具有促凋亡活性的人IgG1衍生的抗体的制作方法

技术领域：
本发明提供了新的抗体和它们在治疗中的用途。
背景技术：
：由于抗体是血液中针对靶分子(抗原)具有高结合活性、结合特异性和高稳定性的蛋白分子，已经尝试将其应用于针对各种人类疾病的诊断剂、预防剂和治疗剂。虽然通常通过向非人动物施用抗原(免疫)来产生抗体，但是由非人动物获得的抗体具有该物种特定的氨基酸序列并且由于在人体内抗体被识别为外源物质而引起副作用。因此，已经采用基因重组技术由人之外的动物(非人动物)的抗体制备人嵌合抗体或人源化抗体。人嵌合抗体和人源化抗体已经解决了非人动物抗体例如小鼠抗体所具有的问题，如高免疫原性、低效应子功能和短的血液半衰期，并且使用它们将单克隆抗体应用于药物制剂成为可能。例如，美国已经批准并出售了许多作为用于癌症治疗的抗体的人源化抗体。在临床水平这些人嵌合抗体和人源化抗体实际上显示出了一定程度的效果，但是仍需要具有更高效果的治疗性抗体。例如，在单次施用抗CD20的人嵌合抗体利妥昔单抗(由IDEC/Roche/Genentech制造)的情况下，已经报道了在III期临床试验中，复发性、低恶性非霍奇金淋巴瘤患者对其响应率不超过48％(完全缓解6％、部分缓解42％)，并且其响应的平均持续时间为12个月。在单次施用抗HER2的人源化抗体赫赛汀(由Genentech制造)的情况下，已经报道了在III期临床试验中，转移性乳腺癌患者对其响应率仅为15％，并且其响应的平均持续时间为9.1个月。人抗体分子也称为免疫球蛋白(以下称为Ig)，并且根据其分子结构分成如下亚类：IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和IgM。除了铰链表现出广泛的变化，四种人IgG同种型(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)的H链恒定区的氨基酸序列彼此 高度同源。然而，这些同种型诱导不同强度的效应子活性。大体上，ADCC活性按以下顺序降低：IgG1>IgG3>IgG4＝IgG2，而CDC活性按以下顺序降低：IgG3≧IgG1>>IgG2≈IgG4。尽管人IgG1和人IgG3为具有优异的ADCC和CDC活性的亚类，但是已知人IgG3抗体在血液中具有比其他人IgG亚类更短的半衰期，从而在施用之后从血液中迅速消失。也已知与其他的人IgG亚类不同，人IgG3不具有蛋白A结合活性。在工业规模生产抗体时，使用蛋白A的纯化方法是主要的，而使用例如G蛋白的其他方法存在一些问题，如高的纯化成本。基于上述，可以说人IgG1抗体是作为抗体药物最合适的亚类，因为它比其他亚类有更高的ADCC和CDC活性，可以使用蛋白A纯化，表现出在血液中的长半衰期，并且从制造成本的角度具有优点。尽管如上所述在实践中人IgG1抗体已经用作药物，但是现有的抗体药物表现出的药效仍然不够。因此，需要具有改良效果的抗体药物。通过交换它的一部分已经将许多修饰引入人IgG1的氨基酸序列中。然而，通过自然界中不存在的氨基酸序列的替换制备的这样的抗体在人体内有被识别为外源物质的危险，从而引起如以上所讨论的类似于非人动物抗体的副作用。另一方面，通过在人亚类之间交换氨基酸序列而制备的抗体的氨基酸序列是人固有携带的氨基酸序列的组合。技术实现要素：现在，本发明人已令人惊讶地表明了嵌合抗体(c8B6)的CH1γ1中的特定突变恢复了其他IgG亚类典型的CH1和CL结构域之间的配对，或其由人CH1γ3替换使得恢复了亲本鼠IgG38B6抗体的促凋亡活性，所述特性是大部分IgG3抗体所固有的。因此，似乎人IgG1中因为CH1结构域中缺少半胱氨酸，铰链和CL结构域之间的非典型配对与对IgG1抗体观察到的较低的促凋亡活性相关。因此，本发明涉及提高1类人免疫球蛋白G(IgG1)抗体、其衍生物或功能片段的疗效的方法，该方法包括如下步骤：使来自所述抗体的人CH1γ1结构域突变，以便恢复在其他IgG亚类中典型的CH1和CL结构域之间的配对，或通过由来自人的非IgG1亚类的CH1结构域，如来自IgG2的CH1结构域(CH1γ2)、来自IgG3的CH1结构域(CH1γ3)或来自IgG4的CH1结构域(CH1γ4)替换所述人CH1γ1结构域。由本发明的方法获得的IgG1衍生的抗体呈现出IgG1固有特性和提高的促凋亡活性的组合，从而具有潜在疗效。本发明还涉及可以通过这样的方法获得的抗体或其功能片段，其中所述抗体包括：a)包括如下氨基酸序列的轻链：i)特异性针对抗原的轻链可变区(LCVR)；和ii)人κ恒定(CL)区；和b)包括如下氨基酸序列的重链：i)特异性针对所述抗原的重链可变区(HCVR)；和ii)来自人IgG1的CH2和CH3结构域；和iii)来自人IgG1的CH1结构域，所述CH1结构域被突变以便恢复在其他IgG亚类中典型的CH1和CL结构域之间的配对，或由来自人IgG2、IgG3或IgG4的CH1结构域替换。本发明还涉及包括至少一种这样的抗体和药学上可接受的载体的药物组合物。另外，本发明涉及用于治疗癌症的方法，该方法包括向有需要的患者提供这样的药物组合物，所述药物组合物包含至少一种所述抗体或其至少一种功能片段。最后，本发明涉及至少一种这样的抗体或其至少一种功能片段在制备用于治疗和/或预防癌症的药物中的用途。附图说明图1显示了c8B6抗体的轻链和重链序列。图2显示了301.14a抗体的CH1和铰链结构域的序列。图3显示了301.14b和311.14b抗体的CH1和铰链结构域的序列。图4显示了301.15和311.15抗体的CH1和铰链结构域的序列。图5显示了301.16抗体的CH1和铰链结构域的序列。图6显示了301.17抗体的CH1和铰链结构域的序列。图7显示了301.18抗体的CH1和铰链结构域的序列。图8显示了301.19抗体的CH1和铰链结构域的序列。图9显示了301.15b抗体的CH1和铰链结构域的序列。图10显示了301.20抗体的CH1和铰链结构域的序列。图11显示了301.21抗体的CH1和铰链结构域的序列。图12显示了通过碘化丙啶的抗OacGD2抗体的直接细胞毒性。图13显示了通过碘化丙啶的抗GD2抗体的直接细胞毒性。发明详述在第一个方面中，本发明涉及用于提高1类人免疫球蛋白G(IgG1)抗体，其衍生物或功能片段的疗效的方法，该方法包括如下步骤：使来自所述抗体的人CH1γ1结构域突变，以便恢复在其他IgG亚类中典型的CH1和CL结构域之间的配对，或通过由来自人IgG2的CH1结构域(CH1γ2)、IgG3的CH1结构域(CH1γ3)或IgG4的CH1结构域(CH1γ4)替换所述人CH1γ1结构域。提高疗效的所述方法包括提高所述抗体的促凋亡活性。抗体是对应于四聚体的免疫球蛋白分子，其包含四条多肽链，由二硫键相互连接的两条同样的重(H)链(全长约50-70kDa)和两条同样的轻(L)链(全长约25kDa)。轻链分类为κ和λ。对于IgG，重链分类为γ。每条重链由N-端重链可变区(在本文中缩写为HCVR)和重链恒定区组成。对于IgG，重链恒定区由三个结构域(CH1、CH2和CH3)和CH1和CH2结构域之间的铰链结构域组成。每条轻链由N-端轻链可变区(在本文中缩写为LCVR)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。HCVR和LCVR区可以进一步细分成高可变区，称为互补决定区(CDR)，夹杂着更保守的称为骨架区(FR)的区域。每个HCVR和LCVR由从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列的三个CDR和四个FR组成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。各结构域的氨基酸分配是依照公知惯例(IMGT,TheInternationalImmunogeneticsInformationLEFRANC等,NucleicAcidsResearch,vol.27,p:209-212,1999)。抗体结合特定抗原的功能性能力取决于每个轻/重链对的可变区，并且在主要由CDR决定。如本文所用，“1类人免疫球蛋白G(IgG1)抗体的衍生物”的表述指嵌合或人源化抗体。这样的衍生抗体，包括：i)来自人IgG1的轻链恒定区(CL)和重链恒定区(CH1、CH2和CH3)；和ii)来自非人IgG1的轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)或相应的CDR。如本文所用，术语“功能片段”指特异性结合O-乙酰化GD2神经节苷脂并包含CH1结构域的抗体片段。这样的片段可由本领域技术人员简单地识别并包括，例如Fab片段(例如，通过木瓜蛋白酶消化)、Fab'片段(例如，通过胃蛋白酶消化和部分还原)、F(ab')2片段(例如，通过胃蛋白酶消化)，Facb(例如，通过纤溶酶消化)以及Fd片段(例如，通过胃蛋白酶消化，部分还原和再聚集)包括于本发明中。这样的片段可通过如本领域中已知的和/或如本文所述的酶解、合成或重组技术来制备。也可使用已将一个或多个终止密码子导入天然终止位点上游的抗体基因制备各种截短形式的抗体。例如，编码F(ab')2重链部分的组合基因可设计为包括编码重链的 CH1结构域和/或铰链结构域的DNA序列。抗体的各个部分可通过常规技术化学连接在一起，或者可使用基因工程技术制备成连续的蛋白。在第一个优选的实施方式中，本发明的方法包括如下步骤：使来自所述抗体的CH1γ1结构域突变，以便恢复在其他IgG亚类中典型的CH1和CL结构域之间的配对。来自人IgG1的CH1结构域是本领域技术人员公知的。例如，来自人IgG1的CH1结构域对应于SEQidn°:21。如本文所用，“使人CH1γ1结构域突变，以便恢复在其他IgG亚类中典型的CH1和CL结构域之间的配对”的步骤指人CH1γ1结构域，其中氨基酸已被半胱氨酸残基替换，优选其中第133或134位的氨基酸是半胱氨酸，仍优选地其中第133位的氨基酸是半胱氨酸。恒定区的编号为Kabat等人(1991，NIHPublicationn°91-3242，NationaltechnicalInformationServiceSpringfield，VA)所述的EU索引的编号。作为第一个例子，这样的人CH1γ1结构域指氨基酸序列SEQidn°1，其中第133位上的丝氨酸残基被半胱氨酸替换。作为第二个例子，这样的人CH1γ1结构域指氨基酸序列SEQidn°22，其中第134位上的丝氨酸残基被半胱氨酸替换。CH1序列的第133或134位上的半胱氨酸残基恢复了本发明的抗体的轻链和重链之间的二硫键。有利地，使来自所述抗体的人CH1γ1结构域突变，以便恢复在其他IgG亚类中典型的CH1和CL之间的配对的步骤通过如下进行：a)分离包括1类人免疫球蛋白G(IgG1)抗体的CH1结构域的核酸序列，所述核酸序列优选编码抗体的重链；b)使密码子突变，优选使编码所述CH1结构域的第133或134位的密码子突变为编码氨基酸残基半胱氨酸(C)，以提供突变的核酸序列；c)为突变的核酸序列提供可操作的表达元件；d)在合适的宿主中共表达突变的核酸与编码抗体的轻链的核酸序列，从而提供突变的1类人免疫球蛋白G(IgG1)抗体、其衍生物或功能片段；和e)任选地，分离突变的抗体、其衍生物或片段。在第二个优选实施方式中，本发明的方法包括如下步骤：由来自人IgG2的CH1 结构域(CH1γ2)、IgG3的CH1结构域(CH1γ3)或IgG4的CH1结构域(CH1γ4)替换所述人CH1γ1结构域。来自人IgG2、IgG3和IgG4的CH1结构域是本领域技术人员公知的。例如，来自人IgG2的CH1结构域对应于SEQidn°23，来自人IgG3的CH1结构域对应于SEQidn°2，来自人IgG4的CH1结构域对应于SEQidn°24。有利地，由来自人IgG2的CH1结构域(CH1γ2)、人IgG3的CH1结构域(CH1γ3)或人IgG4的CH1结构域(CH1γ4)替换来自所述抗体的人CH1γ1结构域的步骤通过如下进行：a)分离包括1类人免疫球蛋白G(IgG1)抗体的CH1结构域的核酸序列，所述核酸序列优选编码所述抗体的重链；b)由编码来自人IgG2的CH1结构域(CH1γ2)、人IgG3的CH1结构域(CH1γ3)或人IgG4的CH1结构域(CH1γ4)的核酸序列替换所述CH1γ1核酸序列，以提供突变的核酸序列；c)为突变的核酸序列提供可操作的表达元件；d)在合适的宿主中共表达突变的核酸与编码抗体的轻链的核酸序列，从而提供突变的1类人免疫球蛋白G(IgG1)抗体、其衍生物或功能片段；和e)任选地，分离突变的抗体、其衍生物或片段。在仍然优选的实施方式中，本发明的方法还包括如下步骤：使来自所述抗体的人IgG1铰链结构域突变，以便恢复在其他IgG亚类中典型的铰链和CH2结构域之间的配对，或由来自人IgG2、IgG3、IgG4的铰链结构域或其衍生物替换所述人IgG1铰链结构域。来自人IgG1的铰链结构域是本领域技术人员公知的，并且对应于例如SEQidn°3。如本文所用，“使来自所述抗体的人铰链结构域突变，以便恢复在其他IgG亚类中典型的铰链和CH2结构域之间的配对”的步骤指人IgG1铰链结构域，其中铰链序列的第五位的半胱氨酸残基已被另一个残基替换，优选地被丝氨酸替换。事实上，所述突变使得恢复典型的IgG结构。作为这种衍生物的例子，可参考SEQidn°:4。有利地，使来自所述抗体的人铰链结构域突变，以便恢复在其他IgG亚类中典型的铰链和CH2之间的配对的步骤通过如下进行：a)分离包括1类人免疫球蛋白G(IgG1)抗体的铰链结构域的核酸序列，所述核酸序列优选编码抗体的重链；b)使编码所述铰链结构域的第5位的氨基酸残基半胱氨酸(C)的密码子突变为编码其他氨基酸残基，优选编码丝氨酸残基，以提供突变的核酸序列；c)为突变的核酸序列提供可操作的表达元件；d)在合适的宿主中共表达突变的核酸与编码抗体的轻链的核酸序列，从而提供突变的1类人免疫球蛋白G(IgG1)抗体、其衍生物或功能片段；和e)任选地，分离突变的抗体、其衍生物或片段。来自人IgG2、IgG3或IgG4的铰链结构域是本领域技术人员公知的，并且对于IgG3对应于例如SEQidn°5。人IgG3的衍生物也是本领域技术人员公知的，并且对应于例如SEQidn°6至9，优选SEQidn°9。仍然有利地，由来自人IgG2、IgG3、IgG4的铰链结构域或其衍生物替换来自所述抗体的人IgG1铰链结构域的步骤通过如下进行：a)分离包括1类人免疫球蛋白G(IgG1)抗体的铰链结构域的核酸序列，所述核酸序列优选编码抗体的重链；b)由编码来自人IgG2、IgG3、IgG4的铰链结构域或其衍生物的核酸序列替换所述IgG1铰链结构域核酸序列，以提供突变的核酸序列；c)为突变的核酸序列提供可操作的表达元件；d)在合适的宿主中共表达突变的核酸与编码抗体的轻链的核酸序列，从而提供突变的1类人免疫球蛋白G(IgG1)抗体、其衍生物或功能片段；和e)任选地，分离突变的抗体、其衍生物或片段。在第二个方面中，本发明涉及可通过本发明的方法获得的抗体或其功能片段，其中所述抗体包括：a)包括如下氨基酸序列的轻链：i)特异性针对抗原的轻链可变区(LCVR)；和ii)人κ恒定(CL)区；和b)包括如下氨基酸序列的重链：i)特异性针对所述抗原的重链可变区(HCVR)；和ii)来自人IgG1的CH2和CH3结构域，和iii)来自人IgG1的CH1结构域，所述CH1结构域被突变以便恢复在其他IgG亚类中典型的CH1和CL结构域之间的配对，或由来自人IgG2、IgG3或IgG4的CH1结构域替换。如本文中所使用，术语“抗体”指单克隆抗体本身。单克隆抗体可以是人抗体、嵌合抗体和/或人源化抗体。人κCL结构域是本领域技术人员公知的并且对应于例如SEQidno°10。来自人IgG1的CH2和CH3结构域是本领域技术人员公知的并且对应于例如SEQidno°11。重组产生本发明中有用的抗体，因为需要操纵具有适当特异性典型的鼠或其他非人抗体，以便将它们转换成人源化形式。抗体可以为糖基化的或非糖基化的，但是糖基化的抗体是优选的。如公知的，抗体通过二硫键适当交联。根据优选的实施方式，本发明的抗体是嵌合抗体。“嵌合抗体”的表述指由来自鼠免疫球蛋白的可变区和人免疫球蛋白的恒定区组成的抗体。这种改变简单地由用人恒定区替换鼠恒定区构成，从而产生这样的人/鼠嵌合体，其可能对于药物用途具有可接受的足够低的免疫原性。对于本发明，所述嵌合抗体包括来自人轻链和重链的恒定区。已经报道了许多用于制造这样的嵌合抗体的方法，由此形成本领域技术人员的常识的一部分(参见，例如美国专利号5,225,539)。根据另一个优选的实施方式，本发明的抗体是人源化抗体。“人源化抗体”指通过改变具有非人互补决定区(CDR)的抗体的序列而部分或全部由来源于人抗体种系的氨基酸序列组成的抗体。由现在本领域公知的技术进行该抗 体的可变区的人源化并最终制备CDR。例如，英国专利申请GB2188638A和美国专利号5,585,089公开了产生重组抗体的过程，其中被替换的抗体的唯一部分是互补决定区或“CDR”。CDR移植技术已用于产生由鼠CDR和人可变区骨架和恒定区组成的抗体(参见,例如Riechmann等，Nature,vol.332,p:323-327,1988)。这些抗体保留了Fc依赖性效应子功能所必需的人恒定区，但不太可能诱发针对抗体的免疫应答。例如，可变区的骨架区由相应的人骨架区替换，而保留基本上完整的非人CDR，或甚至用来源于人基因组的序列替换CDR。在免疫系统改变为相当于人的免疫系统的基因修饰小鼠中产生全人抗体。如上所述，对于在本发明的方法中使用，采用抗体的免疫特异性片段，包括表示单链形式的片段，是足够的。人源化抗体也指这样的抗体：其包含人骨架、至少一个来自非人抗体的CDR，并且其中存在的任何恒定区与人免疫球蛋白恒定区基本相同，即，至少约85或90％，优选至少95％相同。因此，人源化抗体的所有部分，可能除了CDR，都与一个或多个天然人免疫球蛋白序列的相应部分基本上相同。例如，人源化的免疫球蛋白通常不包括嵌合小鼠可变区/人恒定区抗体。人源化抗体相对于非人抗体和嵌合抗体对于人类治疗的用途具有至少三个潜在的优点：1)由于效应部分是人的，它可以与人免疫系统的其他部分更好地相互作用(例如，通过补体依赖性细胞毒性(CDC)或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)更有效地破坏靶细胞)。2)人免疫系统不会将人源化抗体的骨架区或C区识别为外源的，并且因此针对这种注射的抗体的抗体反应应该少于针对完全外源的非人抗体或部分外源的嵌合抗体。3)已经报道了在人体循环中注射的非人抗体的半衰期比人抗体的半衰期短得多。注射的人源化抗体的半衰期与天然存在的人抗体基本上相同，允许给予较小且较不频繁的剂量。例如，可如下进行人源化免疫球蛋白的设计：当氨基酸落入下列类别时，待使用的人免疫球蛋白(受体免疫球蛋白)的框架氨基酸由来自提供CDR的非人免疫球蛋白(供体免疫球蛋白)的框架氨基酸替换：(a)在该位置受体免疫球蛋白的人框架区的氨基酸对人免疫球蛋白是罕见的，而在该位置供体免疫球蛋白中相应的氨基酸对人免疫球蛋白是常见的；(b)该氨基酸的位置紧邻CDR之一；或(c)在三维免疫球蛋白模型中框架氨基酸的任何侧链原子在CDR氨基酸的任何原子的约5-6埃(中心至中心)之内(Queen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，vol.88，p:2869，1991)。当在此位置受体免疫球蛋白的人框架区中的氨基酸和供体免疫球蛋白中的相应氨基酸对于人免疫球蛋 白都是罕见的时候，这样的氨基酸被在该位置对于人免疫球蛋白常见的氨基酸替换。根据另一个优选的实施方式，所述抗体或其片段针对免疫调节抗原、感染性抗原或肿瘤抗原。本领域技术人员鉴于其一般常识可以简单地鉴别特异性针对这样的抗原的轻链和重链可变区(LCVR和HCVR)。如本文中所使用，“免疫调节抗原”指由激活的诱导免疫细胞如T和/或NK细胞表达的或由激活的抑制细胞表达的抗原。作为由激活的抑制细胞表达的抗原的例子，可参考在1987年(Brunet等，Nature，vol.328，p:267-270，1987)发现的CTL-A4(细胞毒性淋巴细胞相关抗原，还称为CD152)。作为由激活的诱导免疫细胞表达的抗原的例子，可参考BTLA(B和T淋巴细胞弱化子)，也称为CD272，在T细胞的激活过程中被诱导，并在Th1细胞而非Th2细胞上保持表达。如本文所用，“感染性抗原”指在由微生物如细菌或病毒感染的细胞中产生的抗原物质。如本文所使用的“肿瘤抗原”指在肿瘤细胞中产生的抗原物质。许多肿瘤抗原是本领域技术人员公知的，作为非限制性例子可参考CD20；CEA；EGFR；HER2；EPCAM；MUC1；PSMA；CD-19；GM1；CAIX；磷脂抗原，如磷脂酰丝氨酸；或神经节苷脂如GD2、GD2-O-乙酰化或GD3。优选地，所述抗原不对应于GD2-O-乙酰化。CD-20是在早期前B细胞发育期间表达的非糖基化的磷蛋白并保持直至浆细胞分化。具体地，CD20分子可以调节对于细胞周期启动和分化所需的激活过程中的步骤并且通常在瘤(“肿瘤”)B细胞上以非常高的水平表达。根据定义，CD20存在于“正常”B细胞以及“恶性”B细胞两者之上。因此，CD20表面抗原具有作为B细胞淋巴瘤的“靶向”候选物的潜能。关于抗CD20的抗体，为了从CD20获得它们相应的特定的轻链可变区和重链可变区(LCVR和HCVR)，可参考利妥昔单抗(rituximab)(美国专利号5,736,137)；钇-[90]-标记的2B8鼠抗体，其命名为“Y2B8”或“替伊莫单抗(IbritumomabTiuxetan)”(美国专利号5,736,137)；鼠IgG2a“BI”，也称为“托西莫单抗(Tositumonmab)”，任选地用131I标记，以产生“131I-BI”抗体(碘131托西莫抗体，)(美国专利号5,595,721)；和人源化的2H7；奥法木单抗(Ofatumumab)，抗CD20上的新表位的完全人源化的IgG1，hunMax-CD20(国际专利申请PCTWO2004/035607)。其中，利妥昔单抗、替伊莫单抗和托西莫单抗获准上市用于治疗特定 的淋巴瘤，奥法木单抗获准上市用于治疗特定的白血病。优选地，抗CD20的所述抗体是利妥昔单抗，并且重链可变区(HCVR；SEQidn°:25至31)和轻链可变区(LCVR；SEQidn°32至37)的对应于下面表中出现的序列。抗-CD20(利妥昔单抗)可变的重链：抗-CD20(利妥昔单抗)可变的轻链(k链):更优选地，利妥昔单抗的CH1和铰链序列对应于SEQidn°38CEA(癌胚抗原)糖蛋白是参与细胞粘着的肿瘤标记物。关于针对CEA的抗体，为了从CEA获得它们相应的特定的轻链可变区和重链可变区(LCVR和HCVR)，可参考阿西莫单抗(arcitumomab)(IMMUNOMEDICS)。ErbB受体在上皮细胞、间叶细胞和神经元来源的各种组织中表达。在正常情况下，ErbB受体的激活受它们配体的空间和时间表达控制，所述配体是生长因子EGF家族的成员。结合ErbB受体的配体诱导受体同源和异源二聚体的形成以及固有激酶结构 域的激活，使得胞质尾区内的特定酪氨酸激酶残基上磷酸化。这些磷酸化的残基作为各种蛋白的锚定位点，它们的募集使得细胞内信号通路的激活。在ErbB受体中，已知EGFR和HER2在调控细胞增殖和分化中起至关重要的作用。当细胞外生长因子结合时，它们有强烈的趋势与其他HER受体组装成同源和/或异源二聚体，这产生各种形式的信号转导途径的激活，使得细胞凋亡、存活或细胞增殖。关于抗Her2的抗体，为了从Her2获得其相应的特定的轻链可变区和重链可变区(LCVR和HCVR)，可参考人源化的单克隆抗体425，也称为马妥珠单抗(matuzumab)(hMAb425，美国专利号5,558,864、EP0531472)；嵌合单克隆抗体225(cMAb225)，也称为西妥昔单抗(cetuximab)(美国专利号7,060,808)和全人抗-EGFR抗体帕尼单抗(panitumumab)(美国专利号6,235,883)。其中，证实了西妥昔单抗和帕尼单抗在体内抑制结肠直肠肿瘤并且它们都已获准上市。关于抗Her2的抗体，为了从Her2获得其相应的特定的轻链可变区和重链可变区(LCVR和HCVR)，可参考重组人源化形式的单克隆抗体4D5(美国专利号5,677,171)，也称为huMAb4D5-8、rhuMAbHER2、曲妥珠单抗(trastuzumab)或(美国专利号5,821,337)。这种抗体在1998年获准上市用于治疗患有转移性乳腺癌的患者，所述患者的肿瘤过表达ErbB2蛋白。优选地，抗Her2的所述抗体是曲妥珠单抗，并且重链可变区(HCVR；SEQidn°:39至45)轻链可变区(CVR；SEQidn°46至51)分别对应于下面的表中出现的序列。抗-Her2(曲妥珠单抗)可变的重链：抗-Her2(曲妥珠单抗)可变的轻链(k链):更优选地，曲妥珠单抗的CH1和铰链序列对应于SEQidn°38GD2是在包括成神经细胞瘤和黑素瘤的神经外胚层来源的肿瘤上表达的双唾液酸神经节苷脂。关于针对GD2的抗体，为了从GD2获得其相应的特定的轻链可变区和重链可变区(LCVR和HCVR)，可参考已经用于治疗成神经细胞瘤的小鼠IgG3单克隆抗体3F8和14.18或嵌合单克隆抗-GD2抗体ch14.18(由小鼠抗GD2抗体14.18的可变区和人IgG1的恒定区构成)或对O-乙酰化形式的GD2具有特异性的小鼠IgG3单克隆抗体8B6(国际专利申请PCTWO2008/043777)。优选地，所述针对GD2的抗体是ch14.18，分别对应于下面的重链可变区的表(HCVR；SEQidn°:52至57)中出现的序列和下面的轻链可变区的表(CVR；SEQidn°58至63)中出现的序列。抗-GD2(ch14.18)可变的重链:抗-GD2(ch14.18)可变的轻链(k链):更优选地，ch14.18的CH1和铰链序列对应于SEQidn°38。如本文中所使用，“肿瘤抗原”也可以指肿瘤新血管形成或肿瘤细胞外基质抗原。如本文中所使用，“与肿瘤新血管形成相关的抗原”指由肿瘤中存在的新合成的血管表达的抗原。作为这种抗原的例子，可参考纤连蛋白的EDA和EDB结构域、内皮唾液酸蛋白(Endosalin)/TEM1、内皮因子(Endoglin)/105、PSMA或B7-H4。如本文中所使用，“与肿瘤细胞外基质相关的抗原”指由肿瘤中存在的细胞外基质表达的抗原。作为这种抗原的例子，可参考层粘连蛋白-332的G45片段(ROUSSELLE等，CancerResearch，vol.68(8),p:2885-94,2008)。根据另一个优选的实施方式，本发明的抗体包括人CH1γ1结构域，其中氨基酸已被半胱氨酸残基替换，优选地其中第133位或134位的氨基酸是半胱氨酸，更优选地其中第133位上的氨基酸是半胱氨酸。恒定区的编号为Kabat等人(1991，NIHPublicationn°91-3242，NationaltechnicalInformationServiceSpringfield，VA)所述的EU索引的编号。例如，这样突变的人CH1γ1结构域指氨基酸序列SEQidn°1，其中第133位上的丝氨酸残基已经被半胱氨酸替换。CH1序列的第133或134位上的半胱氨酸残基恢复了本发明的抗体的轻链和重链之间的二硫键。根据还优选的实施方式，本发明的抗体包含来自人IgG2、IgG3或IgG4的CH1结构域，优选所述结构域来自IgG3的CH1结构域，如序列SEQidn°2。然而本发明的抗体可以包含来自人IgG1的铰链结构域，它也可能包含人铰链结构域，它为突变的人铰链IgG1以便恢复典型的IgG配对，或者它为来自人IgG2、IgG3、IgG4的铰链结构域或其衍生物。“使人铰链IgG1突变以恢复典型的IgG配对”指IgG1铰链结构域，其中在其序列的第五位的半胱氨酸残基已被另一个残基替换，优选被丝氨酸替换。事实上，所述突变使得恢复了典型的IgG结构。作为这种衍生物的例子，可参考SEQidn°4。来自人IgG2、IgG3或IgG4的铰链结构域是本领域技术人员公知的，并且对于IgG3对应于例如SEQidn°5。人IgG3的衍生物也是本领域技术人员公知的，对应于例如SEQidn°6至9，优选SEQidn°9。优选地，通过在其序列的第133或134位呈现半胱氨酸残基的来自人IgG1的突变的CH1结构域，或通过来自人IgG2、IgG3或IgG4的CH1结构域，在本发明的抗体中引入半胱氨酸残基未释放之前与另一个半胱氨酸残基相连的任何游离巯基。本发明的抗体包括免疫缀合物。如本文所用，术语“免疫缀合物”指包括与第二个分子，优选细胞毒素剂或放射 性同位素结合的至少一种嵌合抗体或其功能片段的缀合分子。优选地，所述抗体或其功能片段通过共价键与所述第二分子结合。在一个实施方式中，本发明的抗体是免疫缀合物。在一个具体的实施方式中，本发明的抗体是免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含本发明的抗体或其功能片段和细胞毒素剂。在另一个具体的实施方式中，本发明的抗体是免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含本发明的抗体或其功能片段和放射性同位素。根据第三方面，本发明涉及组合物，优选涉及包含如本文所述的至少一种抗体或其至少一种功能片段和药学上可接受的载体的用于治疗的药物组合物。所述组合物尤其用于治疗癌症、自身免疫疾病或感染。所述组合物可以为适于向患者施用的任何药物形式，包括但不限于溶液、悬浮液、冻干粉剂、胶囊和片剂。本发明的药物组合物还可以包含任何药学上可接受的稀释剂、赋形剂或助剂。可以配制本发明的药物组合物用于注射，例如局部注射、经粘膜施用、吸入、口服施用，本领域技术人员发现适合于实现所需的治疗的更普遍的任何剂型。本发明的抗体以有效实现预期目的的量并且适于所选择的给药途径的剂量包含在所述药物组合物中。更具体而言，治疗有效剂量指有效预防、缓解或改善患有癌症或感染的受试者的症状的化合物的量。取决于预期的应用，本发明的嵌合抗体可以进一步包含另外的成分。例如，本发明的嵌合抗体可以对应于免疫缀合物。本发明的第四方面涉及用于治疗癌症或感染的方法，该方法包括如下步骤：向有需要的患者施用有效量的如本文所述的组合物，所述组合物包含如本文所述的至少一种抗体或其至少一种功能片段。如本文中所使用，术语“患者”指哺乳动物，优选指人。在下面的非限制性实施例中示出了本发明的其他实施方式和优点。实施例1.体外抗OAcGD2抗体的促凋亡活性在第一步中，通过由人IgG1的恒定区κ替换8B6的恒定区设计嵌合抗OAcGD2抗体c8B6。其序列表示于图1中(SEQidn°12和SEQidn°13)。该抗体的结构包括轻链中的2个分子内二硫键(Cys23-Cys93和Cys139-Cys199)和 重链中的4个分子内二硫键(Cys22-Cys98、Cys146-Cys202、Cys263-Cys323和Cys369-Cys427)。参与链内二硫键的半胱氨酸残基用星号(*)表示。整个结构由3个分子间二硫键稳定：轻链通过轻链的最后一个半胱氨酸残基和上游铰链结构域的半胱氨酸残基之间的一个二硫键(Cys219-Cys222)连接到重链上，并且重链由2个连接中间铰链中的半胱氨酸的二硫键相连(Cys228-Cys228和Cys231-Cys231)。参与链间二硫键的半胱氨酸残基由箭头(↑)表示。8B6LCVR经NotI-KASI克隆在pEvi载体中，以便与人IgG1的CL结构域融合。8B6HCVR经NotI-NheI克隆在pEvi载体中，以便与人IgG1的重链的恒定区融合。然后，由两种载体共转染CHOK1细胞。转染后，CHOK1细胞在在无血清培养基中保持数天。每天，收集培养基并在-80℃下冷冻。将新培养基添加到转染的细胞中，直至细胞存活率小于70％-80％。将收集的培养基汇集，使用固定在琼脂糖基质上的蛋白A纯化抗体。在还原和非还原条件下通过电泳对CHO中c8B6的生产进行分析。结果表明，在非还原条件下，c8B6抗体在150kD显示出对应于完整抗体的一条带。但是，在还原条件下，观察到在50kD的HC带，在25kD的LC带。在Superdex柱上的凝胶过滤显示出具有在对应于150kD在12.3ml处的主峰的色谱图(纯度99.0％)。最后，在蛋白A柱上纯化后的嵌合c8B6的产率为约315mg/L上清液。通过对表达GD2-O-乙酰化神经节苷脂的IRM5细胞进行流式细胞术确认了抗体与其靶的结合。通过缀合异硫氰酸荧光素(FITC)的山羊抗-人IgG显示了结合。这些实验已证实了这种抗体结合GD2-O-乙酰化的功能。然后，通过MTT法评估c8B6抗体的直接细胞毒性。在这些分析中，1×104IMR5细胞在96孔微孔板中在37℃下孵育24小时。添加80-0.15μg/mL的抗体，并在37℃下孵育24小时。然后将50μg的MTT添加至各孔中，并在37℃下孵育至少4小时，之后用10％SDS溶解细胞，并在37℃下孵育过夜。然后在570nm和650nm处读取吸光度。产物570nm处的吸光度中减去650nm处的吸光度(Abs570-Abs650)，以计算染料的总转化率。四个具有用20μg依托泊苷处理的细胞的对照孔提供了指示0％存活率的空白吸光度。存活率的抑制(％)表示为相对于未处理的细胞的百分比，每个值表示为一式四份的平均值±SEM。结果表明，通过由鼠IgG3恒定区变成人IgG1恒定区的嵌合步骤之后抗体c8B6已经丧失了8B6的直接细胞毒性。此外，该抗体还丧失了亲本IgG38B6的协同特性。最后，尝试不同方式的嵌合的许多实验只恢复了较少的促凋亡活性，并且未观察 到结合协同性。出人意料地，为了嵌合的CH1恒定区的特定修饰使得促凋亡活性变化很大。用基于以前的构建而设计的抗体301.14a、301.14b、301.15、301.15b、301.16、301.17、301.18、301.19、301.20和301.21获得了这些结果。抗体301.14a对应于具有如图2所示的人铰链γ1结构域(SEQidn°14)的突变的人CH1γ1(加下划线的突变S133C)。其他恒定区对应于IgG1的CH2和CH3结构域(SEQidn°11)和κCL结构域(SEQidn°10)。抗体301.14b对应于具有如图3所示的突变的人铰链γ1结构域(SEQidn°15)(加下划线的突变C222S)的突变的人CHγ1(加下划线的突变S133C)。其他恒定区对应于IgG1的CH2和CH3结构域(SEQidn°11)和κCL结构域(SEQidn°10)。抗体301.15对应于具有如图4所示的人铰链γ1结构域(SEQidn°16)的人CH1γ3(替换其表亲CH1γ1)。其他恒定区对应于IgG1的CH2和CH3结构域(SEQidn°11)和κCL结构域(SEQidn°10)。抗体301.15b对应于具有如图9所示的突变的人铰链γ1结构域(SEQidn°66)(加下划线的突变，对应于被丝氨酸残基替换半胱氨酸222，C222S)的人CH1γ3(替换其表亲CH11)。其他恒定区对应于IgG1的CH2和CH3结构域(SEQidn°9)和κCL结构域(SEQidn°8)。抗体301.16对应于具有如图5所示的人Hingeγ3结构域(SEQidn°17)(替换其表亲Hinge3γ1)的突变的人CH1γ1(加下划线的突变S133C)。其他恒定区对应于IgG1的CH2和CH3结构域(SEQidn°11)和κCL结构域(SEQidn°10)。抗体301.17对应于具有如图6所示的人铰链γ3结构域(SEQidn°18)(替换其表亲铰链γ1)的人CH1γ3(替换其表亲CH1γ1)。其他恒定区对应于IgG1的CH2和CH3结构域(SEQidn°11)和κCL结构域(SEQidn°10)。抗体301.18对应于具有如图7所示的变短的(17个氨基酸)人铰链γ3结构域(SEQidn°19)的突变的人CH1γ1(加下划线的突变S133C)。其他恒定区对应于IgG1的CH2和CH3结构域(SEQidn°11)和κCL结构域(SEQidn°10)。抗体301.19对应于具有如图8所示的变短的(17个氨基酸)人铰链γ3结构域(SEQidn°20)的人CH1γ3(替换其表亲CH1γ1)。其他恒定区对应于IgG1的CH2和CH3结构域(SEQidn°11)和κCL结构域(SEQidn°10)。抗体301.20对应于具有如图10所示的人铰链γ1结构域(SEQidn°23)的人CH1γ2(替换其表亲CH1γ1)。其他恒定区对应于IgG1的CH2和CH3结构域(SEQidn°9)和κCL结构域(SEQidn°8)。抗体301.21对应于具有如图11所示的人铰链γ1结构域(SEQidn°24)的人CH1γ4(替换其表亲CH1γ1)。其他恒定区对应于IgG1的CH2和CH3结构域(SEQidn°9)和κCL结构域(SEQidn°8)。muIgG3对照对应于鼠8B6IgG3，其中CH1IgG3对应于SEQidn°:64，其中第134位的半胱氨酸残基被丝氨酸残基替换，第224位的丝氨酸残基被半胱氨酸残基替换。如之前所确认的，所述抗体与GD2-O-乙酰化神经节苷脂结合。然后，如上所述，测定所述抗体的潜在的促细胞凋亡活性。结果总结于下面的表中，其中裂解的百分比为抗体浓度为80μg/ml时获得的。抗OacGD2301.14a、301.14b、301.15、301.16、301.17、301.18和301.19抗体对IMR5细胞的直接细胞毒性：出乎意料地，结果表明包括突变的人CH1γ或人CH1γ3的嵌合抗体具有促凋亡活性，意味着直接细胞毒性的丧失可能是由于人IgG1的结构。此外，所有这些抗体都显示出比初始抗体8B6的EC50更大的EC50。结果还表明，在最大％裂解方面产生更高的细胞毒性作用的构建体对应于()人CH1γ3和人铰链γ1的融合(301.15构建体)或(ii)人CH1γ1(S133C的突变)或人CH1γ3 和变短的人铰链γ3的融合(301.18和301.19构建体)。对于最后的这2个，观察到与原始c8B6相比提高的亲和力。最后，并且仍出人意料地，在对应于恢复结合协同性的竞争曲线中301.15抗体是呈现出聚集特性的唯一抗体。抗OacGD2301.15b、301.20和301.21抗体对IMR5、SUM159PT和H187细胞的直接细胞毒性：出乎意料地，结果表明包括人CH1γ2或人CH1γ4的嵌合抗体对IMR5细胞具有促凋亡活性，意味着直接细胞毒性的丧失可能是由于人IgG1的结构。此外，包括人CH1γ3和突变的人铰链γ1结构域的嵌合抗体(加划线的突变对应于由丝氨酸残基替换半胱氨酸222，C222S)对IMR5细胞具有促凋亡活性。结果还表明对应于人CH1γ1(突变的在S133C上)和突变的人铰链1γ结构域(划线的突变，对应于由丝氨酸残基替换半胱氨酸222，C222S)的融合(301.14b构建体)，或对应于人CHγ13和人铰γ链1的融合(301.15构建体)对SUM159PT和H187细胞都具有促凋亡活性。也通过碘化丙啶分析来评价301.14b和301.15抗体的直接细胞毒性。在该分析中，在37℃下将150000个IMR5细胞铺板在24孔板上24小时，并且然后在37℃下用40μg/ml每个抗体处理24小时。此后，通过碘化丙啶(12.5μg/ml)标记死细胞。在LSRIIFACS(BectonDickinson,SanJose,CA,USA)中通过流式细胞术分析所有样品。结果总结于下表中并由图12示出。结果证实了对应于人CH1γ1(S133C突变)和突变的人铰链γ1结构域(加划线的突变，对应于由丝氨酸残基替换半胱氨酸222，C222S)的融合(301.14b构建体)，或对应于人CH1γ3和人铰链γ1的融合(301.15构建体)对IMR5细胞具有促凋亡活性。同时，结果证实了为模仿IgG1结构的鼠IgG38B6的突变使得促凋亡活性丧失。重构非IgG1抗体的典型的CH1和轻链之间的配对可以恢复促凋亡活性。这种重构可以通过恢复非IgG1亚类典型的CH1半胱氨酸或通过替换非IgG1CH1结构域而获得。最后，本发明人成功地嵌合了保持促凋亡活性的8B6抗体，对于两种抗体，促凋亡活性甚至提高了，其中一个还表现出像原始抗体的结合协同性。2.抗GD2抗体的体外促凋亡活性通过MTT法来评估ch14.18抗体的直接细胞毒性。在本试验中，将1×104个IMR5细胞(100μl)在96孔微孔板中孵育，并且在37℃下孵育24小时。添加50μl培养基中的80-0.15μg/mL抗体并在37℃下孵育24小时。添加50μg的MTT并在37℃下培养4小时，将细胞溶解并且过夜后在570nm和650nm下读取吸光度。产物570nm处的吸光度中减去650nm处的吸光度(Abs570-Abs650)，计算染料的总转化率。四个具有用20μg依托泊苷处理的细胞的对照孔提供了指示0％存活率的空白吸光度。存活率的抑制(％)表示为相对于未处理的细胞的百分比。用311.14b和311.15抗体获得的结果总结于下面的表中，其中裂解的百分比为抗体浓度为80μg/ml时获得的。抗体311.14b对应于具有如图3所示的突变的人铰链γ1结构域(SEQidn°15)(加下划线的突变，对应于被丝氨酸残基替换半胱氨酸222，C222S)的突变的人CH1γ1(加下划线的突变S133C)。其他恒定区对应于IgG1的CH2和CH3结构域(SEQidn°9)和κCL结构域(SEQidn°8)。抗体311.15对应于具有如图4所示的人铰链γ1结构域(SEQidn°16)的人CH1γ3(替换其表亲CH1γ1)。其他恒定区对应于IgG1的CH2和CH3结构域(SEQidn°9)和κCL结构域(SEQidn°8)。抗GD2311.14b和311.15抗体对IMR5细胞的直接细胞毒性：出乎意料地，结果表明包括突变的人CH1γ或人CH1γ3的嵌合抗体具有促凋亡活性，意味着直接细胞毒性的丧失可能是由于人IgG1的结构。此外，所有这些抗体都显示出与初始抗体14.18的EC50相似的EC50。通过碘化丙啶分析来评价311.14b和311.15抗体的直接细胞毒性。在该分析中，在37℃将150,000个IMR5细胞铺板在24孔板上24小时，然后在37℃用40μg/ml各个抗体处理24小时。此后，通过碘化丙啶(12.5μg/ml)标记死细胞。在LSRIIFACS(BectonDickinson，SanJose，CA，USA)中通过流式细胞术分析所有样品。结果总结于下表中并由图13示出。死细胞％SEMPBS20.21.00ch14.18(311.3)20.40.2414.18(311.4)83.80.19311.14b80.81.13311.1580.70.65huIgG1对照20.20.98muIgG3对照22.41.59结果证实对应于人CH1γ1(突变的在S133C上)和突变的人铰链γ1结构域(划线的突变，对应于被丝氨酸残基替换半胱氨酸222，C222S)的融合(311.14b构建体)，或人CH1γ3和人铰链γ1的融合(311.15构建体)对IMR5细胞具有促凋亡活性。重构非IgG1抗体典型的CH1和轻链之间的配对可以恢复促凋亡活性。这种重构可以通过恢复来自非IgG1亚类典型的CH1半胱氨酸获得或通过替换非IgG1CH1结构域获得。总之，本发明人成功地嵌合了保持促凋亡活性的14.18抗体，对于两种抗体促凋亡活性甚至提高了，其中一个还表现出与原始抗体类似的协同结合。3.抗OAcGD2抗体的体内功效鼠成神经细胞瘤模型5周龄NOD/SCID小鼠购自CharlesRiver(L’Arbresle，法国)。人成神经细胞瘤IMR5肿瘤生长于免疫缺陷NOD-SCID小鼠中。简言之，用肿瘤细胞(1×106IMR5细胞)在右肋部皮下注射小鼠。然后使用公式[体积mm3＝(长度)×(宽度2)×0.5]测量肿瘤植入后皮下肿瘤的生长。在携带IMR5人成神经细胞瘤的NOD/SCID小鼠中，当肿瘤体积等于0.1cm3时，静脉施用抗体(500μg/小鼠)。小鼠接受8B6(muIgG3)mAb或c.8B6(huIgG1)mAb或双突变的huIgG1mAb或由huIgG3CH1替换的huIgG1CH1。4.抗GD2抗体的体内功效鼠成神经细胞瘤模型5周龄NOD/SCID小鼠购自CharlesRiver(L’Arbresle，法国)。人成神经细胞瘤IMR5肿瘤生长于免疫缺陷NOD-SCID小鼠中。简言之，用肿瘤细胞(1×106IMR5细胞)在右肋部皮下注射小鼠。然后使用公式[体积mm3＝(长度)×(宽度2)×0.5]测量肿瘤植入后皮下肿瘤的生长。在携带IMR5人成神经细胞瘤的NOD/SCID小鼠中，当肿瘤体积等于0.1cm3时，静脉施用抗体(500μg/小鼠)。小鼠接受14.18(muIgG3)mAb或14.18(huIgG1)mAb或双突变的huIgG1mAb或由huIgG3CH1替换的huIgG1CH1。5.抗GD2抗体的体内功效鼠淋巴瘤模型5周龄NOD/SCID小鼠购自CharlesRiver(L’Arbresle，法国)。人Burkitt淋巴瘤Raji肿瘤生长于免疫缺陷NOD-SCID小鼠中。简言之，用肿瘤细胞(1×107Raji细胞)在右肋部皮下注射小鼠。然后使用公式[体积mm3＝(长度)×(宽度2)×0.5]测量肿瘤植入后皮下肿瘤的生长。在携带Raji人淋巴瘤的NOD/SCID小鼠中，当肿瘤体积等于0.1cm3时，静脉施用抗体(500μg/小鼠)。小鼠接受利妥昔单抗chIgG1mAb或双突变的huIgG1mAb或由huIgG3CH1替换huIgG1CH1的chIgG1mAb。6.抗HER2(曲妥珠单抗)抗体的体内功效小鼠乳腺模型5周龄NOD/SCID小鼠购自CharlesRiver(L’Arbresle，法国)。人乳腺SKBR-3肿瘤生长于免疫缺陷NOD-SCID小鼠中。简言之，用肿瘤细胞(2×106SKBR-3细胞)在右肋部皮下注射小鼠。然后使用公式[体积mm3＝(长度)×(宽度2)×0.5]测量肿瘤植入后皮下肿瘤的生长。在携带SKBR-3人乳腺的NOD/SCID小鼠中，当肿瘤体积等于0.1cm3时，静脉施用抗体(500μg/小鼠)。小鼠接受曲妥珠单抗人源化的IgG1mAb或双突变的人源化huIgG1mAb或由 huIgG3CH1替换huIgG1CH1的人源化的IgG1mAb。当前第1页1 2 3