上华人群体的HLA二类抗原系统所识别。基于以上抗原设计原则及BMIl蛋白的生物学 特性，本发明利用生物信息学和多个表位预测模拟软件，分析与抗原性相关的参数，设计了 的线性氨基酸序列。BMIl线性多肽抗原由33个氨基酸残基组成，共含12个重叠表位，可检 测至少12种单克隆抗体，具有高度的特异性。
[0015] 法检测抗原表位 我们采用ELISA方法，对收集的血液进行检测，并得到各样本OD值进行分析。
[0016] 质控各样本设双复孔，取平均OD值。OD值离散度判定：离散度=0D1-0D2/ 0D1+0D2,离散度< 0. 1，为有效结果；离散度>0. 1，为无效结果。取100份健康人血清等体 积混合作为质控血（Quality control, QC)，代表人群的普遍情况，每板均设2个QC血衆 孔，以QC血浆孔的OD值变异水平判定结果的稳定性，批间变异CV=所有批次QC孔SD/所 有批次QC孔OD均值〈20%。批内变异CV=每日各板QC孔SD/每日各板QC孔均值〈10%。
[0017] 数据分析采用SPSS17. 0 for windows进行统计学分析。采用特异结合指数 (Specific binding index，SBI)来判定BMIl抗原多肽与血衆自身抗体的结合程度，SBI= BMIl OD值-NC OD值/ QC OD值-NC OD值，NC为各样本的阴性对照。利用?检验分 别比较恶性肝癌组与健康对照之间SBI值之间的差异，a=0. 05。
[0018] ROC曲线是根据一系列不同的二分类方式(分界值或决定阈)，以真阳性率(灵敏 度）为纵坐标，假阳性率（1-特异度）为横坐标绘制的曲线。ROC曲线下的面积值在I. 0和 0. 5之间。在AU>0. 5的情况下，AU越接近于1，说明诊断准确度越好。ROC曲线将灵敏度与 特异性以图示方法结合在一起，可准确反映某分析方法特异性和敏感性的关系，是试验准 确性的综合代表。该发明采用Analyse-it for Microsoft Excel软件绘制ROC曲线，计算 曲线下面积（AU )，判定灵敏度和特异度。
[0019] 本发明应用BMIl抗原表位多肽检测到肝癌患者血清及血浆中的BMIl特异性自身 IgG抗体，并且该反应具有高特异性和高灵敏性，为进一步用于制备肝癌早期诊断及预后预 测试剂盒奠定基础。
[0020] BMIl抗原表位多肽可用于制备肝癌早期诊断及预后预测试剂盒。
【附图说明】
[0021] 附图为肝癌患者体抗BMIl自身IgG抗体水平的ROC曲线分析图。
【具体实施方式】
[0022] 下面结合具体实施例子，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例子仅用于说明本 发明而不用于限制本发明的范围。
[0023] 实施例1 试剂盒制备 1试剂试剂配制见Tab. 2~7。
2操作 (I)包被：酶标板应用洗涤缓冲液清洗3遍，工作抗原用包被液稀释至工作浓度，包被 于酶标板，4 °C过夜。
[0025] (2)加谷氨酸：洗涤缓冲液清洗3遍，用包被液稀释谷氨酸至浓度lOOPg/ml，每孔 20〇μ1，37Γ或室温孵育Ih ; (3) 加血浆和质控对照（一抗）：酶标板应用洗涤缓冲液清洗3遍，利用包被液将血浆 稀释至合适浓度，一般为1:100~1:500,每孔10〇μ1，37°C或室温孵育Ih ; (4) 二抗孵育：洗涤缓冲液清洗3遍，利用包被液稀释二抗标准液IgG，工作浓度 1:20000,每孔加10〇μ1，37°C或室温孵育Ih ; (5) 显色：洗涤缓冲液清洗3遍，每孔加10〇μ1底物显色液，室温避光30~45min。
[0026] (6)检测：每孔加5〇μ1终止液，IOmin内检测，检测波长为450nm，参考波长为 630nm〇
[0027] 实施例2 肝癌患者的BMIl自身IgG抗体检测 1样本收集：本研究从吉林大学第三医院、省肿瘤医院选取经放射学检查和组织学检 查确诊肝癌样本103例。所有血清样本采集前未经过任何抗癌治疗，并具有全面的临床资 料和信息。同时招募了健康对照组样本121例。临床访谈及影像学检查均排除肝癌患病可 能。健康组与肝癌组在性别、年龄匹配，具有可比性（/M). 05) 2检测结果:BMIl的自身抗体表达水平（Tab. 8):肝癌组与健康对照组相比存在统计 学差异（?=_7· 163,尸〈0· 001)。
[0028] ROC曲线分析：肝癌患者BMIl自身IgG抗体检测在ROC曲线下面积为0.723 (SE=0.0 36，95%CI :0· 556-0. 695)(附图和 Tab. 9)。
[0029] 以上数据充分表明，利用本发明所设计的抗原表位多肽检测得到的肝癌患者自身 抗体IgG水平与正常健康组比较有显著性统计学差异。
[0030] 抗BMI1自身IgG抗体在肝癌患者和健康对照样本中的表达水平 a Standard error
Tab. 9肝癌中抗BMI1自身IgG抗体的
ROC曲线分析
【主权项】
1. 一种检测肝癌标志物BMIl抗原表位多肽，其特征在于：氨基酸序列为 H-DSIEFFDQNRLDRKVNKATTIIECLHSFCKTCI-OH 其纯度 >95%，pH>7. 0。2. 根据权利要求1所述的检测肝癌标志物BMIl抗原表位多肽在制备肝癌早期诊断及 预后预测试剂盒的应用。
【专利摘要】一种检测肝癌标志物BMI1抗原表位的氨基酸序列及应用，属于免疫学技术领域，本发明提供了一种肝癌相关基因BMI1的抗原氨基酸序列。应用BMI1多肽抗原检测肝癌患者血中相应的特异性自身抗体，这种自身抗体可作为肝癌标志物评估肝癌发生的危险度及预后疗效。这种抗原多肽及其抗体可用于制备肝癌早期诊断、预后预测试剂和开发治疗肝癌的靶向药物。
【IPC分类】C07K14/47, G01N33/574, G01N33/68
【公开号】CN105017405
【申请号】CN201510426292
【发明人】王雷, 王爽
【申请人】吉林省吉诺生物工程有限责任公司
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2015年7月20日