均为市售。
[0041] 实施例1表达抗NC08鼠单抗的杂交瘤细胞系的制备和筛选 1)抗原NC08F(ab'）2的制备 将NC08 (制备方法参见中国专利；重组人抗狂犬病毒单克隆抗体的制备方法，公开号CN101100663A)用0. 5mol/L盐酸调抑值至3. 5,37°C水浴30分钟。将胃蛋白酶(购自 Sigma-Al化ichCo.公司）与抗体样品按1:50 (w/w)的比例混合，37°C水浴2小时，加入 0. 5mol/L化2册〇4溶液调抑值至7. 0终止反应后，离屯、去除沉淀。
[0042] 用层析介质巧roteinA对酶切所得NC08F(油'）2进行纯化后，用30kD超滤膜对所 得纯化溶液超滤换液，保存溶液组成为lOmmol/LPB，150mmol/L化Cl，p册.0。根据体积加 入1/200体积的lOmg/mlTweenSO,混匀，用0. 22ym滤膜过滤，分装。用还原SDS-PAGE电 泳法检测制备所得抗原NC08F(油'）2的纯度>90% (电泳图见图1)。
[004引。免疫小鼠 用步骤1)制得的NC08F(ab'）2皮下注射免疫6周龄Ba化/c小鼠，首次免疫使用福氏 完全佐剂，每隔两周使用福氏不完全佐剂加强免疫一次，共免疫=次，每次每只50yg。取上 述免疫的小鼠脾脏，制成淋己细胞单细胞悬液。
[0044] 3)融合和克隆化 按照"TheProteinProtocols化nclbook"第二版（JohnM.Wa化er2002Humana PressInc.)"PARTVIIIMONOCLONALANTIBODIES"159 节"HybridomaProduction" 中所述方法，将步骤2)制得的淋己单细胞与BALB/c小鼠来源的sp2/0骨髓瘤细胞进行 融合及克隆培养。义用《TheProteinProtocolsHanclbook》第二版（JohnM.Wa化er 2002HumanaPressInc. )PARTVIIIMONOCLONALANTIB孤lES第 161 节Screening HybridomaQiltureSupernatantsUsingELISA所述方法，使用NCOS对克隆进行筛选，最 后筛选得到一株表达抗NC08鼠源单抗的杂交瘤细胞株15G9。
[0045] 实施例2抗体可变区编码序列的克隆和测序 1)取实施例1筛选得到的杂交瘤细胞株进行悬浮培养，取细胞1〇7个，于4°CW离屯、力 200g离屯、5分钟，尽弃上清，所得细胞使用Qiagen公司的RNA抽提试剂盒（MagAttractRNA CellMiniM48Kit)提取总RNA。
[0046] 2)W提取的RNA为模版，使用TaKaRa公司的RT-PCR试剂盒（RNAPCRKit(AMV) Ver. 3. 0)进行RT-PCR反应，反转录引物分别为； A轻链扩增引物： 正向引物： 化1 ;5'ATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT3' 化2 ;日>ATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAG3> 化3 ;5'ATGGAGWCACAKWCTCAGGTCTTTRTA3' 化4 ; 5 >ATGKCCCCWRCTCAGYTYCTKGT3 > 化5 ;5>ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTG3> 反向引物： CK; 5'GTTGGTGCAGCATCAGC3 ' B重链引物； 正向引物： VH1 ;5'ATGGRATGSAGCTGKGTMATSCTCTT3' VH2 ;5>ATGRACTTCGGGYTGAGCTKGGTTTT3> V册；5>ATGGCTGTCTTGGGGCTGCTCTTCT3> VH4 ; 5 >ATGATRGTGTTRAGTCTTYTGTRCCTG3 > 反向引物： C丫 ； 5 'GGGGCCAGTGGATAGAC3 ' 反应结束后取反应物在1. 5%琼脂糖凝胶电泳上进行分离，采用Qiagen公司的胶回收 试剂盒（QIAquickGelExtractionKit)提纯扩增的DNA片段，进行序列测定(交由上海生 工生物工程技术服务有限公司进行测定)。结果如下；SEQIDN0:3显示了其轻链可变区基 因序列（5,到3'，324bp)，其氨基酸序列显示在SEQIDN0:1中；SEQIDN0:4显示了其 重链可变区基因序列（巧'到3'，360bp)，其氨基酸序列显示在SEQIDN0:2中。
[0047] 实施例3抗体的表达载体构建、表达与纯化 1)用EcoRI和NotI限制性酶酶切表达载体pM册，然后将上述抗体可变区与鼠源恒 定区通过搭桥PCR拼接起来，并在两端设计EcoRI和NotI酶切位点序列，之后与酶切的 表达载体连接，从而构建得到分别含有重组抗NCOS抗体轻链全长和重链全长基因的表达 载体pM册-L和pM册-H，如图2、3所示。
[0048] 2)CH0细胞转染与克隆筛选 上述构建的表达载体分别转化大肠杆菌DH10B菌种，接种于100毫升LB培养基中进行 扩增，收集细胞，用Qiagen公司质粒DNA纯化试剂盒（QIAGENPlasmidMiniKit)抽提质 粒DNA4yg，采用电转化法将上述质粒转染C册细胞，电转条件；240V、25Q、50yF。
[0049] 转染后的CM)细胞在MTX选择培养基上进行克隆筛选，最后在96孔板上进行有限 稀释培养，连续进行3次。挑取单克隆细胞系在RPMI1640培养基中进行培养，用化ISA法 检测上清中的抗体表达水平，选择表达水平最高的克隆作为工作株保存。
[0050] 3)抗体纯化与检测 将选定的工作株培养后，收集细胞上清或培养液，lOOOOrpm、少C离屯、20分钟，经 0. 45ym滤膜过滤、抽滤除气后备用。0.Imol/L的PB缓冲液（pH7. 0)作为平衡缓冲液平衡 ProteinASe地arose4FastFlow层析柱，流速1ml/分钟平衡10-20个柱体积至记录仪 基线稳定。将处理后的上清W同样流速上样，收集流穿液。上样结束后用平衡缓冲液洗至 基线平稳。用0.Imol/L的甘氨酸-盐酸缓冲液（pH3. 0)洗脱融合蛋白，流速1ml/分钟，收 集洗脱峰，用Imol/L的Tris-肥L缓冲液调抑至中性，经超滤浓缩置换于PBS(抑7. 4)缓 冲液中，冻存，用于W下的进一步分析与研究。
[0051] 实施例4单克隆抗体亲和力测定 1)标记NC08 依照偶联试剂盒（AmineCouplingKit,购自GE公司）说明，将邸C和N服按一定的 比例加水分别溶解；CM5传感片（GE公司）插入检测仪Biacore2000 (GE公司）后，控制流 速为 5yl/ 分钟，用皿S缓冲液（10mmol/1 肥阳S、150mmol/1 化Cl、3. 4mmol/1 邸TA、 0. 005%Tween20,抑7. 4)平衡体系，待基线稳定，开始标记NCOS; (1化DC和N服各100yL混 合均匀，注射50y1混合液使其流过待标记通道，活化传感片表面的駿基；（2)注射3.Omg/L NCOS溶液（溶于10mmoVI醋酸钢缓冲液，pH4. 5)，将NCOS通过氨基偶联标记于巧片表面， 标记目标8000RU; (3)注射35yL己醇胺的盐酸溶液封闭残余的活化駿基；(4)注射10y1 甘氨酸缓冲液洗去非键合的吸附蛋白和己醇胺。
[0052] 2)单抗结合过程检测 用皿S缓冲液梯度稀释实施例3制备所得单抗（35. 5yg/ml、17. 75yg/ml、8. 9yg/ml、 4. 45yg/ml、2. 2yg/ml)，12 000巧m离屯、10分钟，上机检测。上样30秒（流速30yl/分 钟)，皿S缓冲液平衡4分钟(流速30y1/分钟)，lOmmoVl甘氨酸缓冲液（P肥.0)再生30秒 (流速30y1/分钟)，皿S缓冲液平衡3分钟。
[005引 3)亲和常数计算 通过BIAeval3. 0软件，计算单抗与NC08的结合常数为4. 3nmol/l。
[0054] 实施例5应用单抗检测NC08的桥联化ISA法 用包被液缓冲液（0.1mol/L碳酸盐，pH9.6)稀释实施例3制备所得单抗至10yg/ml，4 °C过夜包被酶标板，用封闭液（1%BSA-PBS)封闭，将含有不同浓度NCOS的标准品 (S1-S5)和含有NC08的血清样本(将特定量NC08样品加入人血清中制备所得样本X1-X3) 及阴性对照品（Blank)加入孔板，37°C解育90分钟。用PBS洗板3遍，用封闭液稀释实施 例3制备所得单抗至10yg/ml。加入板孔中，37°C解育1小时。洗板3遍，加入用封闭液稀 释的人血清吸附处理的羊抗鼠IgG-HRP加入板孔中，37°C解育1小时。
[005引用PBS-T洗板5遍，向板孔中加入TMB底物显色液，37°C显色30分钟。加终止液 (2mol/lH2SO4) 50W/孔，终止反应。终止后30分钟内读数，波长450/630皿。根据标准曲 线（标准曲线见图4 )计算样品的NC08含量。含量测定结果实例见表1。
[0056] 表1NC08桥联化ISA法测定数据实例
【主权项】
1. 一种重组抗NCOS单克隆抗体，它包含重链可变区和轻链可变区，其特征在于，轻链 可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
2. -种DNA分子，其特征在于，它编码权利要求1所述的单克隆抗体。
3. 根据权利要求2所述的DNA分子，其特征在于，该DNA分子含有SEQ ID NO: 3所示的 编码所述单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列，以及SEQ ID N0:4所示的编码所述单克隆 抗体重链可变区的核苷酸序列。
4. 一种表达载体，其特征在于，它含有权利要求2所述的DNA分子。
5. -种真核宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求4所述的表达载体。
6. 根据权利要求5所述的真核宿主细胞，其特征在于，它是CHO细胞。
7. -种制备权利要求1所述的单克隆抗体的方法，其特征在于，该方法包括： a) 构建含有权利要求2所述DNA分子的表达载体； b) 用步骤a)所述的表达载体转化真核宿主细胞； c) 培养步骤b)所得的真核宿主细胞； d) 分离纯化获得所述单克隆抗体。
8. 权利要求1所述的单克隆抗体在制备检测NC08浓度的试剂中的应用。
9. 权利要求1所述的单克隆抗体在制备检测NC08浓度的试剂盒中的应用。
10. 权利要求1所述的单克隆抗体在检测NC08免疫原性中的应用。
【专利摘要】本发明提供了一种重组抗NC08单克隆抗体，轻链可变区具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，重链可变区具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。本发明还公开了编码该抗体的DNA分子，表达该抗体的载体以及被该表达载体转化的真核宿主细胞。本发明提供的抗NC08单克隆抗体能在NC08用药过程中快速检测受试者血清中NC08浓度，同时也能作为抗NC08的阳性对照抗体应用于NC08的免疫原性检测。
【IPC分类】C12R1-91, C12N15-11, G01N33-577, C07K16-42, C12N5-10, C12N15-63, C12P21-08
【公开号】CN104829724
【申请号】CN201510204334
【发明人】李燕霞, 赵伟, 王惠欣, 刘艳玲, 常亮, 段迎霞, 李立敏, 刘国芳, 曹晨华, 刘晓志, 程立均, 高健, 段宝玲
【申请人】华北制药集团新药研究开发有限责任公司
【公开日】2015年8月12日
【申请日】2015年4月27日