专利名称：用于控制致病体的核酸序列和氨基酸序列的制作方法
用于控制致病体的核酸序列和氨基酸序列发明领域本发明涉及农牧业生物技术领域，特别是涉及抗病原体性蛋白质 (anti-pathogenic protein)在控制致病体(pathogenic agent)中的用途。当应用该抗病 原体性蛋白质(要么通过其在经遗传修饰的植物中的表达，要么通过生物制品)时，获得高 水平的对于由植物的致病体所产生的疾病的控制。现有技术已经从作物例如萝卜、洋葱、苜蓿、辣椒、马铃薯和大豆的叶、叶鞘、根、块茎、茎、 果实和花中分离出了植物抗病原体性蛋白质。已经在生物化学以及结构水平上研究了这 些抗病原体性蛋白质，因此知晓，它们是大约5KDa、由45至M个氨基酸组成、富含半胱氨 酸、高度碱性的小肽，并且它们带正电荷。植物抗病原体性蛋白质的家族在氨基酸组成方 面是不同的，因为只有稳定结构的八个半胱氨酸看起来是保守的。该特征反映了由不同的 植物抗病原体性蛋白质所展示出的多种多样的生物学活性(Broekaert等人，(199 Plant Physiol. 108 :1353-8)。根据前体蛋白质的结构，可以将植物抗病原体性蛋白质分为两组；在第一组中，前 体蛋白质由来自内质网的信号肽和成熟蛋白质结构域组成。该蛋白质进入分泌途径并且不 具有关于转录后加工的明显信号。在第二组中，抗病原体性蛋白质由长的前体形成，其除了 包含信号肽和成熟结构域以外，还包含大约33个氨基酸的C-末端前结构域。迄今为止，仅 在茄科物种中发现了此类抗病原体性蛋白质(Lay和Anderson000 Curr Protein Pept ki. 6 :85-101)。不是所有的植物抗病原体性蛋白质都具有相同的作用模式，有些展示出 有效的针对广泛多样的丝状真菌的体外活性，即使以μ M的浓度；其他则不抑制真菌生长， 但却抑制α-淀粉酶和合成过程的蛋白质的活性(Colilla等人，(1990) FEBS Lett. 270 191-194)。解释了大多数抗病原体性蛋白质的活性的模型为Siai-Matsuzaki-Huang模型， 其解释了肽与质膜相互作用，随后为由于该带正电荷的蛋白质在其与靶细胞表面的带负 电荷的磷脂发生相互作用后插入到细胞膜中而引起的脂质移位，这造成在质膜内形成多 聚体孔，这些多聚体孔构成电压依赖性离子渗透通道(Thomma等人.OO(^)Planta 216 193-202)。另一个模型基于这样的理论许多抗病原体性蛋白质不仅通过细胞质膜的渗透 化而且还通过细胞质靶标来发挥其作用，这些蛋白质一旦在靶细胞内就会影响脱氧核糖核 酸(DNA)、核糖核酸(RNA)和蛋白质的合成。这暗示，这些阳离子蛋白质引起细胞质膜渗透 化的能力可能并不是作用模式的主要原因，而只是寻找细胞内靶标的途径(Thomma等人， (2003)Curr Drug Targets Infect Disord· 3 :1_8)。迄今为止，已鉴定和表征了许多类型的抗微生物蛋白质，它们的可能的应用是 多种多样的，因为遗传工程通过细胞和分子工具而提供了针对植物中的疾病的抵抗策略 (Thomma 等人，Q003)Curr Drug Targets Infect Disord. 3 :1-8)。已显示，萝卜的抗病原体性蛋白质的组成型表达增加了烟草植物对于叶的病原真菌长柄链格孢(Alternaria longipes)的抗性(Terra等人，(1995) Plant Cell 7 :573-588)，这与在具有马铃薯早疫 病链格孢(Alternaria solani)的番茄中所出现的相同。此外，苜蓿的抗病原体性蛋白质 的组成型表达还在马铃薯的栽培中提供了高的对于在农艺学上具有重大重要性的真菌大 丽花轮枝孢(Verticillium dahliae)的抗性，即使在田间条件下(Gao等人，(2000)Nat. Biotechnol. 18 :1307-1310)。此外，对组成性地表达甘蓝(Brassica oleracea)和芸苔油菜(B. campestris) 这些物种的抗病原体性蛋白质基因的水稻植物进行修饰以置换不同位置处的氨基酸，并且 独个地引入到水稻植物中以寻找对于真菌灰色大角间座壳(Magnapothe grisea)和细菌 水稻黄单胞菌(Xanthomonas oryza e)(在亚热带和热带国家中具有重大重要性的疾病) 的抗性。这些抗病原体性蛋白质在这两种疾病中都赋予了有效的抗性，并且这些抗病原体 性蛋白质的基因的修饰导致转基因水稻中广谱抗性的增加(Kawata等人，^00 JARQ 37 71-76)。作为用于减少由于病原真菌的攻击而引起的收成损失的备选方案而施用植物抗 病原体性蛋白质，相对于使用化学杀真菌剂而言具有优点。第一植物抗病原体性蛋白质来 自种子、根和块茎，因此是对于宿主植物以及对于消费这些植物的产品的人来说都没有毒 性的天然产物。第二 像任何其他蛋白质一样，作为天然产物的抗病原体性蛋白质迅速地降 解，从而在其功效消逝后不留下任何残留(Thomma等人，(2003)Curr Drug Targets Infect Disord. 3 1-8)。还可以将植物抗病原体性蛋白质用于开发抗真菌药物，因为真核病原体的控制一 直是医学中的主要问题之一，其在最近几十年中因为由于疾病例如AIDS、癌症和器官移植 而引起的免疫抑制患者增多，以及因为多抗药性菌株的出现及丝状真菌和酵母(其被认为 是机会病原体)的新物种的出现而增加(Thomma等人，^00 Curr Drug Targets Infect Disord. 3 1-8)。由于哺乳动物细胞和病原体细胞之间的相似性，抗真菌化合物应当瞄准在哺乳 动物细胞中不存在或很少存在的分子，例如细胞壁的组分和毒力因子，并且它们还应当是 尽可能天然的、具有广谱作用的、易于生产的且不诱导抗性的产物(Walsh等人.Q000) Medical Mycology，38 :335-347)。此外，真菌细胞膜是用于开发这些试剂的有吸引力的 靶标，因为真菌膜的组分例如鞘脂在哺乳动物细胞中在结构上是不同的。植物抗病原体性 蛋白质并不以鞘脂的生物合成作为靶标，而是完全相反地起作用，因为其靶标是自身鞘脂， 从而通过其作用于自身鞘脂而引起真菌膜的渗透化。这提供了高的选择性，并从而提供了 对于治疗真菌感染而言令人感兴趣的视角。已发现了一些植物抗病原体性蛋白质，例如 Dm-AMPl、Hs-AFPl禾口 Rs-AFP2，它们在μ M浓度下对于白色假丝酵母(Candida albicans) (其是在人中具有重大临床关注度的病原体)是有活性的，这是该类型的植物蛋白质用于 疗法开发的潜力的一个实例(Thomma 等人.Q003)Curr Drug Targets Infect Disord. 3 1-8)。一个待解决的重要问题是获得能够有效地控制广泛范围的病原真菌和病原细菌 的具有蛋白质特征的抗病原体性产物，这是在农业和医学中非常重要的方面。发明详述
本发明通过提供分离自大管烟草(Nicotiana megalosiphon)的新的抗病原体性 蛋白质的编码核苷酸序列(SEQ ID No. 1的核酸)以及氨基酸序列(SEQ ID No. 6)而促成 了解决上面提及的问题。本发明的核苷酸序列编码小的富含半胱氨酸的蛋白质，其对于各 种致病体具有显著的效应。本发明的目标还为编码多肽的核酸，所述多肽包含a)标识为SEQ ID No. 6的氨基 酸序列，或b)这样的氨基酸序列，其中在标识为SEQ ID No. 6的氨基酸序列之中删除、置换 和添加一个或几个氨基酸残基，并且其保持其控制由致病体引起的感染的特性。在本发明的一个实施方案中，将编码本发明的抗病原体性蛋白质的基因用于改善 植物针对各种致病体的抗性和防御水平。因此，本发明包括通过用包含SEQ ID No. 1的核酸 序列的核酸序列对植物进行遗传转化来提高针对由致病体产生的植物疾病的抗性的方法， 所述遗传转化导致包含SEQ ID No. 6的抗病原体性蛋白质的组成型表达或诱导型表达。作为本发明的目标的核酸分子可以用于植物转化。在一个优选的实施方案中， 编码抗病原体性蛋白质的DNA序列可以用于下列植物物种的转化玉蜀黍(Zea mays)、 芸苔属物种(Brassica sp·)、紫苜猜(Medicago sativa)、水稻(Oryza sativa)、两色高 梁(Sorghum bicolor)、高梁(Sorghum vulgare)、珍珠粟(Pennisetum glaucum)、向日 葵(Helianthus annuus)、普通小麦(Triticum arstivum)、大豆(Glycine max)、普通 烟草(Nicotiana tabacum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、甘薯(Ipomoea batatas)、 木薯(Manihot esculenta)、咖啡属物种(Coffea spp.)、椰子(Cocos nucifera)、菠萝 (Ananas comosus)、柑桔属物禾中(Citrus spp·)、可可(Theobroma cacao)、茶(Camellia sinensis)、色蕉属物种(Musa spp.)、鱼萼梨(Persea americana)、无花果(Ficus casica)、(Psidium guajava) 、 芒果 (Mangifera indica) 、番木瓜(Carica papaya) 、 甜菜(Beta vulgaris)、甘蔗属物种(Saccharum spp. )、番茄(Lycopersicon esculentum)(Lactuca sativa)、黄瓜 (Phaseolus vulgaris) 、 (Cucumis sativus)、甜瓜 (Cucumis melo)、Hi (Hibiscus rosasanensis) ,朱槿 (Rosa spp.)、郁金香属物种(Tulipa spp.)、火炬松(Pinus taeda)、、湿地松(Pinus elliotii)、西黄松(Pinus ponderosa)、小干 松(Pinus contorta)、$§身寸 公(Pinus radiata)。可以在使得能够获得表达抗病原体性蛋白质的在农业上重要的植物的各种方法 中使用本发明。如此，可以将编码抗病原体性蛋白质的核酸序列(SEQ ID No. 1)与引入到 在农业上重要的植物中的启动子相组合地使用。可以使用表达高水平的抗病原体性蛋白质 和产生升高水平的抗病原体性蛋白质表达的组成型启动子。在其他形式中，可以对编码抗 病原体性蛋白质的序列进行操作，并使之与组织特异性启动子相融合以指导在特别是对病 原体易感的植物的组织中的表达。本发明的另一个目标是包含标识为SEQ ID No. 6或SEQ ID No. 7的氨基酸序列的 多肽。这些多肽中的任一种具有针对致病体的生物学活性，因此在本发明中称为抗病原体 性蛋白质。本发明的另一个目标是在其多肽链中包含与SEQ. ID No. 6具有至少60%同源性 的氨基酸序列的多肽。在一个优选的实施方案中，本发明的抗病原体性多肽或蛋白质通过重组方法或化 学合成获得。本发明的抗病原体性蛋白质可以通过重组DNA技术而在不同的宿主系统中 表达，并从它们中分离。在本发明的一个实施方案中，所述抗病原体性蛋白质可以在酵母中表达。在一个优选的实施方案中，通过重组DNA方法的表达在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中，优选地在培养物上清液中进行。通过应用蛋白质分离技术，可以从宿主中获 得本发明的多肽。可以通过使用免疫酶技术、色谱技术、细胞沉淀洗涤技术和现有技术中熟 知的其他技术来实现纯化过程。氨基酸序列的变体也是本发明的目标，所述变体由于序列SEQ ID No. 6与稳定化 肽或者指导在宿主的确定区室中的表达的肽相融合而产生，并且保持对于该分子所证实的 生物学活性。它们的一个实例是其序列呈现为SEQ ID No. 7的融合蛋白。保持了对于致病 体的控制活性的所述抗病原体性蛋白质的片段也是本发明的目标，例如在序列列表中标识 为SEQ ID No. 8和SEQ ID No. 9的那些片段。本发明的另一个方面是用于控制致病体的生物制品，其包含标识为SEQ ID No. 6、 SEQ ID No. 7的多肽，或者与SEQ. ID No. 6具有至少60%同源性的多肽。在本发明的情形 下，将来源于活生物体的产品称为生物制品。在本发明中，首次在生物制品中使用这些抗病原体性蛋白质，所述生物制品赋予 针对由致病体产生的主要疾病的高水平的保护，其中具有高稳定性和低污染率，因此，它的 使用具有更好的公众认识和更少的规章要求。包含本发明的抗病原体性蛋白质的生物制品 产生高水平的针对真菌和细菌的保护，这是以前未报道过的。为了获得该生物制品，所述抗 病原体性蛋白质可以通过悬浮液、溶液、乳剂、粉剂、颗粒剂、乳油、气雾剂、浸渍型颗粒、辅 助剂、糊剂，或者通过包囊来进行配制。在本发明的一个实施方案中，所述生物制品包含从 经遗传转化的宿主中纯化的多肽，或者以包含在所述宿主的培养物上清液中的形式直接使 用。在一个优选的实施方案中，所述宿主是巴斯德毕赤酵母。在本发明的一个实施方案中，可以首次将其序列被要求保护的抗病原体性蛋白质 以及包含其的生物制品用于控制广泛多样的病原体，例如曲霉属(Aspergillus)；青霉属 (Penicillium)；链格孢属(Alternaria)(芸苔生链格孢(Alternaria brassicola)、马铃 薯早疫病链格孢(Alternaria solani)、链格孢(Alternaria alternata))；甘蔗平脐蠕孢 (Bipolaris sacchari)；灰葡萄抱(Botrytis cinerea)；尾抱属(Cercospora)(菊池尾抱 (Cercospora kikuchii)、玉蜀.1 (Cercospora zaea—maydis)、]lf— 包(Cercospora medicaginis)、大丑尾抱(Cercospora sojina)、高梁尾抱(Cercospora sorghi))；黄枝 孢(Cladosporium fulvun)；刺盘孢属(Colletotrichum)(豆刺盘孢(Colletotrichum lindemuthianum)、束状刺盘抱(Colletotrichum dematium)、禾生刺盘抱(Colletotrichum graminicola))；玉蜀黍壳色单隔孢(Diplodia maydis)；白粉菌属(Erysiphe)(禾草白 粉菌禾草小禾中(Erysiphe graminis f. sp. graminis)、禾草白粉菌大麦小禾中(Erysiphe graminis f. sp. hordei))；键抱属(Fusarium)(雪腐键抱(Fusarium nivale)、尖键 抱(Fusarium oxysporum)、禾谷键抱(Fusarium graminearum)、黄色键抱(Fusarium culmorum)、腐皮镰孢(Fusarium solani)、串珠镰孢(Fusarium moniliforme)、粉红镰孢 (Fusarium roseum))；长螺抱属(Helminthosporium)(大斑病长螺抱(Helminthosporium turcicum)、炭色长螺抱(Helminthosporium carbonum)、玉蜀黍长螺抱(Helminthosporium maydis)) ； M ^L ^！ 1 ] ji ^ (Maganaporthe grisea) ； ^·lif (Mycosphaerella f igensis) ； It β M (Peronospora)(东；!匕 It 霄(Peronospora manshurica)、烟草 If 霄 (Peronospora tabacina)) 5 " ;1 (Phoma betae) (Phytophthora) (1^ (Phytophthora cirmamomi)、恶疫霄(Phytophthora cactorum)、菜豆疫霄(Phytophthora phaseoli)、寄生疫 β (Phytophthora parasitica)、ttf 結 Ii 腐疫 β (Phytophthora citrophthora) > ^dfIiSβS^nft (Phytophthora megasperma f. sp. sojae) ^ ^(Phytophthora infestans))；柄绣菌属(Puccinia)(高梁柄绣菌(Puccinia sorghi)、 条形柄锈菌(Puccinia striiformis)、禾草柄锈菌小麦小禾中(Puccinia graminis f. sp. tritici)、天门冬属柄绣菌(Puccinia asparagi)、隐匿柄绣菌(Puccinia recondita)、 I^Vc^M^M (Puccinia arachidis) >HTjS^M(Puccinia melanocephala))；腐霉属 (Pythium) ()1 ^ (Pythium aphanidermatum)(Pythium ultimum)) MMM(Pyricularia oryzae)；丝核菌属(Rhizoctonia)(立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、 禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)) ；Scerotium rolfsii ；核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)；壳针孢属(Septoria)(番爺壳针孢(Septoria lycopersici)、大豆壳 针抱(Septoria glycines)、颖枯壳针抱(Septoria nodorum)、小麦壳针抱(Septoria tritici))；根串珠霉(Thielaviopsis basicola)；黑粉菌属(Ustilago)(玉蜀黍黑粉菌 (Ustilago maydis)、甘蔗鞭黑粉菌(Ustilago scitaminea))；轮枝孢属(Verticillium) (大丽花轮枝孢(Verticillium dahliae)、黑白轮枝孢(Verticillium alboatrum))； 丁香假单胞菌大豆致病变种(Pseudomonas syringae p. v. glycinea)；野油菜黄单胞 菌菜豆致病变种(Xanthomonas campestris p. v. phaseoli)；野油菜黄单胞菌苜蓿致 病变种(Xanthomonas campestris p. v. alfalfae)；野油菜黄单胞菌半透明致病变种 (Xanthomonas campestris p. v. translucens) ；丁香假单胞菌丁香致病变禾中(Pseudomonas syringae p. v. syringae)；古月胃卜软腐欧文1 古月胃卜禾中(Erwinia carotovorum p. v. carotovora)；斯氏欧文氏菌(Erwinia stewartii)；密执安棍状杆菌内布拉斯加 亚禾中(Clavibacter michiganense subsp. Nebraskense) ； ^ ^ j[x Ifi lif (Pseudomonas avenae)；菊欧文氏菌玉米致病变种(Erwinia chrysanthemi p. v. zea)；胡萝卜软腐欧文氏 菌(Erwinia carotovora)；野油菜黄单胞菌栖绒毛草致病变种(Xanthomonas campestris p. v. holcicola)；须芒草假单胞菌(Pseudomonas andropogonis)和燕麦假单胞菌。在一个 优选的实施方案中，该生物制品对于控制致植物病性真菌是有用的。在本发明的一个实施 方案中，在生物制品中所包含的多肽在1至9μ g/ml的浓度范围中。用于控制植物致病体的方法也是本发明的一部分，其特征在于，向植物施用包含 标识为SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 7的多肽或者与SEQ ID No. 6具有至少60%同源性的多 肽的生物制品。在本发明的另一个实施方案中，用于控制植物致病体的方法的特征在于，与生物 杀虫剂相联合地施用本发明的生物制品。植物(转基因植物)也构成了本发明的一部分，所述植物用SEQ ID No. 1的核酸 序列或包含SEQ ID No. 1的核酸序列进行遗传修饰以提高其针对由致病体产生的植物疾病 的抗性。附图简述
图1.将目的抗病原体性蛋白质克隆到在植物中(图1A)和在酵母中(图1B)的 表达载体之中的策略。图2.通过载体PPIC9K，在巴斯德毕赤酵母中表达抗病原体性蛋白质，其与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的α因子的信号肽相融合。在巴斯德毕赤酵母的上清液 中(A)和在由纯化而得到的级分中(B)抗病原体性蛋白质的产生。图3.抗病原体性蛋白质在转基因植物中的组成型表达以及评价针对疾病的抗 性的实验。该图显示了在对照样品中和在表达抗病原体性蛋白质的转基因克隆中具有疾 病症状的叶和茎的百分比。(图3Α)天仙子霜霉烟草小种(Peronospora hyoscyami f. sp tabacina)对于烟草的叶的影响。(图3B)马铃薯早疫病链格孢对于马铃薯的叶的影响。 (图3C)寄生疫霉对于烟草的茎的影响。(图3D)致病疫霉对于马铃薯的叶的影响。在所述 图中，柱表示a.经接种的对照；b.未接种的对照；c.克隆1. 1 ；d.克隆1. 2 ；e.克隆1. 3。图4.在不同浓度下，抗病原体性蛋白质针对各种植物病原体的活性的实验。该图 显示了在液体培养基中病原体生长的抑制百分比，所述病原体用不同浓度的抗病原体性蛋 白质进行处理，所述抗病原体性蛋白质与α因子的信号肽相融合(A)和以没有信号肽的形 式合成(B)。图4Β的图例□与α因子的信号肽相融合的蛋白质对于致病疫霉的效应， 没有信号肽的蛋白质对于致病疫霉的效应，■对照。图5.抗病原体性蛋白质NmDef-02的制剂对于土壤真菌㈧和空气真菌⑶的控 制效应的实验。在所述图中，柱表示■对照植物，□用杀真菌剂处理的植物， 用抗病原体 性蛋白质的制剂处理的植物。图6.抗病原体性蛋白质NmDef-02的片段对于致病疫霉的生物学活性。□肽SEQ ID No 8对于致病疫霉的效应， 肽SEQ ID No 9对于致病疫霉的效应。实施例实施例1.植物材料的制备，编码大管烟草的抗病原体性蛋白质NmDef-02的DNA 的分离和克隆。使大管烟草这一物种在按比例G 1)包含黑泥炭和稻壳的6英寸盆中生长，并 且于23°C在栽培室中进行维持。将采集自哈瓦那(Havana)烟草田的天仙子霜霉烟草小种 的分离株用于接种。为此，通过放置具有5X103个孢子/ml (用血细胞计数器测定的)的 数滴10μ 1的液滴，在6周龄的该物种的植物中进行接种。在12小时的时间段期间，将植 物放置在具有高湿度(在袋内通过使水雾化来获得该湿度)的黑色塑料袋中以促进感染。6天后，使用经由离心的总RNA提取系统(!Iomega，Madison, WI, USA)，从经接种 的大管烟草植物的叶中提取总RNA。最后，使用!Iomega公司的cDNA合成系统来合成双链 互补 DNA (cDNA)。使用选择性的用聚合酶链反应(PCR)的递减杂交系统(Clontech Jalo Alto,AC, USA)，通过递减杂交来构建cDNA文库。将从用天仙子霜霉接种并在接种后6天收获的大管 烟草植物中获得的cDNA用作用于所述递减的样品。根据制造商的说明书，将该经递减的文 库克隆到载体pGEM-T Easy (Promega)中。使用自动测序仪进行cDNA的测序。在序列分析后，选择出与数据库中所报道的蛋 白质具有低水平的同源性的DNA序列，将其用于后面的实验。实施例2.用抗病原体性蛋白质NmDef-02的基因来转化植物。烟草转基因植物的产生二元载体的构建。在该试验中，用寡核苷酸SEQ ID No. 2和SEQ ID No. 3分离出编码抗病原体性蛋白质的基因的完整cDNA，并且在限制位点Hind ΙΙΙ/Pst I处克隆到转化载体pCambia 2300 中(图 1A)。为此，通过 Zambryski 等人，(1983) EMBO Journal，2 :2143-2150 的方法来进 行普通烟草植物的遗传转化。为此，通过液氮法(Hofgen和Willmitzer (198 Nucl. Acids Res. 16 9877)用所形成的二元质粒转化根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的 菌株AT 2沈0。转化体外培养的变种Petit Havana SR 1的普通烟草植物的叶盘。使用卡那 霉素(100mg/L)作为转化事件的选择标记。将叶盘与土壤杆菌的重组菌在液体Murashige 和Skoog(MS)培养基中共培养48小时。烟草幼苗的再生周)在包含25g/L蔗糖、Img/ L 6-苄氨基嘌呤(BAP)、0. lmg/L萘乙酸(NAA)、100mg/L卡那霉素和500mg/L凯福隆(Claf) 的MS培养基中进行。幼苗的生根(1-3周)在包含30g/L蔗糖、100mg/L卡那霉素和500mg/ L Claf的MS培养基中进行。马铃薯转基因植物的产生二元载体的构建。在该试验中，用寡核苷酸SEQ ID No. 2和SEQ ID No. 3分离出编码抗病原体性蛋白 质的基因的完整cDNA，并且在限制位点Hind ΙΙΙ/Pst I处克隆到转化载体pCambia 3300 中(图1A)。在组织培养和转化实验中使用的植物材料取自马铃薯栽培种“D6sir6e”的体外 胚芽。在试管中，使植物在MS培养基中进行生长。将培养基的pH调至5.7。使用培养4周 的植物，并在具有25°C和2000LUX照明的室中进行维持。用作用于再生和转化实验的基础 的培养基为 SC (MS 盐、0. %ig/L 维生素 Bl、100mg/L 肌醇、20g/L 蔗糖、3. 5mg/L BAP、0. Olmg/ LNAA、6g/L植物琼脂化1^切38310)，38(1^盐、10011^/1肌醇、2(^/1蔗糖、3. 5mg/L AG3、6g/L 植物琼脂)，和PP (MS盐、0. 4mg/L维生素Bi、100mg/L肌醇、2mg/L泛酸钙、30g/L蔗糖、6g/L 植物琼脂、5g/L活性炭和lmg/L硝酸硫代硫酸银钠(STS))。对于转化，使用土壤杆菌的菌株At2260和LBA 4404。于在黑暗条件下，将细 菌在具有lg/L酵母提取物、lg/L细菌用蛋白胨、5g/L蔗糖和5g/L粉末状Lab-Iemco的培 养基中进行培养，直至达到0. 7-0. 9的光密度(OD) 62(|。以下述方式，以两个阶段来进行转化-再生程序将培养4周的体外植物的茎的节 段在黑暗中于25°C在MS培养基中温育12-16小时，然后，通过将外植体与ImL细菌悬浮液 (每20ml MS)温育7分钟来进行用根瘤土壤杆菌的感染，在黑暗中于22°C在SC培养基中 共培养48小时，并且将外植体放置在无菌滤纸上。小心地在MS培养基中洗涤外植体，并用 无菌滤纸进行干燥。在第一个阶段中，将它们在光照条件下在选择性培养基SC、500mg/L凯 福隆和5mg/L草铵膦(PPT)中培养15天；和在第二个阶段中，将它们在光照条件下在选择 性培养基SB、500mg/L凯福隆和5mg/L PPT中进行培养。最后，将幼苗在具有500mg/L凯福 隆的选择性培养基PP上进行个体化，并在5mg/LPPT中进行选择。实施例3.抗病原体性蛋白质NmDef-02对于针对疾病的抗性的影响的评价。在烟草中对于天仙子霜霉烟草小种的抗性的试验。将对于抗生素卡那霉素具有抗性并且具有抗病原体性蛋白质基因的带根植物移 植到花盆中，以让其在温室中适应45天。在这一时间段后，通过放置具有5X IO3个孢子/ ml的数滴10 μ 1的液滴，用天仙子霜霉烟草小种接种一组6周龄的100个转基因克隆。在 12小时的时间段期间，将植物放置在黑色且潮湿的塑料袋中以促进感染。为此，通过在一周 后测量具有疾病症状的叶的百分比来进行易感性的评价(图3Α)。如在该图中可以看出的， 当我们在经接种的对照和所述不同克隆之间比较具有症状的叶的百分比时，达到了高水平的对于该病原体的抗性，这显示了用于控制该重要病原体的抗病原体性蛋白质的效用。在烟草中对于寄生疫霉的抗性的试验。将对于抗生素卡那霉素具有抗性并且具有抗病原体性蛋白质基因的带根植物移 植到花盆中，以让其在温室中适应45天。用寄生疫霉接种一组100个转基因克隆，并且在 一个月后评价具有疾病症状的茎的百分比。为了进行评价，使真菌寄生疫霉在包含浓度为 39g/L的马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)的培养皿中进行生长。在10天的时间段期间，将 该真菌在27°C的温度下进行温育。为了进行烟草植物的接种，在茎的基部处放置包含所述 真菌的PDA皿(直径1cm)，并且在的温度下以高湿度进行温育(图:3B)。如在该图中 可以看出的，表达抗病原体性蛋白质的克隆达到了以前从未见到的高水平的针对该土壤病 原体的抗性，所述土壤病原体在该作物的秧田期造成严重的损失。该结果表明，将该蛋白质 用于控制该真菌是可行的。
在马铃薯中对于致病疫霉的抗性的试验。该测试包括在受控的光照、温度和相对湿度条件下，在5周龄的转基因马铃薯植 物中接种真菌致病疫霉。用IO6个游动孢子/ml的悬浮液对表达抗病原体性蛋白质的100 个5周龄的克隆进行喷洒。将所述克隆在具有85-95%的相对湿度和23°C的温度的受控条 件下进行维持。在接种后一周，将具有症状的叶的百分比用作对于该病原体的易感性的量 度(图3C)。这是出人意料的结果，因为该病原体是极其难以控制的。如在该图中可见的， 与所使用的对照相比较，表达抗病原体性蛋白质的克隆显示出高水平的抗性。该结果表明 了该蛋白质用于控制该病原体的可能性，特别是就其在世界范围内的重要性而言。在马铃薯中对于马铃薯早疫病链格孢的抗性的试验。在受控的光照、温度和相对湿度条件下，在5周龄的100株转基因马铃薯植物中接 种真菌马铃薯早疫病链格孢。用IO6个孢子/ml的悬浮液对所述克隆进行喷洒。将所述克 隆在具有85-95%的相对湿度和20°C的温度的受控条件下进行维持。将接种后一周，将具 有症状的叶的百分比用作对于该病原体的易感性的量度(图3D)。所分析的三个克隆显示 出高水平的对于该病原体的抗性，这首次为将该蛋白质用于控制该病原体赋予了可能性。实施例4.用于在巴斯德毕赤酵母培养物上清液中以细胞外形式表达抗病原体性 蛋白质NmDef-02的载体的构建。使用相应于SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5的特异寡核苷酸来分离编码大管烟草的 抗病原体性蛋白质的基因，以获得编码抗病原体性蛋白质NmDef-02的基因的完整序列，其 中具有对于将其克隆到表达载体PPICQk中来说必需的限制性内切酶酶切位点Bio I/EcoR I。该克隆策略在氨基末端向目的蛋白添加了酿酒酵母的α因子的信号肽(图IB)，因此， 所得的蛋白质相应于SEQ ID No. 7。用Bgl II使该质粒线性化，然后转化巴斯德毕赤酵母 菌株GS115。为此，通过电穿孔来进行转化。菌株GS115是his3营养缺陷型突变体，其在转 化后获得His+表型。在具有葡萄糖的基本培养基中选择His+转化体，在具有甘油的基本培 养基中培养所述克隆，并且在下用甲醇诱导126小时。通过斑点印迹(Dot Blot)来鉴定转化体克隆。通过使用Southern印迹技术来确 定，在哪些中通过由重组质粒的表达盒替代巴斯德毕赤酵母的AOXl基因而发生了整合，这 相应于表型Muts (低的甲醇使用)和His+。巴斯德毕赤酵母分泌低水平的自身蛋白质并且 其培养基不需要蛋白质的补充，因此可以预期，分泌到细胞外介质中的异源蛋白质是培养物上清液中全体蛋白质的多数部分(大于80%) (Tschopp等人，(1987)Bio/Technology 5 1305-1308)。为此，在5升发酵罐中通过向培养基添加甲醇来进行抗病原体性蛋白质在巴 斯德毕赤酵母中的表达。该重组抗病原体性蛋白质的表达和其完整性通过质谱法来进行检查。实施例5.抗病原体性蛋白质的纯化和生物学活性试验。通过在pH 4. 5的25mM乙酸钠中进行透析，而从培养物上清液中纯化与α因子 的信号肽相融合的抗病原体性蛋白质(NmDef-Plus)；使透析产物通过用25mM乙酸钠(pH 4.5)平衡的阳离子交换树脂CM-kpharose Fast-flow ；并且用IM氯化钠，50mM Tris (pH 7. 6)洗脱下所述蛋白质。收集包含该蛋白质的级分，并且通过使用具有孔径大小(截止值) 为3kDa的膜的超速离心系统来进行浓缩。为了进行检测，使用254nm的波长。通过在15% 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶(Tris-Glycine)上的电泳来检查纯化，并 且通过银染色来使所述蛋白质可视化(图2)。通过分光光度法来定量该抗病原体性蛋白质的抗真菌活性，和通过光学显微 术借助于乳酚蓝染色来进行菌丝体的分析(Terras等人，(1992) J. Biol. Chem. 267 14301-15309)。为此，在96-孔平板中进行评价，在所述孔中添加有50 μ L马铃薯-葡萄糖 液体培养基、50 μ L病原真菌的孢子的悬浮液和20 μ L经部分纯化的抗病原体性蛋白质。根据先前的报道(Terras等人，(1992) J. Biol. Chem. 267 :14301-15309)，通 过下面的公式来测定病原体的生长抑制百分比(PIC ;porcentaje de inhibicion del crecimiento)
权利要求
1.包含SEQID No. 1的核酸序列的核酸。
2.编码多肽的核酸，所述多肽包含a)标识为SEQID No. 6的氨基酸序列，或b)这样的 氨基酸序列，其中在标识为SEQ ID No. 6的氨基酸序列之中删除、置换和添加一个或几个氨 基酸残基，并且其保持其控制由致病体引起的感染的特性。
3.通过用包含SEQID No. 1的核酸序列的核酸序列对植物进行遗传转化来提高针对由 致病体产生的植物疾病的抗性的方法，所述遗传转化导致包含SEQ ID No. 6的抗病原体性 蛋白质的组成型表达或诱导型表达。
4.包含标识为SEQID No. 6或SEQ ID No. 7的氨基酸序列的多肽。
5.在其多肽链中包含与SEQ.ID No. 6具有至少60%同源性的氨基酸序列的多肽。
6.根据权利要求4和5的多肽，其通过重组方法或化学合成获得。
7.根据权利要求6的多肽，其中通过重组DNA方法的表达在巴斯德毕赤酵母中，优选地 在培养物上清液中进行。
8.用于控制致病体的生物制品，其包含标识为SEQID No. 6、SEQ ID No. 7的多肽，或 者与SEQ. ID No. 6具有至少60%同源性的多肽。
9.根据权利要求8的生物制品，其中所述多肽从经遗传转化的宿主中纯化，或者以包 含在所述宿主的培养物上清液中的形式直接使用。
10.根据权利要求9的生物制品，其中所述宿主是巴斯德毕赤酵母。
11.根据权利要求8的生物制品，其中所述致病体是致植物病性真菌。
12.根据权利要求8的生物制品，其中所述多肽在1至9μg/ml的浓度范围内。
13.用于控制致病体的生物制品，其包含标识为SEQID No. 6或SEQ ID No. 7的多肽的 片段。
14.用于控制植物的致病体的方法，其特征在于，向所述植物施用权利要求8的生物制品
15.用于控制植物的致病体的方法，其特征在于，与生物杀虫剂相联合地施用权利要求 8的生物制品。
16.植物，其用SEQID No. 1的核酸序列进行遗传修饰以提高其针对由致病体产生的植 物疾病的抗性。
全文摘要
本发明公开了源自大管烟草(Nicotiana megalosiphon)的核酸序列，其编码抗病原体性蛋白质。本发明考虑了该核酸分子在获得显示出病原体抗性的在农业上重要的转基因植物中的用途。本发明还包括用于控制植物的致病体的生物制品，其包含该抗病原体性蛋白质。
文档编号C12N15/82GK102046798SQ200980119164
公开日2011年5月4日 申请日期2009年3月27日 优先权日2008年3月28日
发明者诺德罗 C·G·博洛托, C·艾拉帕尔多, E·M·冈萨雷斯拉莫斯, G·A·恩里克斯奥夫雷贡, M·普霍尔费雷尔, O·博拉斯伊达尔戈, R·C·波铁列斯阿尔瓦克斯 申请人:遗传工程与生物技术中心