或b)所述多肽在等于或低于ΙΟΟηΜ，更优选ΙΟηΜ，更优选InM和最优选0.InM的浓度下， 完全拮抗人CXCL12对人CXCR4的趋化作用；并且其中如果所述多肽包含两种或更多种纳米抗体，则所述多肽任选还包含一个或更 多肽接头。
2.权利要求1所述的多肽，其包含两种或更多种特异性结合人CXCR4的纳米抗体。
3.权利要求1或2所述的多肽，其包含两种特异性结合人CXCR4的纳米抗体。
4.权利要求1、2或3所述的多肽；其中至少一种纳米抗体基本上由4个构架区(分别 为FR1-FR4)和3个互补性决定区(分别为⑶Rl-⑶R3)组成，其中⑶Rl选自由下列各项组 成的组a)SEQ ID NO，s :142-143 的氨基酸序列；b)与SEQID NO，s :142-143的至少一个氨基酸序列具有至少80%的氨基酸同一性的氨基酸序列；c)与SEQID NO，s :142-143的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨 基酸序列；且-⑶R2选自由下列各项组成的组d)SEQ ID NO，s :174-175 的氨基酸序列；e)与SEQID NO，s :174-175的至少一个氨基酸序列具有至少80%的氨基酸同一性的氨基酸序列；f)与SEQID NO，s :174-175的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨 基酸序列；且-⑶R3选自由下列各项组成的组g)SEQ ID NO，s =206-207 的氨基酸序列；h)与SEQID NO，s :206-207的至少一个氨基酸序列具有至少80%的氨基酸同一性的氨基酸序列；i)与SEQID NO，s :206-207的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列。
5.权利要求1、2、3或4的多肽；其中所述两种特异性结合人CXCR4的纳米抗体基本上 由4个构架区(分别为FR1-FR4)和3个互补性决定区(分别为⑶Rl-⑶R3)组成，其中⑶Rl 选自由下列各项组成的组a)SEQ ID NO，s :142-143 的氨基酸序列；b)与SEQID NO，s :142-143的至少一个氨基酸序列具有至少80%的氨基酸同一性的氨基酸序列；c)与SEQID NO，s :142-143的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨 基酸序列；且-⑶R2选自由下列各项组成的组d)SEQ ID NO，s :174-175 的氨基酸序列；e)与SEQID NO，s :174-175的至少一个氨基酸序列具有至少80%的氨基酸同一性的氨基酸序列；f)与SEQID NO，s :174-175的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨 基酸序列；且-⑶R3选自由下列各项组成的组g)SEQ ID NO，s =206-207 的氨基酸序列；h)与SEQID NO，s :206-207的至少一个氨基酸序列具有至少80%的氨基酸同一性的氨基酸序列；i)与SEQID NO，s :206-207的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列。
6.权利要求1、2、3、4或5的多肽；其中所述一种特异性结合人CXCR4的纳米抗体基本 上由4个构架区(分别为FR1-FR4)和3个互补性决定区(分别为⑶Rl-⑶R3)组成，其中 ⑶Rl选自由下列各项组成的组a)SEQ ID NO，s :142的氨基酸序列；b)与SEQID NO，s :142的至少一个氨基酸序列具有至少80%的氨基酸同一性的氨基 酸序列；c)与SEQID NO’ s 142的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸 序列；且-⑶R2选自由下列各项组成的组d)SEQ ID NO，s :174的氨基酸序列；e)与SEQID NO，s :174的至少一个氨基酸序列具有至少80%的氨基酸同一性的氨基 酸序列；f)与SEQID NO’ s 174的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸 序列；且-⑶R3选自由下列各项组成的组g)SEQ ID NO，s 206的氨基酸序列；h)与SEQID NO，s 206的至少一个氨基酸序列具有至少80%的氨基酸同一性的氨基 酸序列；i)与SEQID NO，s :206的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸 序列；其中所述另一种特异性结合人CXCR4的纳米抗体基本上由4个构架区(分别为 FR1-FR4)和3个互补性决定区(分别为⑶Rl-⑶R3)组成，其中⑶Rl选自由下列各项组成 的组j) SEQ ID NO，s 143的氨基酸序列；k)与SEQ ID NO，s :143的至少一个氨基酸序列具有至少80%的氨基酸同一性的氨基 酸序列；1)与SEQ ID NO’ s 143的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸 序列； 且-⑶R2选自由下列各项组成的组 m) SEQ ID NO，s :175的氨基酸序列；η)与SEQ ID NO，s :175的至少一个氨基酸序列具有至少80%的氨基酸同一性的氨基 酸序列；ο)与SEQ ID NO’ s 175的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸 序列； 且-⑶R3选自由下列各项组成的组 p) SEQ ID NO，s 207的氨基酸序列；q)与SEQ ID NO，s :207的至少一个氨基酸序列具有至少80%的氨基酸同一性的氨基 酸序列；r)与SEQ ID NO，s :207的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸 序列。
7.权利要求1、2、3、4、5或6所述的多肽；其中所述纳米抗体选自由与SEQID NO’ s 238-239的至少一种氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性的纳米抗体组成的组。
8.权利要求1、2、3、4、5、6或7所述的多肽，其中所述多肽选自由与SEQID NO，s 沈1力64，优选SEQ ID NO，s 263-264的至少一种氨基酸序列具有至少80%氨基酸同一性 的多肽组成的组。
9.纳米抗体，其基本上由4个构架区(分别为FR1-FR4)和3个互补性决定区(分别为 ⑶Rl-⑶R3)组成，其中⑶Rl选自由下列各项组成的组a)SEQ ID NO，s :142-143 的氨基酸序列；b)与SEQID NO，s :142-143的至少一个氨基酸序列具有至少80%的氨基酸同一性的氨基酸序列；c)与SEQID NO，s :142-143的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨 基酸序列；且-⑶R2选自由下列各项组成的组d)SEQ ID NO，s :174-175 的氨基酸序列；e)与SEQID NO，s :174-175的至少一个氨基酸序列具有至少80%的氨基酸同一性的氨基酸序列；f)与SEQID NO，s :174-175的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨 基酸序列；且-⑶R3选自由下列各项组成的组g)SEQ ID NO，s =206-207 的氨基酸序列；h)与SEQID NO，s :206-207的至少一个氨基酸序列具有至少80%的氨基酸同一性的氨基酸序列；i)与SEQID NO，s :206-207的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列。
10.核酸或核苷酸序列，其编码根据权利要求1-9中任一项中所述的多肽或纳米抗体。
11.宿主细胞，其在合适的环境下能够表达根据权利要求1-9中任一项中所述的多肽 或纳米抗体。
12.药物组合物，其包含根据权利要求1-9中任一项所述的多肽或纳米抗体。
13.根据权利要求12所述的药物组合物，其还包含至少一种药用载体、稀释剂或赋形 剂和/或佐剂，且其任选地包含一种或多种另外的药物活性多肽和/或化合物。
14.用于筛选针对人CXCR4(SEQID NO :254)的氨基酸序列的方法，所述方法包括至少 以下步骤a)提供编码氨基酸序列的核酸序列的组、集合或文库；b)从所述核酸序列的组、集合或文库中筛选编码可以结合人CXCR4和/或具有针对人 CXCR4的亲和性且是交叉阻断的或交叉阻断根据权利要求1-9所述的纳米抗体或多肽的氨 基酸序列的核酸序列；和c)分离所述核酸序列，然后表达所述氨基酸序列。
15.用于治疗癌症或AIDS的方法或应用，所述方法或应用包括向需要所述方法或应用 的受试者施用药物活性量的根据权利要求1-9任一项中所述的至少一种多肽或纳米抗体。
全文摘要
本发明涉及针对(如本文所定义)G蛋白偶联受体(GPCRs)和具体地针对CXCR4和CXCR7的氨基酸序列，以及涉及包含一种或多种所述氨基酸序列或基本由其组成的化合物或构建体，且特别地蛋白和多肽(本文中分别也称为“本发明的氨基酸序列”、“本发明的化合物”、和“本发明的多肽”)。此外，本发明提供制备针对跨膜蛋白，和特别地对于多次跨膜的跨膜蛋白的氨基酸序列的新方法，对于所述跨膜蛋白，不能在其他“体外”系统中复制天然构象(例如，一般GPCRs)。
文档编号A61P31/18GK102099378SQ200980127612
公开日2011年6月15日 申请日期2009年5月18日 优先权日2008年5月16日
发明者克里斯托夫·布朗什托, 彼得·万兰德舒特, 斯文·耶尼兴, 约翰内斯·约瑟夫·威廉姆斯·德哈德, 迈克尔·约翰·斯科特·桑德斯, 雷格留斯·勒尔, 马丁·斯密特 申请人:埃博灵克斯股份有限公司