胰腺癌相关多肽dap44单克隆抗体的制备及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于抗肿瘤技术领域，涉及一种胰腺癌相关多肽DAP44,及由多肽抗原免疫 实验动物制备的杂交瘤细胞株和杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。
【背景技术】
[0002] 胰腺癌是一种凶险的消化道恶性肿瘤，近年来其发病率成不断上升趋势。由于胰 腺解剖位置隐蔽，胰腺癌早期一般缺少典型的临床症状，大多数胰腺癌患者发现时已处于 进展期，肿瘤已向周围脏器、淋巴和血管侵润或转移。生存预后差，中位生存时间仅为3-5 个月，其5年生存率小于5 %。尽管外科手术是胰腺癌治疗的唯一有效手段，但目前仅有不 足20%的病人可以达到一个满意的手术切除和根治效果。研究表明，肿瘤分期是一个影响 胰腺癌预后的重要独立影响因素，分期越早的病人其预后越好；癌肿小于Icm或更小时确 诊，切除率可达90%，且术后生存率明显改善。因此，胰腺癌的早期诊断是患者存活率提高 的关键。
[0003] 目前对于胰腺癌的诊断主要依赖于影像学方法如CT或MRI等，但对于胰腺癌的 早期诊断敏感性不高，难以发现较小的胰腺肿瘤（直径< 1.5cm)。临床上也多应用肿瘤标 志物来辅助诊断胰腺癌，目前研究较多的血清标志物有血清癌胚抗原（CEA)、胰腺癌胚抗原 (POA)、胰腺相关抗原（PCAA)、胰腺特异性抗原（PaA)和糖抗原（CA19-9)等。其中最常用的 〇八19-9，对胰腺癌的较高的特异性（82%~90%)和敏感性（79%~81%)。但0419-9作 为辅助诊断指标，存在一定的局限性，如在胰腺炎、肝硬化等良性疾病和消化道其它恶性肿 瘤中出现假阳性；在Lewis a阴性基因型患者中的出现假阴性。因此，寻找一种新的高敏感 性、特异性胰腺癌相关肿瘤标志物对胰腺癌的诊断具有重大临床意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的之一在于提供一种可用于胰腺癌检测的肿瘤标志物。通过体积排阻 高效色谱和质谱检测筛选了一段长度为44个氨基酸的多肽序列，该多肽在胰腺癌中特异 性高表达，经生物学信息分析发现，该多肽与精神分裂症相关蛋白DNTBPl高度同源，将该 多肽命名为DTNBPlAssociated P印tide(DAP44)，其氨基酸序列如SEQ ID NO :1所示。
[0005] 本发明的另一个目的是提供了一种DAP44的抗原表位，其序列如SEQ ID NO :2所 不。
[0006] 本发明的另一个目的在于提供了一种能特异性识别DAP44蛋白的单克隆抗体，其 制备方法为：
[0007] (1)利用上述DAP44抗原表位肽免疫动物；
[0008] (2)取经免疫的动物脾细胞与骨髓瘤细胞融合，得到可稳定分泌抗DAP44抗原表 位多肽的杂交瘤细胞；
[0009] (3)杂交瘤细胞腹腔接种BALB/Ac小鼠，制备腹水。即为抗DAP44蛋白表位多肽的 单克隆抗体。
[0010] 本发明的另一个目的在于提供了一种DAP44单克隆抗体，由保藏号为CCTCC C201564(N〇. 2D1C11)的杂交瘤细胞系所产生。
[0011] 本发明的另一个目的在于提供了一种DAP44单克隆抗体，其由保藏号为CCTCC C201565(N〇.1E8H3)的杂交瘤细胞系所产生。
[0012] 本发明提供由上述杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体，经抗体配对筛选，所得抗 体具有高度的亲和性和特异性，能够与DAP44结合，从而对胰腺癌进行检测。
[0013] 本发明所述单克隆抗体可以是，例如单链抗体、嵌合抗体、人源化抗体、以及上述 抗体的衍生物、功能等同物或同源物，也包括抗体片段和含有抗原结合结构域的任何多肽。
[0014] 本发明产生抗体间接ELISA效价不低于1 :512000。
[0015] 本发明的单克隆抗体，具有良好的稳定性，对DAP44具有很好的特异性识别能力。
[0016] 本发明的单克隆抗体及DAP44多肽表位用于胰腺癌的诊断。
【附图说明】
[0017] 图Ia是胰腺癌患者术前血清质谱图。
[0018] 图Ib是胰腺癌患者术后血清质谱图。
[0019] 图2是酶切后肽段的质谱图。
[0020] 图3-1是No. 2D1C11单克隆抗体的免疫组化应用。
[0021] 图3-2是No. 1E8H3单克隆抗体的免疫组化应用。
【具体实施方式】
[0022] 实施例1 DAP44蛋白的筛选与测序
[0023] 收集临床50例胰腺癌患者术前和术后第5天血清蛋白样本，预处理去除白蛋白等 大分子，蛋白浓缩定量。准备好刀豆蛋白A填充的亲和层析色谱柱，将样品直接装载在亲和 色谱柱上（分离色谱），检测波长280nm。由于缺少糖基化位点，血清中的大多数蛋白质不 与亲和色谱柱的刀豆蛋白A发生相互作用，只有少数蛋白质区域表现出对刀豆蛋白A的强 烈亲和性，亲和柱上所保留的即为N端糖基化的糖蛋白。通过体积排阻色谱高效分离和收 集蛋白样本，利用MALDI-TOF - MS质谱技术分析比较胰腺癌患者术前和术后第五天的血 清糖蛋白质谱结果，发现在所有检测到的质量/电荷（M/Z)峰值中，胰腺癌患者的术前血清 中有一个明显的高强度峰值，而在术后峰值较低。随后我们对50例患者术前和术后血清进 行了评估，其中在42例患者血清中发现了同样的峰值变化，阳性率为84 %，表明该峰可能 对应一个潜在的胰腺癌肿瘤标志物（图1)。以PNGase F酶裂解此峰的碳水化合物基团，通 过质谱分析发现，此峰值具有1086. 8的质荷比（图2)。经过肽段测序和生物学信息分析， 发现其为一段含有44个氨基酸的多肽片段，氨基酸序列SEQ ID NO :1。该多肽的前36个 氣基酸序列与精神分裂症相关蛋白DTNBPl的N端序列完全一致，提不该多妝可能与DTNBPl 高度同源，命名为 DTNBPlAssociated Peptide (DAP44)。
[0024] 实施例2小鼠单克隆抗体的制备与筛选
[0025] 小鼠免疫
[0026] 利用多肽固相化学合成法合成DAP44抗原表位肽，序列如SEQ ID NO :2所示，末端 进行KLH偶联。取8周龄健康BALB/Ac小鼠，将适量合成的KLH偶联半抗原与弗氏完全佐 剂1:1混合乳化，行背部皮下多点免疫。首次免疫后2周，将DAP44蛋白与弗氏不完全佐剂 混合，再次免疫小鼠，方法同前。以后每隔3周，进行第三、四次强化免疫。第四次免疫3天 后，小鼠眼静脉取血，选择血清ELISA效价较高的小鼠做细胞融合。
[0027] 细胞融合、杂交瘤细胞株的建立
[0028] 取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0(脾细胞：Sp2/0 = 5:1)在PEG4000作用下融 合。将融合后的细胞转移至预先接种饲养细胞的9