用于治疗疾病的抗人sema4A抗体的制作方法
【专利说明】
[000。本申请是申请日为2012年10月5日，申请号为201280060448. 1，发明名称为"用 于治疗疾病的抗人sema4A抗体"的发明专利申请的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明主要设及人sema4A的调节，尤其设及抑制人sema4AW阻断由抗CD3、抗 CD-28、IL-4、重组sema4A和树突细胞诱导的增殖和化2分化W及治疗疾病。
[0003] 相关申请的香叉引用
[0004] 本申请要求2011年10月6日提交的美国临时专利申请号61/543, 877的权益和 优先权，其通过引用的方式并入本文。
[000引 关于巧巧咨巧的研究或开发的声巧
[0006] 本发明是在由国立卫生研究院授予的R01AI062888-01下由政府支持做出的。所 述政府享有本发明的某些权利。
[0007] 巧合研究协巧参与方的名疏
[0008] 无
[0009] 对序列表的引用
[0010] 本公开包括作为2012年10月5日创建的，名称为序列表.txt的，依照37C. 尸.尺.§1.52(6)(乂）的文本文件递交的序列表，具有46，124字节大小，其通过引用并入 本文。所附序列描述和序列表遵守如37C.F.R. § § 1.821-1.825中所阐述的适用于 专利申请中的核巧酸和/或氨基酸序列公开的规则。所述序列表包含如符合Nucleic AcidsRes. 13:3021-3030(1985)和BiochemicalJ.219(No. 2) :：M5-373(1984)中描述的 lUPAC-IUBMB标准所定义的用于核巧酸序列特性的单字母代码和用于氨基酸的S字母代 码。用于核巧酸和氨基酸序列的符号和格式遵守37C.F.R. § 1.822中阐述的规则。
【背景技术】
[0011] 信号素类为大的、保守的分泌性或膜结合性配体家族，其对生长锥起排斥或吸引 提示的作用。基于功能域和序列相似性将信号素家族分成亚类。Rice, D.，et al.，Severe Retinal Degeneration Associated with Disruption of Semaphorin 4A, Investigative Ophthalmology&Visual Science, Vol. 45, No. 8(2004)。Sema4A为第IV类信号素。在小鼠 中，有证据表明sema4A由骨髓来源的及脾脏DC W及由B细胞和活化的T细胞表达。sema4A 可通过其受体TIM2刺激T细胞增殖，其诱导IL-2产生并且据报道在用抗CD40单克隆抗体 刺激B细胞后上调。Kumanogoh,A.,et al.^^re,419:629-33,2002。已表明，sema4A缺 陷小鼠表现出有缺陷的Thl响应。sema4A似乎参与了T细胞的引发W及化1/Th2响应的调 节。Kumanogoh,A.et al. Immunity, 22:305-16, 2005。然而，迄今为止，sema4A在人免疫系 统中的生物学功能还没有研究。
【发明内容】
[0012] 人sema4A蛋白由抗原呈递细胞，比如树突细胞和活化的生发中屯、B细胞，w及 CD4+Th2细胞高表达。我们发现，重组的sema4A蛋白强烈地促进被IL-4、抗CD3、抗CD28和 重组的sema4A诱导的人CD4+T细胞增殖和Th2分化。同时，中和mAb可阻断生物学功能。 同样地，人sema4A(本文也称为"hsema4A"或者更通常地称为"sema4A"或"Sema4A")呈现 重要的和有利的治疗祀点。
[0013] 本文提供了结合人sema4A的新的单克隆和人源化抗体。该些抗体在本文有时也 称为"抗人sema4A抗体（anti-humansema4Aantibody)"或"抗人sema4A抗体（anti-human sema4Aantibodies)"，但是也可称为分离的抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或简 单抗体，如W单数或复数所呈现的。
[0014] 所教导的抗人sema4A抗体用于治疗或预防急性或慢性疾病和病况。在一个方面， 结合人sema4A的分离的抗体，或其抗原结合部分被描述并且是有效的癌症治疗。所述抗人 sema4A抗体也可用于治疗人自身免疫疾病、变应性疾病、炎性疾病、移植物抗宿主疾病和移 植物排斥。
[001引还提供了基于人sema4A的该些抗体结合剂的组合物、方法、试剂盒和制品。该些 抗人sema4A抗体可为治疗和/或诊断剂并用于祀向与人sema4A和其受体人免疫球蛋白样 转录物40iILT-4)、人T细胞免疫球蛋白结构域和人粘蛋白结构域3化TIM-3)和人免疫球蛋 白样转录物2化ILT-2)信号途径的表达和/或活性相关的病理状况。
[0016] 此外，如本文描述的分离的抗体结合人sema4A，并可结合由下列基因编码的人 sema4A;NCBI登录号HGNC: 10729,Genpept登录号64218,或者与其具有百分之90同源性 的基因。本文提供的分离的抗体还可结合具有下列GenBank登录号之一的人sema4A受体； 10288、84868 和 10859。
[0017] 如本文所提供的，示例性的结合人sema4A的分离的抗体包括；(a)包含SEQID NO:36的氨基酸序列的重链可变区CDR1 ; (b)包含SEQIDNO:37的氨基酸序列的重链可变 区CDR2 ; (C)包含SEQIDN0:38的氨基酸序列的重链可变区CDR3 ; (d)包含SEQIDNO. 48 的氨基酸序列的轻链可变区CDRl; (e)包含SEQIDNO. 49的氨基酸序列的轻链可变区 CDR2 ;W及（f)包含SEQIDNO. 50的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。
[0018] 此外，结合人sema4A的分离的抗体的另一实例包括；（a)包含SEQIDNO: 54的氨 基酸序列的重链可变区CDRl;(b)包含SEQIDN0:55的氨基酸序列的重链可变区CDR2;(c) 包含SEQIDNO:56的氨基酸序列的重链可变区CDR3 ; (d)包含SEQIDNO. 66的氨基酸序 列的轻链可变区CDR1 ; (e)包含SEQIDNO. 67的氨基酸序列的轻链可变区CDR2 ;W及（f) 包含SEQIDNO. 68的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。
[0019] 或者，分离的抗体可具有包含SEQIDN0:36或54的氨基酸序列的重链可变区 CDR1;包含SEQIDN0:37或55的氨基酸序列的重链可变区CDR2;和/或包含SEQIDN0:38 或56的氨基酸序列的重链可变区CDR3,或与其具有百分之90同源性的重链可变区CDR。
[0020] 而且，分离的抗体可具有包含SEQIDN0:48或66的氨基酸序列的轻链可变区 CDR1;包含SEQIDN0:49或67的氨基酸序列的轻链可变区CDR2;和/或包含SEQIDN0:50 或68的氨基酸序列的轻链可变区CDR3,或与其具有百分之90同源性的重链可变区CDR。
[0021] 所述分离的抗体可具有包含SEQIDNO: 51或69的氨基酸序列，或者包含与SEQID NO:51或69的氨基酸序列具有至少百分之90同一性的氨基酸序列的轻链可变区（"化")。 所述分离的抗体可具有包含569 10^:39、45、57或63的氨基酸序列，或者包含与569 10N0:39、45、57或63的氨基酸序列具有至少百分之90同一性的氨基酸序列的重链可变区 ("VH")。同样地，作为实例，所述分离的抗体可包含SEQIDNO:39、45、57或63的重链可 变序列和SEQIDNO:51的轻链可变序列，或者与其具有百分之90同源性的序列。类似地， 所述分离的抗体可具有SEQIDNO:39、45、57或63的重链可变序列和SEQIDNO:69的轻 链可变序列或与其具有百分之90同源性的序列。
[002引所述分离的抗体可具有由SEQIDNO: 52或70的核酸序列，或与SEQIDNO: 52或 70的核巧酸序列具有至少百分之90同一性的核酸序列编码的可变轻链。所述分离的抗体 可具有由SEQIDN0:40、46、58或64的核酸序列，或与SEQIDN0:40、46、58或64的核巧 酸序列具有至少百分之90同一性的核酸序列编码的可变重链。
[0023] 本文还提供了单克隆抗体。所述单克隆抗体可具有包含SEQIDNO:73、75或77 的氨基酸序列，或者包含与SEQIDNO:73、75或77的氨基酸序列具有至少百分之90同一 性的氨基酸序列的可变轻链。还提供了具有包含SEQIDN0:72、74或76的氨基酸序列，或 者包含与SEQIDN0:72、74或76的氨基酸序列具有至少百分之90同一性的氨基酸序列的 可变重链的单克隆抗体。
[0024] 其它抗体可具有下列部件的任何一种或多种；可变轻链；可变重链；或重链或轻 链可变区CDR1、CDR2或CDR3,每个部件均包含如本文描述的和在序列表中标识的SEQID NO: 1直到77的氨基酸或核酸序列，或者包含与SEQIDNO: 1直到77的序列之一具有至少 百分之90同一性的氨基酸或核酸。
[00巧]本文还提供编码本文教导的任何抗人sema4A抗体的分离的核酸。本文还提供包 含编码本文描述的任何抗人sema4A抗体的核酸的宿主细胞。还提供产生抗体的方法（比 如包含编码本文描述的任何抗sema4A抗体的核酸的宿主细胞）包括培养所述宿主细胞W 便抗体产生，和/或从所述宿主细胞回收抗体。
【附图说明】
[0026] 为了获得且能够更详细地理解其中本发明的上文列举的特征、方面和优势W及其 它将变得显而易见的方式，通过参照本发明的实施方案而可能具有上文简要概括的本发明 的更加特定的描述，该些实施方案图示在形成该说明书一部分的附图中。然而，要注意的 是，附图仅仅示出本发明的一些实施方案，并且因此不被视为本发明的范围的限制，因为本 发明可承认其它同样有效的实施方案。
[0027] 图1A，1A1，1B和1C显示sema4A在人血C的表达。
[002引图2A和2B提供人扁桃体中的sema4A的免疫组织学染色。
[0029] 图3A和3B描绘抗人sema4A单克隆抗体阻断血C和T细胞之间的相互作用。
[0030] 图4A，4B，4C和4D显示sema4A增强CD4+幼稚T细胞增殖。
[003。图5A，5B，5C，抓和祀显示抗人sema4A单克隆抗体在TCR触发下阻断sema4A介 导的CD4+T细胞增殖。
[0032] 图6A，6B，6C和抓显示sema4A调节化2致敏的CD4+化的化2细胞因子分泌。
[0033] 图7A，7B，7C和7D显示sema4A在T细胞活化和化2培养条件下上调CRT肥+记忆 Th2细胞产生Th2细胞因子和下调Thl细胞因子。
[0034]图8A，8B，8C，8D，8E，8F，8G，細和81显示抗sema4A单克隆抗体在CD4+Th2细胞中 抑制由sema4A诱导的化2细胞因子（比-4, IL-5和IL-13)产生。
[003引图9显示第一批的抗人sema4A单克隆抗体的鉴定。
[0036]图10A，10B，10C，10D和10E显示抗人sema4A单克隆抗体克隆号126-65,126-28 和126-63的功能测定结果。
[0037] 图11A，11B，11C和11D显示抗人sema4A单克隆抗体克隆号126-25和126-31的 功能测定结果。
[003引图12显示第二批的抗人sema4A单克隆抗体的鉴定。
[0039]图13显示抗人sema4A单克隆抗体克隆号161-70-1，161-90,161-96B，161-110B， 161-117,161-118A和161-66的功能测定结果。
[0040]图14显示抗人sema4A单克隆抗体克隆号161-15B，161-18B，161-33,161-35， 161-44,161-49和161-51的功能测定结果。
[0041] 图15显示结合L/sema4A的LB70抗体的分析结果。
[004引图16A和16B显不结合L/sema4A的LB51抗体的分析结果。
[004引图17A和17B显示抗人Sema4A mAb阳性克隆检测PMBC上擲猴Sema4A的表达。
[0044] 图18A，18B，18C和18D显示针对hSema4A的两株人源化mAb的分析结果。
[0045] 图19A和19B显示sema4A受体克隆与人T细胞表达cDNA文库筛选。
[0046] 图20A和20B显示sema4A受体结合sema4A转染的细胞系。
[0047] 图21A和21B显示受体-化融合蛋白阻断由rhSema4A介导的人CD4+T细胞增殖。
[0048] 图22A，22B和22C显示sema4A在人哮喘肺组织中特异性过表达。
[0049] 图23显示小鼠161-51-1VH cDNA的核巧酸序列连同所导出的氨基酸序列。该图 还提供W单字母代码显示的氨基酸残基。信号肤序列为斜体。成熟VH的N端氨基酸残基 (曲为双下划线和黑体。根据K油at et al. (1991)的定义的CDR序列为下划线的。
[0050] 图24显示小鼠161-51-1化cDNA的核