一种鼠源单克隆抗体及其制备方法和用图
【技术领域】
[0001] 本发明设及抗体技术领域。具体地说，本发明设及一种新的重组抗人抗狂犬病毒 单克隆抗体的单克隆抗体，及其制备方法和用途。
【背景技术】
[0002] 狂犬病是由狂犬病毒所致的自然疫源性或动物源性人畜共患急性传染病，流行性 广，病死率几近百分之百，对人民生命健康造成严重威胁。人狂犬病主要通过患病动物咬 伤、抓伤或由粘膜感染引起，在特定的条件下还可通过呼吸道气溶胶传染。传染动物主要是 犬（超过90%)，其次是猫。根据中国疫情报告系统资料，1998年后狂犬病疫情年增长幅度 越来越高，死亡人数不断攀升。
[0003] 对于狂犬病毒暴露后预防，WK)推荐的处理方法是全程注射狂犬疫苗，同时合并注 射抗狂犬病马血清巧RIG)或抗狂犬病毒人免疫球蛋白（HRIG)。但HRIG由于来源限制价格 昂贵，而马血清制品则较易发生严重的过敏反应，所W现今国际上已经公认有必要用重组 单克隆抗体取代狂犬病毒暴露后预防中使用的抗狂犬病毒血源抗体。
[0004] 此外，抗狂犬病毒重组单克隆抗体具有中和效果好、安全性好、成本低、可大量生 产等优点，具有取代邸IG和皿IG的潜在能力，可用于狂犬病的暴露后预防。陈哲等人运用 瞻菌体表面呈现技术，采集多个具有高滴度狂犬病毒抗体的狂犬病毒疫苗注射者外周血淋 己细胞，构建了抗狂犬病毒Fab基因工程抗体文库，并对抗体库进行富集筛选，获得特异 性抗狂犬病毒基因工程抗体Fab段，并将其命名为RVFabS。由于小分子抗体在亲和力和中 和活性方面均低于全抗体，于是他们将上述F油抗体RVF油8的轻链和重链基因分别克隆进 入全抗体表达载体化cA-化并转染昆虫S巧细胞，利用杆状病毒/昆虫细胞系统实现全抗 体的分泌型表达得到全抗体RVIgGS。并进一步对其进行功能鉴定，结果表明RVIgGS具有 较好的中和活性，能达到876. 61IU/mg，完全具备了中和国际标准攻击毒株CVS-11株的能 力（病毒学报.2010. 7; 26(4) : 271-275)(中国专利；人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性抗体 (RVF油8)，公开号CN101812131A)。
[0005] 华北制药集团新药研究开发有限责任公司将RVF油8的全抗体基因序列在CH0 细胞表达系统中表达，构建出成功高效表达该抗体的工程细胞，并把得到的单克隆抗体 命名为NC08。该方法操作工艺简便、产品表达水平高、生产的抗体质量均一性及稳定 性好，具备产业化价值（中国专利；重组人抗狂犬病毒单克隆抗体的制备方法，公开号 CN101100663A)。此外，NC08与本公司之前开发的醒57组成组合制剂，可进一步扩大对狂 犬病毒毒株的覆盖。
[0006] 在NC08及其组合制剂进行临床前研究及临床研究的过程中，W及将来成为药物 后患者应用的过程中，为了研究药物代谢及保证用药安全，需要检测受试者(动物或人）或 患者血清的NC08浓度或者需要检测人抗NC08的抗体。在某些情况下，可能需要从现有产 品中检测有无NC08的添加。因此，迫切需要一种能有效、快速检测NC08和人抗NC08抗体 的广品。
【发明内容】
[0007] 本发明需要解决的第一个技术问题是提供一种抗NCOS单克隆抗体，用于检测 NC08浓度和人抗NC08抗体。
[0008] 本发明需要解决的第二个技术问题是提供一种编码上述抗NC08单克隆抗体的 DNA分子。
[0009] 本发明需要解决的第=个技术问题是提供一种表达载体。
[0010] 本发明需要解决的第四个技术问题是提供一种真核宿主细胞。
[0011] 本发明需要解决的第五个技术问题是提供一种该重组抗NC08单克隆抗体的制备 方法。
[0012] 本发明需要解决的第六个技术问题是提供上述单克隆抗体的两种用途。
[0013] 为实现上述发明目的，本发明一方面提供了一种重组抗NC08单克隆抗体，该抗体 含有重链可变区和轻链可变区，其特征在于，轻链可变区具有SEQIDNO: 1所示的氨基酸序 列，重链可变区具有SEQIDN0:2所示的氨基酸序列。
[0014] 本发明另一方面提供了编码上述单克隆抗体的DNA分子。
[0015] 在一个较佳的实例中，该DNA分子含有SEQIDN0:3所示的编码所述单抗轻链可 变区的核巧酸序列，W及SEQIDN0:4所示的编码所述单抗重链可变区的核巧酸序列。
[0016] 本发明第S方面提供了一种表达载体，该表达载体含有上述DNA分子。
[0017] 本发明第四方面提供了一种宿主细胞，其特征在于，它含有上述表达载体。在一个 较佳的实例中，该宿主细胞是CH0细胞。
[0018] 本发明第五方面提供了一种制备上述单克隆抗体的方法，其特征在于，该方法包 括： a) 构建含有权利要求2所述DNA分子的表达载体； b) 用步骤a)所述的表达载体转化宿主细胞； C)培养步骤b)所得的宿主细胞； d)分离纯化获得所述单克隆抗体。
[0019] 本发明提供的抗体可W在体外检测NC08的浓度和人抗NC08抗体，本发明第六方 面提供了一种利用本发明所述抗体检测NC08浓度的方法。在一个较佳的实例中，检测方法 为桥联化ISA法。该抗体可用于制备检测试剂或者检测试剂盒。
[0020] 本发明设及一种重组抗NC08单克隆抗体，该抗体包含重链可变区和轻链可变区， 轻链可变区具有SEQIDNO: 1所示的氨基酸序列，重链可变区具有SEQIDNO:2所示的氨 基酸序列。
[0021] 本文所用的术语"单克隆抗体(单抗)"指从一类基本均一的群体获得的抗体，即该 群体中包含的单个抗体是相同的，除少数可能存在的天然发生的突变外。单克隆抗体高特 异性地针对单个抗原位点，而且，与常规多克隆抗体制剂(通常是具有针对不同决定簇的不 同抗体）不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗 体的好处还在于它们是通过基因工程手段合成的，不会被其它免疫球蛋白污染。修饰语"单 克隆"表示了抗体的特性，是从基本均一的抗体群中获得的，该不应被解释成需要用任何特 殊方法来生产抗体。
[0022] 本文所用的术语"抗体"和"免疫球蛋白"是有相同结构特征的约150000道尔顿 的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链（L)和两个相同的重链化）组成。每条轻链通过一 个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重 链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区（VH)，其后是多个恒定区。 每条轻链的一端有可变区（VU，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相 对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形 成界面。
[0023]本文所用的术语"可变"表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形 成各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体 可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区（CDR)或超变区中的=个片段 中。可变区中较保守的部分称为构架区（FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个 FR区，它们大致上呈0-折叠构型，由形成连接环的=个CDR相连，在某些情况下可形成 部分0折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR-起形 成了抗体的抗原结合部位。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的 效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
[0024] 单克隆抗体可用本领域技术人员熟知的各种方法来制得。例如，单克隆抗体可用 杂交瘤方法制得，或用重组DNA方法制得，也可从瞻菌体抗体库中分离获得。
[00巧]本发明还提供了编码本发明重组抗NC08单克隆抗体的DNA分子。在一个较佳的 实例中，该DNA分子含有SEQIDN0:3所示的编码所述单抗轻链可变区的核巧酸序列，化及 SEQIDN0:4所示的编码所述单抗重链可变区的核巧酸序列。
[0026]在获得编码本发明重组抗NC08单克隆抗体重链可变区和轻链可变区的核巧酸序 列后，通常可通过W下方法来制备本发明的单克隆抗体。
[0027]首先，提供含有编码本发明单克隆抗体的核巧酸序列的表达载体。
[0028] 编码本发明单克隆抗体的DNA序列可用本领域技术人员熟知的常规手段来制得。 例如，可根据本发明公开的序列人工合成或用PCR法扩增得到编码该单克隆抗体重链可变 区和轻链可变区的核巧酸序列。然后，用本领域熟知的各种方法通过选择合适的酶切位点 将该些核巧酸序列插入合适的表达载体中，使它们分别在表达载体所携带的重链恒定区编 码序列和轻链恒定区编码序列之前，并使它们在同一阅读框内。
[0029]本发明中所用的表达载体是本领域技术人员己知的各种市售的表达载体，例如购 自Qiagen和Promega公司的表达载体，W及可购得的表达载体pM册(杭州安瑞普生物制品 研究有限公司）。
[0030] 随后，用上述获得的表达载体转化合适的宿主细胞。"宿主细胞"一般包括原核细 胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主 细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。在本发明中，较佳的宿主细胞是CH0细胞。
[0031] 用表达载体转化宿主细胞的方法有很多种，所用的转化程序取决于待转化的宿 主。将异源多核巧酸导入哺乳动物细胞中的方法是本领域所知的，其包括葡聚糖介导的转 染、磯酸巧沉淀、？〇1713'6]16 (1，5-二甲基-1，5-二氮^ 亚甲基聚甲漠化物)介导转染、原 生质体融合、电穿孔、脂质体介导转染W及将DNA直接显微注射到胞核中。在本发明中，较 佳的方法是电穿孔法或脂质体介导法等。
[0032] 然后，在适合本发明单克隆抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞。用常规 的免疫球蛋白纯化步骤，如蛋白A-Se地arose,哲基磯灰石层析、凝胶电泳、透析、离子交换 层析、疏水层析、分子筛层析或亲和层析等本领域技术人员熟知的常规分离纯化手段纯化 得到本发明的重组抗NC08单克隆抗体。
[0033] 所得单克隆抗体可用常规手段来鉴定。单克隆抗体的结合特异性可用免疫沉淀或 体外结合试验，如放射性免疫测定巧IA)或酶联免疫吸附测定巧LISA)来测定。单克隆抗 体的结合亲和力例如可用Scatchard分析方法来测定。
[0034] 本发明的优点在于本发明的单克隆抗体用于检测NC08具有特异性强、灵敏度高 的优点，能在NC08进行临床前研究及临床研究的过程中，W及将来成为药物后患者应用的 过程中，快速、准确检测受试者(动物或人）或患者的血清NC08浓度；还可用于检测人抗 NC08抗体；在某些情况下，还可用于从现有产品中检测有无NC08的添加。
【附图说明】
[003引 图1 ;还原SDS-PAGE电泳检测NC08F(ab'）2纯度，泳道1为制备所得NC08F(油'）2,泳道2为NC08。
[0036] 图2 ;载体pM册-L，并且标明了其中的元件及酶切位点，其中，15G9-L为轻链基因； polyA为多聚腺巧化信号；AmpR为氨节青霉素抗性基因。
[0037] 图3;载体pM册-H，并且标明了其中的元件及酶切位点，其中，15G9-H为重链基因， polyA为多聚腺巧化信号；AmpR为氨节青霉素抗性基因。
[003引 图4 ;NC08浓度-0D值拟合曲线。
【具体实施方式】
[0039] 下面将结合实施例进一步详细地描述本发明。然而应当理解，列举该些实施例只 是为了起说明作用，而并不是用来限制本发明。
[0040] 实施例中未标明来源的实验试剂