包含因子VIII和冯·维勒布兰德因子肽的制剂的制作方法

背景技术：

因子VIII(Factor VIII，“FVIII”)是约280kDa分子量的血浆糖蛋白。其参与导致血液凝固的凝血反应级联。最常见的出血性疾病由缺乏功能性因子VIII引起，其称为A型血友病。其用因子VIII的替代(血浆来源的或重组的)治疗。因子VIII用于A型血友病患者出血的急性和预防性治疗。

因子VIII的氨基酸序列被组织成三个结构域：330个氨基酸的三重A结构域(triplicated A domain)，980个氨基酸的单个B结构域，和150个氨基酸的双重C结构域(duplicated C domain)。B结构域与其他蛋白质没有同源性，并提供该蛋白质25个潜在天冬酰胺(N)-连接的糖基化位点中的18个。B结构域在凝血中显然没有作用。与全长因子VIII相比，B结构域缺失的因子VIII分子具有不变的促凝活性。一些重组因子VIII(recombinant Factor VIII，rFVIII)制剂是B结构域缺失的。

在血浆中，因子VIII通过与冯·维勒布兰德因子蛋白(Von Willebrand Factor，“vWF”)缔合而稳定，其似乎抑制因子VIII的清除，例如通过蛋白水解或受体介导的通过LRP受体的清除。在循环中，在正常生理条件下，冯·维勒布兰德因子以相对于因子VIII的50倍摩尔过量存在。

冯·维勒布兰德因子是存在于哺乳动物血浆中的多聚粘附糖蛋白，其具有多种生理功能。在初级止血期间，冯·维勒布兰德因子充当血小板表面上的特异性受体与胞外基质(例如胶原蛋白)的组分之间的介体。此外，冯·维勒布兰德因子还充当促凝血因子VIII的载体和稳定蛋白。冯·维勒布兰德因子在内皮细胞和巨核细胞中以2813个氨基酸的前体分子合成。该前体多肽(前原冯·维勒布兰德因子)由22残基信号肽、741残基前肽和在成熟血浆冯·维勒布兰德因子中发现的2050残基多肽组成(Fischer等，FEBS Lett.351：345-348，1994)。在分泌到血浆中后，冯·维勒布兰德因子以具有不同分子大小的多个种类的形式循环。这些冯·维勒布兰德因子分子由2050个氨基酸残基的成熟亚基的寡聚体和多聚体组成。冯·维勒布兰德因子通常可以大小约500至20,000 kDa的多聚体见于血浆中(Furlan，Ann Hematol.1996年6月；72(6)：341-8)。

人因子VIII在人体循环中的平均体内半衰期为约12小时。当与因子VIII形成复合物时，冯·维勒布兰德因子可以通过针对因子VIII分子上的重链(A2结构域)和轻链(A3/C2结构域)上的已知潜在抑制剂抗体位点(Ragni，J Thromb.Haemost.10：2324-2327，2012)或其他潜在抗体抑制剂位点对FVIII进行保护，降低对因子VIII的可能免疫反应。

人的另一种出血性疾病是血管性血友病(Von Willebrand′s disease，vWD)。根据出血症状的严重程度，可以通过用含有冯·维勒布兰德因子的浓缩物进行替代疗法来治疗vWD，所述冯·维勒布兰德因子一般来自血浆，但是重组冯·维勒布兰德因子也在开发中。已知冯·维勒布兰德因子在体内稳定因子VIII，由此在调节因子VIII的血浆水平中起关键作用，因此是控制初级和二级止血的中心因素。

直到今天，A型血友病和vWD的标准治疗涉及频繁的静脉内输注因子VIII和因子VIII/冯·维勒布兰德因子浓缩物的制剂。这些替代疗法一般是有效的，然而，例如在经历预防性治疗的严重A型血友病患者中，由于因子VIII约12小时的短血浆半衰期，因此因子VIII必须每周静脉内(i.v.)施用约3次。通过实现高于正常人血浆1％的因子VIII水平(对应于因子VIII水平升高0.01U/ml)，已经将严重的A型血友病转变成中度A型血友病。在预防性治疗中，设计给药方案以使得因子VIII活性的水平不低于非血友病因子VIII活性的2-3％的水平。

通过静脉内施用(i.v.)施用因子VIII是麻烦的，其与疼痛相关联并且带来感染的风险，尤其是因为这主要是由患者自己或由被诊断患有A型血友病的儿童的家长在家庭治疗中完成的。此外，频繁的静脉内注射不可避免地导致疤痕形成，从而干扰未来的输注。在紧急情况或手术中(即当立即需要高的因子VIII水平时)可能仍然需要静脉内治疗。

已经提出了因子VIII的皮下施用(s.c.)(例如在WO 95/01804 A1和WO 95/026750 A1中)。然而，必须施用非常高剂量的因子VIII以实现可接受的生物利用度。

在非静脉内施用时改善生物利用度的另一种方法是使用白蛋白融合的因子VIII(WO 2011/020866 A2)。

WO 2013/057167 A1提出通过非静脉内施用将因子VIII与硫酸化糖胺聚糖组合施用，其任选地与冯·维勒布兰德因子一起施用。

WO 2008/151817 A1描述了未切割的冯·维勒布兰德因子多聚体用于稳定因子VIII(血浆来源的或重组(全长和缺失突变体))的一般用途，旨在用于血管外治疗。

WO 2013/160005 A1描述了重组冯·维勒布兰德因子或重组冯·维勒布兰德因子片段在皮下治疗后改善非常特异性的因子VIII分子的生物利用度的一般用途，其中所述因子VIII分子包含大小为100-400个氨基酸的截短的B结构域。根据WO 2013/160005A1，与具有整个B结构域的因子VIII或者不具有或仅具有几个氨基酸的B结构域截短的因子VIII分子相比，具有100至400个氨基酸的截短的B结构域的因子VIII分子具有更高的因子VIII生物利用度。

仍然需要表现出改善的生物利用度、稳定性和/或更低抗体产生风险的因子VIII制剂，从而避免现有技术的缺点。

本发明的目的是提供替代的因子VIII制剂。优选地，这些制剂应表现出改善的稳定性、改善的生物利用度和/或降低的免疫反应的风险。

在一个实施方案中，该目的通过包含因子VIII与一种或更多种冯·维勒布兰德因子肽之复合物的组合物实现，其中所述冯·维勒布兰德因子肽包含SEQ ID No.1的至少764至1035和1691至1905位氨基酸，但不包含SEQ ID NO 1的2255至2645位氨基酸。

根据本发明，提供了包含冯·维勒布兰德因子肽的因子VIII制剂。因子VIII与所包含的冯·维勒布兰德因子肽形成复合物。

本文所用的因子VIII涵盖全长因子VIII、B结构域缺失的因子VIII或这样的因子VIII：其中所述B结构域已被人工接头或天然B结构域的片段或者这两者的组合所替代，即所述B结构域与全长因子VIII相比具有不同的大小。其还涵盖带有有限数目的具有插入、缺失或替换之修饰的因子VIII，特别是适于如K.R.Viel，等New England J Med 2009；360：1618-1627中所述的单倍型的因子VIII。优选地，与因子VIII具有序列同源性(如1986年7月21日SwissProt的P00451的20-2351位氨基酸所限定的)，但是如在FASTA第36版中所执行的，忽略根据FASTA的99％的B结构域中的同源性，其基于W.R.Pearson(1996)“Effective protein sequence comparison”Meth.Enzymol.266：227-258。换句话说，当计算序列同源性时，B结构域不包括在这两种蛋白质的比较中。还涵盖经修饰的因子VIII，如HES-因子VIII或PEG因子VIII或因子VIII Fc融合蛋白和因子VIII白蛋白融合蛋白，如在Oldenburg，Haemophilia(2014)，20(Suppl.4)，23-28中所述。

本发明的因子VIII可以是血浆来源的或重组的因子VIII。当使用重组因子VIII时，其优选在人细胞系中表达以模拟人糖基化模式(Casademunt，Eur J Haematol.2012；89：165-76)或如WO 2010/020690中所述。

本文所用的冯·维勒布兰德因子肽是在单个氨基酸链中包含SEQ ID No.1的至少764至1035位氨基酸和SEQ ID No.1的1691至1905位氨基酸的肽。这些氨基酸可以是一起包含这些序列两者的较长序列的一部分。换言之，本发明的冯·维勒布兰德肽包含SEQ ID No.5和SEQ ID No.6两者。其可以包含冯·维勒布兰德因子的其他部分，但不包含2255至2645位的所有氨基酸(SEQ ID No.7)。冯·维勒布兰德肽可以包含作为SEQ ID No.1的一部分的其他序列或不是SEQ ID No.1的一部分的序列，例如，氨基酸接头等。优选地，不是SEQ ID No.1的一部分的氨基酸的总量不超过50个，不超过20个或不超过10个氨基酸。

本发明的一个重要方面是，SEQ ID No.1的2255至2645位氨基酸不是冯·维勒布兰德因子肽的一部分。换言之，冯·维勒布兰德因子肽不包含根据FASTA与SEQ ID No.7具有至少90％同源性的任何序列，如下所述。

SEQ ID No.1是2011年1月11日的Swiss Prot数据库的序列P04275。

本发明组合物中的冯·维勒布兰德因子肽可以是具有相同序列的肽，或可以是具有上述序列的肽的混合物。

通常，因子VIII与冯·维勒布兰德因子肽的分子比为1∶1至1∶20，优选1∶2至1∶10。如果冯·维勒布兰德因子肽是二聚体或多聚体的形式，则在单个氨基酸链上计算分子比，即因子VIII分子与冯·维勒布兰德因子肽的二聚体的复合物将具有1∶2的比。

本文所用的复合物是指因子VIII与一种或更多种冯·维勒布兰德因子肽的非共价结合。

在本发明的一个优选实施方案中，冯·维勒布兰德因子肽是冯·维勒布兰德因子的片段，即冯·维勒布兰德因子的N端和域C端截短形式。

在一个实施方案中，所述片段包含SEQ ID No.1的764至1905位氨基酸。

本发明的另一个实施方案是包含因子VIII与一种或更多种冯·维勒布兰德因子肽之复合物的组合物，所述冯·维勒布兰德因子肽是冯·维勒布兰德因子的片段，并具有这样的氨基酸序列：其对应于SEQ ID NO 1之起始于764位氨基酸并且在1905和2153位氨基酸之间终止的氨基酸序列并具有多至20，或多至10个选自氨基酸缺失、氨基酸插入或氨基酸替换的修饰。

优选的冯·维勒布兰德因子肽是：

具有SEQ ID NO.1的764至1905位序列的肽

具有SEQ ID NO.1的764至1906位序列的肽

具有SEQ ID NO.1的764至1907位序列的肽

具有SEQ ID NO.1的764至1908位序列的肽

具有SEQ ID NO.1的764至1909位序列的肽

具有SEQ ID NO.1的764至1910位序列的肽

具有SEQ ID NO.1的764至1911位序列的肽

具有SEQ ID NO.1的764至1912位序列的肽

具有SEQ ID NO.1的764至1913位序列的肽

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具有SEQ ID NO.1的764至1925位序列的肽

具有SEQ ID NO.1的764至1926位序列的肽

具有SEQ ID NO.1的764至1927位序列的肽

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具有SEQ ID NO.1的764至1930位序列的肽

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具有SEQ ID NO.1的764至1977位序列的肽

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具有SEQ ID NO.1的764至1980位序列的肽

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具有SEQ ID NO.1的764至2136位序列的肽

具有SEQ ID NO.1的764至2137位序列的肽

具有SEQ ID NO.1的764至2138位序列的肽

具有SEQ ID NO.1的764至2139位序列的肽

具有SEQ ID NO.1的764至2140位序列的肽

具有SEQ ID NO.1的764至2141位序列的肽

具有SEQ ID NO.1的764至2142位序列的肽

具有SEQ ID NO.1的764至2143位序列的肽

具有SEQ ID NO.1的764至2144位序列的肽

具有SEQ ID NO.1的764至2145位序列的肽

具有SEQ ID NO.1的764至2146位序列的肽

具有SEQ ID NO.1的764至2147位序列的肽

具有SEQ ID NO.1的764至2148位序列的肽

具有SEQ ID NO.1的764至2149位序列的肽

具有SEQ ID NO.1的764至2150位序列的肽

具有SEQ ID NO.1的764至2151位序列的肽

具有SEQ ID NO.1的764至2152位序列的肽

具有SEQ ID NO.1的764至2153位序列的肽。

本发明的另一个实施方案是包含因子VIII与一种或更多种冯·维勒布兰德因子肽之复合物的组合物，其中

-所述冯·维勒布兰德因子肽是冯·维勒布兰德因子的片段

-相比于单独的因子VIII，所述因子VIII与所述冯·维勒布兰德因子的片段的复合物表现出与磷脂膜的结合降低

-相比于因子VIII与全长冯·维勒布兰德因子的复合物，所述因子VIII与所述冯·维勒布兰德因子的片段的复合物表现出与胶原蛋白III的结合降低

-相比于因子VIII与全长冯·维勒布兰德因子的复合物，所述因子VIII与所述冯·维勒布兰德因子的片段的复合物表现出与肝素的结合降低。

优选地，冯·维勒布兰德因子肽的分子量＜500kD，优选＜400kD。由于冯·维勒布兰德因子通常形成寡聚体或多聚体，因此本发明的肽也可以是多聚体或寡聚体的形式。

在一个优选的实施方案中，本发明的肽具有选自以下的至少一种性质：

(i)对肝素的亲和结合常数K_D＞1nM，优选≥2.43nM

(ii)对胶原蛋白III的亲和结合常数K_D＞5nM，优选≥17.02nM

(iii)对因子VIII的亲和结合常数K_D＜100nM或＜10nM，优选≤6.19nM，以及

(iv)抑制至少70％，优选至少80％或至少90％的因子VIII磷脂结合。

本发明的冯·维勒布兰德因子肽优选表现出与肝素结合的降低、对胶原蛋白(如胶原蛋白III)的较低亲和力、对磷脂的较低亲和力，但仍然对因子VIII具有高结合。

令人惊奇的是，在非静脉内施用(特别是皮下施用)的情况下，与磷脂和胶原蛋白的低结合改善了释放速率。

各亲和结合常数的测量在实验部分中进行了描述。

在一个实施方案中，冯·维勒布兰德因子肽通过蛋白水解切割或化学切割从冯·维勒布兰德因子获得。如果使用蛋白水解切割，则金黄色葡萄球菌(S.aureus)V-8蛋白酶是特别优选的。

优选地，本发明的组合物具有以下的至少一种性质：

(i)所述冯·维勒布兰德因子肽保护因子VIII免受抗体结合以使患者中的抑制剂形成最小化

(ii)稳定因子VIII，以在-70℃下以冷冻液体形式储存12个月后提供至少90％的剩余因子VIII活性

(iii)稳定因子VIII，以在5℃下以冻干形式储存24个月后提供至少90％的剩余因子VIII活性

(iv)稳定因子VIII，以在25℃下以冻干形式储存12个月后提供至少90％的剩余因子VIII活性

(v)将因子VIII的体内半衰期延长至少20％，以及

(vi)在用所述组合物处理6个月后，将先前未处理患者中的抑制剂形成减少至小于20％，优选小于10％。

令人惊讶的是，冯·维勒布兰德因子肽似乎在储存时(货架期)提高因子的稳定性和/或减少患者中的抑制剂形成。抑制剂形成是治疗慢性出血性疾病中的主要问题之一。

本发明的组合物尤其可用于治疗或预防出血性疾病。

因此，本发明的另一个实施方案是治疗出血性疾病的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的本发明组合物。

所述量取决于待治疗的疾病或病症，并且可以由本领域技术人员选择。对于长期治疗，每次施加20至40IU/kg体重的量通常是合适的。在紧急情况下，所述量可以为约10至50IU/kg体重。

本发明的组合物可以通过静脉内施用或非静脉内施用来施加。非静脉内施用可以是皮下注射、皮内注射或肌内施用。

本发明方法的一个优点是可使用纳米过滤来除去病毒。冯·维勒布兰德因子由于其大小，不能用具有小孔径以除去病毒的纳米过滤器进行纳米过滤。因为冯·维勒布兰德因子肽的大小比全长冯·维勒布兰德因子分子小得多，所以具有小孔径的纳米过滤变得可能。任选地使用一个或更多个串联的纳米过滤器，在这样的孔径和条件下进行纳米过滤，所述孔径和条件将最小的已知病毒之一猪细小病毒(porcine parvovirus)的浓度降低至少100倍(2log)，优选至少1000倍(3log)，最优选降低至低于细小病毒测定的检测极限的浓度。对于该测试，将猪细小病毒掺入(spike)样品中，并在过滤后进行分析。

因此，本发明的另一个实施方案是用于减少病毒的方法，其包括在与因子VIII组合之前或之后纳米过滤所述冯·维勒布兰德因子肽的步骤，由此猪细小病毒将减少至少2log。

用于施用本发明组合物的一种优选缓冲液(puffer)包含优选高达1000mM，特别是约10mM至约200mM，特别是约10mM至约100mM的量的松三糖(melizitose)。

本发明的另一个实施方案是制备冯·维勒布兰德因子肽的方法，其包括以下步骤：

·将冯·维勒布兰德因子与金黄色葡萄球菌V-8蛋白酶在酶与冯·维勒布兰德因子重量/重量比为1∶5至1∶100的条件下孵育2至16小时

·在阴离子交换剂上结合和纯化，并通过施加增加量的盐浓度，在来自所述阴离子交换剂的级分中收集期望的经纯化的vWF肽。

附图说明

图1示出了来自通过金黄色葡萄球菌V8蛋白酶消化的pdVWF的片段III(SPIII)的纯化。A-片段III(由箭头指示)洗脱谱的MonoQ色谱图。B-纯化片段的SDS-PAGE凝胶；red.-还原；n.r.-非还原。

图2示出了来自通过胰蛋白酶消化的片段III的片段I(III-T4)的纯化。片段I(由箭头指示)洗脱谱的MonoQ色谱图。纯化片段的非还原SDS-PAGE图片示于插图中。

图3示出了在第二次金黄色葡萄球菌V8蛋白酶消化后来自片段III的片段II的纯化。A-还示出了第二切割产物片段II(由箭头指示)以及V8蛋白酶洗脱谱的MonoQ色谱图。B-完全去除蛋白酶所需的第二MonoQ色谱法的色谱图。纯化片段的还原SDS-PAGE图片示于插图中。

图4示出了pdVWF、片段II和III与rFVIII的结合。A，B，C-结合传感图(灰色曲线)，和曲线比对(黑色曲线)，其代表固定的rFVIII与pdVWF/纯化的片段II和III之间的相互作用。浓度和样品类型如图上所示。C-以平均值和SEM表示的解离常数(K_D)；n＝8。

图5示出了SPR中rFVIII与磷脂单层的结合以及pdVWF的抑制。A-在108nM BSA(bovine serum albumin，牛血清白蛋白)或47.6nM pdVWF存在下的rFVIII和rFVIII的结合传感图；每个样品一式三份。B-在分析物注射结束后120秒测量的结合水平的平均值和SD，表示为rFVIII结合的百分比；n＝3。

图6示出了在SPR中测量的通过冯·维勒布兰德因子衍生的片段对rFVIII-磷脂相互作用的抑制。在三种不同浓度的三种冯·维勒布兰德因子衍生片段的存在下进行rFVIII与磷脂单层的结合(浓度和片段类型示于图上)。图表示分析物注射结束后120秒测量的结合水平的平均值和SD，表示为rFVIII结合的百分比；n＝3。

图7示出了片段III对rFVIII与磷脂单层结合的浓度依赖性抑制。A-在不同浓度的片段III(浓度如图上所示)存在下rFVIII与磷脂单层的结合传感图，每个样品一式三份。B-在分析物注射结束后120秒测量的结合水平的平均值和SD，表示为rFVIII结合的百分比；n＝3。

图8示出了pdVWF和片段III与III型胶原蛋白的结合。A，B-结合传感图(灰色曲线)，和曲线比对(黑色曲线)，其代表固定的III型胶原蛋白和pdVWF/纯化的片段III之间的相互作用。浓度和样品类型如图上所示。C-以平均值和SEM表示的解离常数(K_D)；n＝9。

图9示出了pdVWF和片段III与肝素的结合。A，B-结合传感图(灰色曲线)，和曲线比对(黑色曲线)，其代表固定的肝素和pdVWF/纯化片段III之间的相互作用。浓度和样品类型如图上所示。C-以平均值和SEM表示的解离常数(K_D)；n＝6。

图10示出了在单独用FVIII或与VWF片段III组合皮下处理的来自A型血友病狗的血液样品中测量的全血凝血时间(whole blood clottingtime，WBCT)值的比较。在200IU FVIII/kg BW施加下，将与5倍摩尔过量的VWF片段III组合的FVIII经皮下施加后获得WBCT。水平虚线标记正常狗的凝血时间的上限(12分钟)。

图11示出了在施加FVIII或者FVIII与VWF片段III组合后获得的A型血友病狗血浆样品中用显色FVIII活性测定测量的FVIII活性。A-将FVIII或具有5倍摩尔过量VWF片段III的FVIII以200IU FVIII/kg BW皮下施加；单独FVIII样品的曲线下面积(area under the curve，AUC)为2.867，而FVIII与VWF片段III的组合为4.917。B-FVIII或具有5倍摩尔过量VWF片段III的FVIII以200IU FVIII/kg BW静脉内施加。单独的FVIII样品的AUC为27.69，而FVIII与VWF片段III的组合为45.72。

图12示出了重组片段III单体、重组片段III二聚体和血浆来源的VWF(nVWF)与rFVIII的结合。A，B，C-结合传感图(灰色曲线)，和曲线比对(黑色曲线)，其代表固定的VWF或重组VWF片段与FVIII之间的相互作用。样品类型如图上所示。所施加的FVIII的浓度为0、0.2、0.6、1.7、5、15、45和135nM。D-以平均值和SD表示的解离常数(K_D)；n＝4。

图13示出了VWF片段III对FVIII的稳定化。在不同时间点测量单独的FVIII或与VWF片段III之复合物中的FVIII在40℃下孵育的FVIII活性。

图14示出了如实施例9中所述的使用两种VWF片段的肝素亲和色谱法的肝素结合。

实施例

通过以下非限制性实施例进一步解释本发明。

实施例1

产生和纯化来自血浆的冯·维勒布兰德因子的片段。

片段III(SPIII，res.764-2128)的产生和纯化(根据Marti等Identification of disulfide-bridged substructures within human von Willebrand factor.Biochemistry 1987；26：8099-8109，有修改)(SEQ.ID.No.2)：

SLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVALERCPCFHQGKEYAPGETVKIGCNTCVCQDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGECQYVLVQDYCGSNPGTFRILVGNKGCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEVNVKRPMKDETHFEVVESGRYIILLLGKALSVVWDRHLSISVVLKQTYQEKVCGLCGNFDGIQNNDLTSSNLQVEEDPVDFGNSWKVSSQCADTRKVPLDSSPATCHNNIMKQTMVDSSCRILTSDVFQDCNKLVDPEPYLDVCIYDTCSCESIGDCACFCDTIAAYAHVCAQHGKVVTWRTATLCPQSCEERNLRENGYECEWRYNSCAPACQVTCQHPEPLACPVQCVEGCHAHCPPGKILDELLQTCVDPEDCPVCEVAGRRFASGKKVTLNPSDPEHCQICHCDVVNLTCEACQEPGGLVVPPTDAPVSPTTLYVEDISEPPLHDFYCSRLLDLVFLLDGSSRLSEAEFEVLKAFVVDMMERLRISQKWVRVAVVEYHDGSHAYIGLKDRKRPSELRRIASQVKYAGSQVASTSEVLKYTLFQIFSKIDRPEASRITLLLMASQEPQRMSRNFVRYVQGLKKKKVIVIPVGIGPHANLKQIRLIEKQAPENKAFVLSSVDELEQQRDEIVSYLCDLAPEAPPPTLPPDMAQVTVGPGLLGVSTLGPKRNSMVLDVAFVLEGSDKIGEADFNRSKEFMEEVIQRMDVGQDSIHVTVLQYSYMVTVEYPFSEAQSKGDILQRVREIRYQGGNRTNTGLALRYLSDHSFLVSQGDREQAPNLVYMVTGNPASDEIKRLPGDIQVVPIGVGPNANVQELERIGWPNAPILIQDFETLPREAPDLVLQRCCSGEGLQIPTLSPAPDCSQPLDVILLLDGSSSFPASYFDEMKSFAKAFISKANIGPRLTQVSVLQYGSITTIDVPWNVVPEKAHLLSLVDVMQREGGPSQIGDALGFAVRYLTSEMHGARPGASKAVVILVTDVSVDSVDAAADAARSNRVTVFPIGIGDRYDAAQLRILAGPAGDSNVVKLQRIEDLPTMVTLGNSFLHKLCSGFVRICMDEDGNEKRPGDVWTLPDQCHTVTCQPDGQTLLKSHRVNCDRGLRPSCPNSQSPVKVEETCGCRWTCPCVCTGSSTRHIVTFDGQNFKLTGSCSYVLFQNKEQDLEVILHNGACSPGARQGCMKSIEVKHSALSVELHSDMEVTVNGRLVSVPYVGGNMEVNVYGAIMHEVRFNHLGHIFTFTPQNNEFQLQLSPKTFASKTYGLCGICDENGANDFMLRDGTVTTDWKTLVQEWTVQRPGQTCQPILE

通过用金黄色葡萄球菌V-8蛋白酶消化血浆来源的冯·维勒布兰德因子(pdVWF)来制备片段III。消化在37℃下在50mM Tris-HCl，150mM NaCl pH7.8缓冲液中以1∶40的酶与蛋白质重量比进行3小时。

使用强阴离子交换柱(MonoQ)进行片段的纯化。运行缓冲液是20mM Tris-HCl pH 7.4，而洗脱缓冲液(缓冲液B)是20mM Tris-HCl，500mM NaCl pH7.4。以约22mS/cm(约40％缓冲液B)将金黄色葡萄球菌V-8蛋白酶从阴离子交换柱洗脱，因此在洗脱片段之前需要在42％下的长时间洗涤步骤以洗出蛋白酶。或者，可以在Superose 6 10/300 GL上进行SEC步骤以除去蛋白酶。片段III的纯化和获得的产物描述于图1。Marti等1987所限定的序列已经通过MS分析确认。

片段I(III-T4，res.764-1035)的产生和纯化(根据Marti等1987，有修改)(SEQ.ID.No.3)：

SLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVALERCPCFHQGKEYAPGETVKIGCNTCVCQDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGECQYVLVQDYCGSNPGTFRILVGNKGCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEVNVKRPMKDETHFEVVESGRYIILLLGKALSVVWDRHLSISVVLKQTYQEKVCGLCGNFDGIQNNDLTSSNLQVEEDPVDFGNSWKVSSQCADTR

片段I由片段III(SPIII)通过胰蛋白酶(从牛处理得到的TPCK)消化制备。消化在100mM NH₄HCO₃pH 8.0缓冲液中以1∶100的酶与蛋白质重量比进行1.5小时。通过添加大豆胰蛋白酶抑制剂终止消化。

使用强阴离子交换柱(MonoQ)进行片段I的纯化，随后在Superose 6，10/300GL上进行SEC。阴离子交换柱的运行缓冲液是20mM Tris-HCl pH 7.4，而洗脱缓冲液(缓冲液B)是20mM Tris-HCl，500mM NaCl pH 7.4。SEC的运行缓冲液是PBS(phosphate buffered saline磷酸盐缓冲盐水)pH 7.0。

片段I纯化和获得的产物描述于图2。Marti等1987所限定的序列已经通过MS分析确认。

片段II(Fes.764-1673)的产生和纯化(SEQ.ID.No.4)：

SLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVALERCPCFHQGKEYAPGETVKIGCNTCVCQDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGECQYVLVQDYCGSNPGTFRILVGNKGCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEVNVKRPMKDETHFEVVESGRYIILLLGKALSVVWDRHLSISVVLKQTYQEKVCGLCGNFDGIQNNDLTSSNLQVEEDPVDFGNSWKVSSQCADTRKVPLDSSPATCHNNIMKQTMVDSSCRILTSDVFQDCNKLVDPEPYLDVCIYDTCSCESIGDCACFCDTIAAYAHVCAQHGKVVTWRTATLCPQSCEERNLRENGYECEWRYNSCAPACQVTCQHPEPLACPVQCVEGCHAHCPPGKILDELLQTCVDPEDCPVCEVAGRRFASGKKVTLNPSDPEHCQICHCDVVNLTCEACQEPGGLVVPPTDAPVSPTTLYVEDISEPPLHDFYCSRLLDLVFLLDGSSRLSEAEFEVLKAFVVDMMERLRISQKWVRVAVVEYHDGSHAYIGLKDRKRPSELRRIASQVKYAGSQVASTSEVLKYTLFQIFSKIDRPEASRITLLLMASQEPQRMSRNFVRYVQGLKKKKVIVIPVGIGPHANLKQIRLIEKQAPENKAFVLSSVDELEQQRDEIVSYLCDLAPEAPPPTLPPDMAQVTVGPGLLGVSTLGPKRNSMVLDVAFVLEGSDKIGEADFNRSKEFMEEVIQRMDVGQDSIHVTVLQYSYMVTVEYPFSEAQSKGDILQRVREIRYQGGNRTNTGLALRYLSDHSFLVSQGDREQAPNLVYMVTGNPASDEIKRLPGDIQVVPIGVGPNANVQELERIGWPNAPILIQDFETLPREAPDLVLQRCCSGE

片段II为通过第二次金黄色葡萄球菌V8蛋白酶消化从片段III制备。消化在50mM Tris-HCl，150mM NaCl pH 7.8缓冲液中以1∶10的酶与蛋白质重量比进行21小时。

使用强阴离子交换柱(MonoQ)进行片段II的纯化。运行缓冲液是20mM Tris-HCl pH 7.4，而洗脱缓冲液(缓冲液B)是20mM Tris-HCl，500mM NaCl pH 7.4。需要在42％B下具有长时间洗涤步骤的第二MonoQ纯化以除去蛋白酶。

片段II纯化和获得的产物描述于图3。Glu¹⁶⁷³-Gly¹⁶⁷⁴之间的第二V8切割位点由Fretto等1986确定并通过MS分析确认。

实施例2

测定因子VIII结合亲和力。

根据McCormick等2004(有修改)，使用Biacore 2000仪器(GE Healthcare)进行分析。简言之，将rFVIII共价偶联至CM5传感器芯片，得到约200RU包被水平。随后将冯·维勒布兰德因子片段以及全长冯·维勒布兰德因子(full length Von Willebrand Factor，flvWF)注射到传感器芯片表面上。运行缓冲液是20mM HEPES，150mM NaCl，5m M CaCl₂，0.02％Tween 20。测定了flVWF以及片段II和III的解离亲和常数，片段I与因子VIII没有显著的结合，因此没有测定K_D。结合传感图和计算的K_D值示于图4中。flVWF以0.67nM的K_D结合于rFVIII，片段III以较低的亲和力结合(K_D为6.18nM)，片段II的亲和力进一步降低(K_D为154.60nM)。

实施例3

测定因子VIII与磷脂单层的结合以及由冯·维勒布兰德因子和冯·维勒布兰德因子衍生的片段的抑制。

根据Saenko等1999(有修改)，使用Biacore 2000仪器(GE Healthcare)进行分析。简言之，从DOPC(1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)和DOPS(1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-L_丝氨酸)制备磷脂-囊泡。根据MacDonal等1991使用挤出机制备单层囊泡并将其包被在HPA传感器芯片上。随后将目的化合物注射到PCPS表面上，并评价注射结束后120秒的结合水平。

阴性对照：冯·维勒布兰德因子和BSA不与PSPC表面结合(未示出)，相比之下，示出了rFVIII的高结合水平。这种结合可以用冯·维勒布兰德因子完全抑制，相反地，高BSA浓度的添加对结合没有作用(图5)。

为了评价，如果通过有限消化获得的片段能够类似于flVWF抑制PSPC结合，则将片段I、II和III注射到传感器芯片表面上。只有片段III能够抑制rFVIII和磷脂单层之间的相互作用(图6)。该效应是剂量依赖性的，相比于rFVIII，在2.5x过量的片段III下，几乎完全抑制(图7)。

实施例4

测定flVWF和片段III的胶原蛋白III结合亲和力。

根据Romjin等2003(有修改)，使用Biacore 2000仪器(GE Healthcare)进行分析。简言之，将人胃蛋白酶消化的III型胶原蛋白共价结合到CM5传感器芯片的表面。随后，将样品注射到传感器芯片表面上。运行缓冲液是10mM HEPES，150mM NaCl，3.4mM EDTA，0.005％Tween 20。flVWF以非常高的亲和力(0.75nM)结合到胶原蛋白III，而片段III的结合显著降低到17.02nM(图8)。

实施例5

测定flVWF和片段III的肝素结合亲和力。

根据Sarafanov等2001，使用Biacore T200仪器(GE Healthcare)进行分析。简言之，使用NHS-生物素试剂试剂盒将来自猪肠粘膜的肝素生物素化，并结合到SA传感器芯片的表面。将参比流动池用生物素包被。随后，将样品注射到传感器芯片表面上。运行缓冲液是150mM HEPES，150mM NaCI，5mM CaCl₂，0.05％Tween 20。flVWF以0.65nM的亲和力结合肝素，片段III的结合亲和力显著降低至2.43nM(图9)。

实施例6

测定FVIII或FVIII/VWF片段III复合物恢复以及A型血友病狗中的循环半衰期。

将单独的重组B结构域缺失的FVIII或其与5倍摩尔过量的VWF片段III的组合对两只A型血友病狗进行皮下注射，随后进行静脉内注射。狗1接受200IU/kg BW的单独FVIII，而狗2接受与VWF片段III复合的200IU/kg BW的FVIII。在每次皮下或静脉内药物施用后0.5、1、2、4、8、12、24、32、48、72和96小时收集血样。分析样品的全血凝血时间(WBCT)和在显色FVIII活性测定中的活性。与单独皮下施用FVIII相比，皮下施用与FVIII复合的VWF片段III导致需要超过正常狗凝血时间之增加1.4倍的时间(图10)。与单独施用FVIII相比，VWF片段III与FVIII的施用也导致狗血浆中的FVIII活性随时间的提高以及皮下施加和静脉内施加两者的近两倍的曲线下面积(AUC)值(图11)。

实施例7

测定重组片段III单体和二聚体的FVIII结合亲和力。

将具有C端Strep标签的重组片段III在的HEK293细胞系中瞬时表达，并通过Strep-tactin亲和色谱法纯化。通过尺寸排阻色谱法(size exclusion chromatography，SEC)分离片段III单体和二聚体。使用Biacore 2000仪器进行分析。将片段III单体和二聚体固定在CM5上，并将FVIII浓度系列注射到传感器芯片表面上。使用血浆来源的全长VWF作为对照。运行缓冲液为150mM HEPES，150mM NaCl，5mM CaCl₂，0.05％Tween 20。FVIII结合于片段III二聚体，其亲和常数为1.9nM。FVIII对单体片段III的亲和力显著更低(K_D＝14.3nM)(图12)。

实施例8

通过VWF片段III在溶液中稳定rFVIII。

将2000IU重组FVIII在2.5ml水中重构，添加或不添加5倍摩尔过量的VWF片段III。将这两种制剂在40℃下孵育，并在48、96、192、384、408和672小时取等分试样。在显色FVIII活性测定中分析样品的FVHI活性。在40℃下VWF片段III有助于FVIII的显著更长的活性(图13)。

实施例9

比较重组片段III和NovoSeq21片段之间的肝素结合。

将具有C端Strep标签的重组片段III和NovoSeq21(来自WO2013/160005A1的SEQ ID No 21)片段在HEK293细胞系中瞬时表达，并通过Strep-tactin亲和色谱法纯化。使用肝素亲和色谱法测试肝素结合。将这两个重组片段均结合于肝素柱(HiTrap Heparin HP 1ml，GE Healthcare)，并用0至500mM NaCl的线性盐梯度洗脱。将这两个片段一式三份地运行，参见图14。NovoSeq21片段的平均洗脱峰在15.57±0.04分钟，其对应于285.381mM NaCl，而片段III的平均洗脱峰在15.47±0.02分钟，其对应于282.051mM NaCl。这表明NovoSeq21片段更高的肝素亲和力。

分析方法

分析方法的描述

FVIII：C，基于Coatest的筛选方法

该方法基于两阶段原理，并使用微板技术进行。在第一阶段，通过其中FVIII：C充当辅因子的固有通路产生活化的因子X(Xa)。然后在第二阶段，通过在凝血酶抑制剂I-2581存在下(以防止凝血酶水解底物)使用合成的显色底物S-2222来测定因子Xa。用酸终止反应，并且在405nm光度测定VIII：C对试剂空白的活性，其与pNA(对硝基苯胺)的释放成比例。

所述方法符合欧洲药典中的要求。FVIII：C的单位以世界卫生组织(World Health Organization，WHO)建立的当前国际浓缩标准(International Concentrate Standard，IS)中定义的国际单位(international unit，IU)表示。常规使用含有1％BSA而不是严重血友病血浆以用于预稀释的缓冲液已得到验证。也参见文献参考(European Pharmacopoeia Supplement 2000，general Methods，2.7.4.Assay of Blood Coagulation FVIII；Rosén S(1984)Assay of FVIII：C with a Chromogenic Substrate.J，Haematol，Suppl 40，vol 33，139-145，1984；G，Oswaldsson U，Rosén S(1987)A simple and accurate micro plate assay for the determination of FVIII activity.Thrombosis Research 47；5-14，1987；Mire-Sluis AR，Gerrard T，Gaines das R，Padilla A和Thorpe R.Biological assays：Their Role in the development and quality Control of Recombinant Biological Medicinal Products.Biological，24，351-362(1996))。

根据Bradford法测定总蛋白

根据Bradford法的蛋白质测定是基于以下观察：当与蛋白质发生结合时，考马斯亮蓝G-250的酸性溶液的最大吸光度从465nm移至595nm。疏水性和离子相互作用两者均稳定染料的阴离子形式，从而引起可见的颜色变化。该测定是可用的，因为染料-白蛋白复合物溶液的消光系数在10倍浓度范围内是恒定的。其他信息也参见参考文献Bradford，MM.A rapid and sensitive method for the quantisation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.Analytical Biochemistry 72：248-254.1976。

根据氨基酸分析(amino acid analysis，AAA)测定总蛋白

在AAA之前，在110℃下通过6M HCl水解所有蛋白质，持续24小时。通过在磺化聚苯乙烯树脂上的阳离子交换色谱法分离氨基酸，并在洗脱液中持续检测。该检测基于柱后茚三酮衍生化(post-column ninhydrin derivatisation)，其使用双光度计以同时在440nm下测量脯氨酸和羟脯氨酸，并在570nm下测量所有其他氨基酸。氨基酸天冬酰胺和谷氨酰胺两者均在AAA期间被脱酰胺化，并分别被确定为天冬氨酸和谷氨酸。因此，天冬氨酸和谷氨酸的结果分别代表原始样品中天冬氨酸/天冬酰胺(Asx)和谷氨酸/谷氨酰胺(Glx)的总和。使用该方法，色氨酸不会产生明显的响应，因此，不通过AAA对其进行量化。半胱氨酸在水解期间被破坏并且不被量化。AAA在参考文献中进一步描述：Total protein AAA analytical method.Spackman，D.H.，Stein，W.H.，和Moore，S.(1958)Anal.Biochem.30：1190-1206。

纯度或比活性(FVIII：C/总蛋白)

采用从FVIII：C分析获得的值计算样品的纯度(或也称为比活性)，并将其与从总蛋白分析获得的值相除。

SDS-PAGE(分子量分布)

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)涉及基于其大小的蛋白质分离。该方法描述了在还原条件下运行的蛋白质的SDS-PAGE。通过在变性和还原条件下加热样品，蛋白质解折叠并由阴离子去污剂十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulphate，SDS)包被，从而获得与多肽链长度成比例的高净负电荷。当加载到聚丙烯酰胺凝胶基质上并置于电场中时，带负电荷的蛋白质分子向带正电的电极迁移，并通过分子筛效应，即通过它们的分子量分离。聚丙烯酰胺凝胶限制较大的分子以与较小分子一样的速度迁移。因为SDS变性多肽之间的荷质比几乎相同，所以蛋白质的最终分离几乎完全取决于多肽的相对分子量的差异。在均匀密度的凝胶中，蛋白质的相对迁移距离(R_f)与其质量的对数成反比。如果已知质量的蛋白质与未知物同时运行，则可以绘制Rf和质量之间的关系，并估计未知蛋白质的质量。通过电泳分离的蛋白质条带通过银染显色观察。通过判断标准品、参比(对照样品)和分析样品的外观来目测完成评价。

因子VIII抗原含量(FVIII：Ag)

用ELISA试剂盒(VIII：Ag，用于因子VIII的酶免疫测定试剂盒，Diagnostica Stago(法国))测量因子VIII抗原含量(FVIII：Ag)的量，如进一步描述的⁽¹⁸⁾，用Tris-NaCl缓冲液+1％牛血清白蛋白替换提供的试剂盒缓冲液，以用于样品稀释。

尺寸排阻色谱法(SEC)

使用在天然缓冲液条件(25mM HEPES，0.5M NaCl，0.3M精氨酸，50mM CaCl₂，0.02％聚山梨醇酯80，pH 7.5)下处理的尺寸排阻色谱(SEC-HPLC)分析柱(Superdex 200，10/300GL，GE Healthcare)测量单体、聚集体和片段。样品负载为尺寸排阻柱的约1％，且因子VIII：C浓度为约1000IU/ml。

针对因子VIII的Western印迹

使用FVIII Western印迹测量基于大小的因子VIII变性产物。在还原条件下通过十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)根据分子量分离在因子VIII制剂中的FVIII分子量分布蛋白质和肽。此后，将蛋白质从凝胶基质经电泳转移至硝酸纤维素膜，随后用封闭剂孵育。然后添加针对整个人因子VIII分子的市售多克隆绵羊抗体，随后添加第二酶标记的抗体作为探针。作为第三步，添加化学发光底物，当其与酶组合时产生作为副产物的光。使用冷却的电荷耦合器件相机捕获光输出作为实时图像。信号的强度与印迹膜上的抗原(FVIII)的丰度相关。

2D-PAGE

进行使用银染的2D电泳以研究因子VIII蛋白链的电泳带模式。使用pH 3至10的线性pH梯度以第一维运行进行等电聚焦。使用Tris-乙酸盐(3至8％)凝胶运行第二维SDS-PAGE。在第二维运行后，用银染对凝胶进行染色。

总蛋白(Bradford法)

根据Bradford法的蛋白质测定是基于以下观察：当与蛋白质发生结合时，考马斯亮蓝G-250的酸性溶液的最大吸光度从465nm移至595nm。疏水性和离子相互作用两者会稳定染料的阴离子形式，从而引起可见的颜色变化。该测定是可用的，因为染料-白蛋白复合物溶液的消光系数在10倍浓度范围内是恒定的。其他信息也参见参考文献Bradford，MM.A rapid and sensitive method for the quantisation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.Analytical Biochemistry 72：248-254.1976。

本文引用的所有参考文献均通过引用完全并入本文，其并入与本文的明确教导不矛盾。