一种泥鳅免疫球蛋白制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种泥鳅免疫球蛋白制备方法。
【背景技术】
[0002]泥鳅，亦称鳅鱼，有水中人参之美誉，属于鳅科小型鱼类。泥鳅，既是一种风味独特的佳肴，又具有较高的药用价值。李时珍《本草纲目》中记载:泥鳅“暖中益气、醒酒、解消渴。”中医认为，泥鳅性味甘平。具有补中益气，祛湿邪之功效，可作为消渴、阳瘆、时疫发黄、小儿盗汗、痔疾、疥鲜等病症的食疗佳品。泥鳅的滑液为消炎良药，对丹毒、痈肿等各种急性炎症有良效。在泥鳅长圆筒状的身体上，布满了不规则的黑色斑点，鳞细小，身上多粘液。鱼类的体表粘液中已被证实有多种溶菌活性物质存在，主要包括C-反应性蛋白、铁传递蛋白、溶菌酶、壳质酶、干扰素、补体等。对多种鱼类研宄结果表明，鱼体表粘液中还存在有免疫球蛋白(IgM)，这类物质被认为在机体防御中起着主要作用。由于免疫球白特殊的免疫生理功能，国际上对免疫球蛋白用作功能食品添加剂的研宄成为热点。
[0003]目前，人们对于泥鳅的功能特性研宄主要集中在对泥鳅粘液功能因子方面，如凝集素、抗菌肽、泥鳅多糖的提取分离，超氧化物歧化酶等等。从泥鳅体表粘液提取免疫球蛋白的研宄甚少。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的问题是提供一种以泥鳅体表粘液为原料制备免疫球蛋白的方法，该方法工艺简单，提取的免疫球蛋白纯度和安全性高。
[0005]为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是:一种泥鳅免疫球蛋白制备方法，制备步骤如下:
[0006](I)收集泥鳅体表新鲜粘液，向其中加入0.5-2倍的磷酸盐缓冲溶液，过滤除杂后备用;
[0007](2)向上述溶液中缓慢加入硫酸铵，使其饱和度达到15% -25%，3?5°C下静置12小时，离心10?20min，得到沉淀备用；
[0008](3)用磷酸盐缓冲溶液溶解上述步骤(2)中的沉淀，缓慢加入硫酸铵，使其饱和度达40% -55%，3?5°C静置过夜，离心10?20min，得到沉淀备用；
[0009](4)使用磷酸盐缓冲溶液对上述步骤(3)中的沉淀进行溶解，并对所得溶液进行除盐；
[0010](5)使用洗脱液对步骤⑷中的免疫球蛋白溶液进行纯化，洗脱速度为0.2-0.5mT ,/mi η ；
[0011](6)冷冻后干燥。
[0012]进一步，所述步骤(1)，步骤(3)和步骤(4)中的磷酸盐缓冲溶液浓度为0.01?0.02mol/L、pH 为 7-8。
[0013]进一步，所述步骤⑵和步骤(3)中的离心转速为10000r/min。
[0014]进一步，所述步骤(5)中的洗脱液为0.01-0.02mol/L、pH 7-8的磷酸盐缓冲液。
[0015]进一步，所述步骤(4)中采用超滤法除盐。
[0016]进一步，所述步骤(5)中使用Sephadex G-200层析柱对步骤(4)中的免疫球蛋白溶液进行纯化。
[0017]本发明具有的优点和积极效果是:本产品与现有产品相比，具有高提取率、高活性、低成本、安全绿色无污染、使用设备简单等特点。
【具体实施方式】
[0018]实施例1
[0019]一种泥鳅免疫球蛋白制备方法，制备步骤如下:
[0020](I)收集泥鳅体表新鲜粘液，加I倍的0.01mol/L、pH7.5的磷酸盐缓冲溶液，过滤除杂，备用；
[0021](2)向上述溶液中缓慢加入硫酸铵，使其饱和度达到20%，4°C静置12小时，10000r/min 离心 15min ；
[0022](3)用0.01mol/L、pH7.5的磷酸盐缓冲溶液溶解上述沉淀，缓慢加入硫酸铵，使其饱和度达45%，4°C静置过夜，10 000r/min离心15min ;
[0023](4)用0.0lmol/L、pH7.5的磷酸盐缓冲溶液溶解上述沉淀，超滤法除盐；
[0024](5)用Sephadex G-200层析柱对超滤后的免疫球蛋白溶液进行纯化，选择的洗脱液为0.01mol/L, pH7.5的磷酸盐缓冲液，洗脱速度为0.3mL/min ；
[0025](6)冷冻干燥；
[0026](7)经酶联免疫吸附试验测定IgM纯度达78%。
[0027]实施例2:
[0028]一种泥鳅免疫球蛋白制备方法，制备步骤如下:
[0029](I)收集泥鳅体表新鲜粘液，加1.5倍的0.01mol/L,pH7.6的磷酸盐缓冲溶液，过滤除杂，备用；
[0030](2)向上述溶液中缓慢加入硫酸铵，使其饱和度达到25%，4°C静置12小时，10000r/min 离心 15min ；
[0031](3)用0.01mol/L、pH7.6的磷酸盐缓冲溶液溶解上述沉淀，缓慢加入硫酸铵，使其饱和度达50%，4°C静置过夜，10 000r/min离心15min ；
[0032](4)用0.01mol/L, pH7.6的磷酸盐缓冲溶液溶解上述沉淀，超滤法除盐；
[0033](5)用S^hadex G-200层析柱对超滤后的免疫球蛋白溶液进行纯化，选择的洗脱液为0.02mol/L、pH7.6的磷酸盐缓冲液，洗脱速度为0.2mL/min ；
[0034](6)冷冻干燥
[0035](7)经酶联免疫吸附试验测定IgM纯度达78.5%。
[0036]实施例3:
[0037]一种泥鳅免疫球蛋白制备方法，制备步骤如下:
[0038](I)收集泥鳅体表新鲜粘液，加0.5倍的0.01mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲溶液，过滤除杂，备用；
[0039](2)向上述溶液中缓慢加入硫酸铵，使其饱和度达到20%，4°C静置12小时，10OOOr/min 离心 15min ；
[0040](3)用0.0lmol/L,pH7.4的磷酸盐缓冲溶液溶解上述沉淀，缓慢加入硫酸铵，使其饱和度达45%，4°C静置过夜，10 000r/min离心15min ;
[0041](4)用0.01mol/L, pH7.4的磷酸盐缓冲溶液溶解上述沉淀，超滤法除盐；
[0042](5)用S^hadex G-200层析柱对超滤后的免疫球蛋白溶液进行纯化，选择的洗脱液为0.015mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液，洗脱速度为0.25mL/min ；
[0043](6)冷冻干燥；
[0044](7)经酶联免疫吸附试验测定IgM纯度达80%。
[0045]以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本专利涵盖范围之内。
【主权项】
1.一种泥鳅免疫球蛋白制备方法，其特征在于:制备步骤如下:(1)收集泥鳅体表新鲜粘液，向其中加入0.5-2倍的磷酸盐缓冲溶液，过滤除杂后备用； (2)向上述溶液中缓慢加入硫酸铵，使其饱和度达到15%-25%，3?5°C下静置12小时，离心10?20min，得到沉淀备用； (3)用磷酸盐缓冲溶液溶解上述步骤(2)中的沉淀，缓慢加入硫酸铵，使其饱和度达40% -55%，3?5°C静置过夜，离心10?20min，得到沉淀备用； (4)使用磷酸盐缓冲溶液对上述步骤(3)中的沉淀进行溶解，并对所得溶液进行除盐；(5)使用洗脱液对步骤(4)中的免疫球蛋白溶液进行纯化，洗脱速度为0.2-0.5mL/min ； (6)冷冻后干燥。
2.根据权利要求1所述的一种泥鳅免疫球蛋白制备方法，其特征在于:所述步骤(I)，步骤(3)和步骤(4)中的磷酸盐缓冲溶液浓度为0.01?0.02mol/L、pH为7-8。
3.根据权利要求1所述的一种泥鳅免疫球蛋白制备方法，其特征在于:所述步骤(2)和步骤(3)中的离心转速为10000r/min。
4.根据权利要求1所述的一种泥鳅免疫球蛋白制备方法，其特征在于:所述步骤(5)中的洗脱液为0.01-0.02mol/L、pH 7-8的磷酸盐缓冲液。
5.根据权利要求1所述的一种泥鳅免疫球蛋白制备方法，其特征在于:所述步骤(4)中米用超滤法除盐。
6.根据权利要求1所述的一种泥鳅免疫球蛋白制备方法，其特征在于:所述步骤(5)中使用Sephadex G-200层析柱对步骤(4)中的免疫球蛋白溶液进行纯化。
【专利摘要】本发明提供一种泥鳅免疫球蛋白制备方法，属于生物技术领域。制备步骤：收集泥鳅体表新鲜粘液，向其中加入0.5-2倍的磷酸盐缓冲溶液，过滤除杂后备用；向上述溶液中缓慢加入硫酸铵，使其饱和度达到15％-25％，3～5℃下静置12小时，离心10～20min，得到沉淀备用；用磷酸盐缓冲溶液溶解上述步骤中的沉淀，缓慢加入硫酸铵，使其饱和度达40％-55％，3～5℃静置过夜，离心10～20min，得到沉淀备用；使用磷酸盐缓冲溶液对上述步骤中的沉淀进行溶解，并对所得溶液进行除盐；使用洗脱液对步骤中的免疫球蛋白溶液进行纯化，洗脱速度为0.2-0.5mL/min；冷冻后干燥。本发明具有的优点和积极效果是：本产品与现有产品相比，具有高提取率、高活性、低成本、安全绿色无污染、使用设备简单等特点。
【IPC分类】C07K1-34, C07K1-30, C07K16-18, C07K1-36
【公开号】CN104829715
【申请号】CN201510139807
【发明人】赵丽
【申请人】天津市食品研究所有限公司
【公开日】2015年8月12日
【申请日】2015年3月27日