专利名称：一种同时检测a、b、c三组人轮状病毒的玻璃基因芯片及制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基因微阵列的生物芯片及其制备方法与应用，尤其涉及一种同时检测A、B、C三组人轮状病毒的玻璃基因芯片及制备方法与应用，属生物芯片和诊断试剂
背景技术：
基因芯片是指将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律的排列固定于固相支持物上，然后与待测的标记的核酸样品按碱基配对原理进行杂交，再经过一定的检测系统对杂交信号进行检测，并配以计算机系统对每一杂交信号进行数据分析和处理，从而迅速得出所要的信息。与传统的杂交技术相比，该技术具有微型化，高灵敏性，高度平行性，和高速性的显著特点。其发展速度和其中所运用的技术令人瞩目。迄今为止，已在基因表达检测，基因突变检测，单核苷酸多态性和DNA序列测定等方面展开了广泛的研究和应用。
轮状病毒(Rotavirus，RV)是全世界人和动物急性腹泻的最主要病原，危害巨大。按其结构蛋白VP6的抗原性差异，轮状病毒被分成A～G共七个组，能感染人类的仅有A、B、C三组。在发展中国家，轮状病毒每年引起87.3万5岁以下儿童死亡，在儿童死因中居第二位；腹泻在我国儿童死因中也居第二位，秋冬季儿童腹泻50％是由轮状病毒引起，直接威胁国家的公共安全、社会稳定、经济发展以及人口素质。
目前对于轮状病毒的检测，主要是针对粪便中的病毒抗原或基因，已经建立的技术可归纳为以下3类1.病毒分离与形态观察但是用于形态观察的电子显微镜价格昂贵，且对于已降解病毒的检测灵敏度下降，不适合大量的标本，也不适合基层使用。
2.免疫学技术目前最为多用，主要包括酶免疫技术[EIA，包括酶联免疫吸附试验(ELISA)和膜免疫试验(MEIA)]、乳胶凝集试验(LA)和胶体金试纸等技术，国外均有商品化试剂盒提供，国内还未商品化。免疫学技术具有灵敏性较高，特异性较好和简便快速的特点。但被检样品很受限制，固体待检物几乎不可能用这种方法检测。
3.病毒核酸检测主要包括聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和RT-PCR等方法。前者可根据PAGE胶中的核酸带型直接检测轮状病毒，但灵敏度不高。相比于免疫学技术和PAGE胶技术，PCR技术不仅有着更高的灵敏度，而且几乎适用于所有的食物样品。另外，此法为不能用血清学方法进行分型的标本提供了一种简便可靠的替代方法。但是扩增的灵敏性高，同时带来了假阳性问题，不通过杂交反应则无法对扩增产物的正确性进行验证。
此外，上述检测方法还存在一个共同的缺点通量低，即一次检测反应仅能检出一种组别或型别的轮状病毒，而对于一次即能检出所有能导致人感染的多组轮状病毒却无能为力。
经检索，有关利用荧光标记的PCR产物和玻璃基因芯片杂交来同时检测多组轮状病毒的基因芯片，至今未见报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决的技术问题之一是提供一种同时检测A、B、C三组人轮状病毒的玻璃基因芯片，以克服现有技术存在的不能一次检测导致人腹泻的三组轮状病毒和检测灵敏度低的缺陷，满足食品卫生监测，疾病预防控制和临床医疗领域的需要；本发明要解决的技术问题之二是结合荧光标记技术，以玻璃片为基片，提供一种对所述同时检测A、B、C三组人轮状病毒的玻璃基因芯片的制备方法；本发明要解决的技术问题之三是公开所述同时检测A、B、C三组人轮状病毒的玻璃基因芯片在制备临床诊断试剂中的应用。
本发明涉及的同时检测A、B、C三组人轮状病毒的玻璃基因芯片，包括玻璃基片和阵列式分布的寡核苷酸探针与对照及空白的点涂层，其特征在于，所述的玻璃基片是经醛基化处理的玻璃片；所述的寡核苷酸探针与对照及空白的点涂层分布于玻璃基片上，包括6条不同组别的人轮状病毒组特异性检测探针，1条阳性对照探针，4条阴性对照探针以及空白点样液对照，其中，所述的6条人轮状病毒组特异性检测探针的基因序列是ProbeA15′-ATTTATTGAATGCTTCGATAT-3′ProbeA25′-ACTGGTGAGTGGATTGTTTGA-3′ProbeB15′-ATCCCATTTGAGTAAATTCAG-3′ProbeB25′-ATGATAATTCAGCCAAGCC-3′ProbeC15′-CTGTATTAGCTACATGACCGT-3′ProbeC25′-AGCTATTGGAGTTTGGTAGTT-3′所述1条阳性对照探针的基因序列是PbP5′-ATTTATTGAATGCTTCGATAT-3′所述4条阴性对照探针的基因序列分别是PbEC5′-GATGAGAATGTGCCTTCGGGAA-3′PbSA5′-GAACATATGTGTAAGTAACTGTGC-3′PbHBV5′-AGAAAGACCTTTAACCTA-3′PbPSE5′-TAGGTGGTTCAGCAAGTTGGAT-3′上述的人轮状病毒组特异性检测探针，阳性对照探针和阴性对照探针以poly(dT)15作为连接臂，并在探针5′端加入带氨基的六碳基团，其中，所述阳性对照探针在其3′端带荧光标记；上述每种探针与对照及空白的点涂层以2×2方式在玻璃基片表面点制4个平行点，各点的直径为0.15mm，同种探针或对照或空白点间距为0.4mm；不同探针或对照点间距为0.5mm，点涂层微阵列的大小为3.5mm×3.5mm。
在上述的同时检测A、B、C三组人轮状病毒的玻璃基因芯片中，所述阳性对照探针在其3′端带有的荧光标记是Tamra荧光，且所述阳性对照探针分布位于点涂层阵列的四角。
上述的同时检测A、B、C三组人轮状病毒的玻璃基因芯片中，所述经醛基化处理的玻璃片是指将未经任何化学修饰的玻璃片裸片以体积百分比浓度为5％-10％戊二醛水溶液浸泡处理制得的玻璃片。
本发明所述的同时检测A、B、C三组人轮状病毒的玻璃基因芯片的制备方法，其步骤如下(1)玻片处理取未经任何化学修饰的常规玻璃片裸片以体积百分比浓度为5％-10％戊二醛水溶液浸泡0.5～1.5hr，得到醛基化的玻璃片作为芯片的基片；(2)确定探针根据A、B、C三组人轮状病毒基因序列，选择确定了6条人轮状病毒组特异性检测探针，其基因序列是ProbeA15′-ATTTATTGAATGCTTCGATAT-3′ProbeA25′-ACTGGTGAGTGGATTGTTTGA-3′ProbeB15′-ATCCCATTTGAGTAAATTCAG-3′ProbeB25′-ATGATAATTCAGCCAAGCC-3′ProbeC15′-CTGTATTAGCTACATGACCGT-3′ProbeC25′-AGCTATTGGAGTTTGGTAGTT-3′1条阳性对照探针，其基因序列是PbP5′-ATTTATTGAATGCTTCGATAT-3′4条阴性对照探针，其基因序列分别是PbEC5′-GATGAGAATGTGCCTTCGGGAA-3′PbSA5′-GAACATATGTGTAAGTAACTGTGC-3′PbHBV5′-AGAAAGACCTTTAACCTA-3′PbPSE5′-TAGGTGGTTCAGCAAGTTGGAT-3′(3)芯片制备将上述选择的人轮状病毒组特异性检测探针，阳性对照探针和阴性对照探针，以poly(dT)15作为连接臂，并在探针5′端加入带氨基的六碳基团；以3×SSC作为稀释液将上述探针分别稀释为10μM，以点样液为空白对照，以生物芯片点样仪Pixsys5500配以SMP3点样针接触式点制在所述醛基化玻璃基片上，取样板中液面高度是4-6mm，针在取样孔中停留时间是20ms，点样时，针在玻片上的停留时间是50ms，每种探针与对照及空白的点涂层以2×2方式在玻璃基片表面点制4个平行点，其中，阳性对照探针在其3′端带上荧光标记，且所述阳性对照探针分布位于点涂层阵列的四角，各点的直径为0.15mm，同种探针或对照或空白点间距为0.4mm；不同探针或对照点间距为0.5mm，点涂层微阵列的大小为3.5mm×3.5mm；将点制后的芯片平放于紫外交联仪内，4500J/cm2下交联3min，即得所述同时检测A、B、C三组人轮状病毒的玻璃基因芯片。
在上述的同时检测A、B、C三组人轮状病毒的玻璃基因芯片的制备方法中，所述人轮状病毒组特异性检测探针的选择原则是根据A、B、C三组人轮状病毒基因序列，设计针对每组人轮状病毒的特异性寡核苷酸探针，使每条探针的解链温度相近，且每条探针的解链温度在±3℃以内，以避免发夹和二聚体结构的形成。
在上述的同时检测A、B、C三组人轮状病毒的玻璃基因芯片的制备方法中，所述的阳性对照探针在其3′端带上的是以常规方法标记的Tamra荧光。
本发明所述的同时检测A、B、C三组人轮状病毒的玻璃基因芯片在制备临床诊断试剂中的应用。利用本发明所述的芯片可对A组人轮状病毒，B组人轮状病毒，C组人轮状病毒或同时对A、B、C三组人轮状病毒进行检测；例如临床上应用本发明所述的同时检测A、B、C三组人轮状病毒的玻璃基因芯片可以对疑似A组RV感染的婴幼儿腹泻标本进行检测并作出快速诊断。
在上述的同时检测A、B、C三组人轮状病毒的玻璃基因芯片在制备临床诊断试剂中的应用中，样品以如下方式制备以Trizol试剂(美国OMEGA公司)按使用说明提取轮状病毒基因组RNA，并以应用量的高压处理过的0.5‰DEPC(焦磷酸二乙酯)溶解RNA；针对A、B、C三组人轮状病毒分别设计的各组特异性上下游引物的序列是A组人轮状病毒上游引物5′-AACGAACAGTATGTTTCATCA-3′下游引物5′-TTGAAGGTCGTGATTGTGTTG-3′B组人轮状病毒上游引物5′-TGGAACATACGAAGTTACAG-3′下游引物5′-TACATCATAGTCTCGATAAAATA-3′C组人轮状病毒上游序列5′-GAAGAGTAGCATCAGGGAC-3′下游引物5′-TAAACGTAAATCATTGATTT-3′上述引物的特征在于解链温度为53-55℃，GC％为40-60％，并避免了发夹结构和二聚体结构。
在上述的同时检测A、B、C三组人轮状病毒的玻璃基因芯片在制备临床诊断试剂中的应用中，用于标记人轮状病毒组特异性上游引物的荧光标记物是Tamra荧光。
以Tamra荧光标记上述上游引物，在同时含有上述A、B、C三组人轮状病毒上下游引物的PCR扩增体系中，以多重RT-PCR扩增方式，实现对单组人轮状病毒或多组人轮状病毒的同时扩增。
对RNA进行逆转录反应按照Takara公司生产的RNA PCR(AMV)VER 2.1试剂盒说明书操作。然后建立PCR体系25μl反应体系中含1.5μl MgCl2，2.5μl 10×PCR缓冲液(不含Mg-2)，2.0μldNTP(2.5mmol/L)，16.4μl灭菌双蒸水，0.125μlTaq酶(5U/μl)，1.0μl引物混合物(Tamra-PAu，PAd，Tamra-PBu，PBd，Tamra-PCu，PCd各10μmol/L)，0.5μl模板。
PCR程序为94℃预变性2min，然后按94℃45sec，52℃45sec，72℃1min为一个循环，30个循环后，再72℃延伸5min。
PCR扩增产物与多组人轮状病毒检测基因芯片的杂交取适量扩增产物与杂交液等体积混合，杂交液为10×Denhardt′s/0.1％Tween20/10×SSPE。将杂交混合液变性65℃30sec；98℃10min。然后迅速置于冰水浴中。剪下大小合适的HYBRI-Slips杂交盖片(美国Sigma公司)，将杂交混合液吹打混匀并滴在盖片上，反扣于玻片上点制的阵列上，在48-55℃的杂交温度下杂交20-120min。杂交后洗片和信号的扫描以终浓度为2×SSC，0.2％SDS溶液洗片，120rpm，1.5min×2次。再换用2×SSC洗片1min。离心机内将玻片甩干，800rpm，离心5min。由ScanArray 4000基因芯片扫描仪扫片，参数选择FluorophoreTAMRA；Laser Power 80；PFT 80，采集荧光信号后，以分析软件进行荧光定量分析。
本发明所述的同时检测A、B、C三组人轮状病毒的玻璃基因芯片具有如下优点与效果(1)本发明所采用的Tamra荧光标记的上游引物对待检病毒核酸实现扩增和标记，并结合玻璃载片，可以通过使用特定的仪器和软件对杂交信号进行定量分析，提供精确而严谨的数据。
(2)本发明的多组人轮状病毒检测基因芯片使用多重PCR扩增，即在PCR扩增体系中同时加入三组人轮状病毒的上下游引物，能够实现对一组人轮状病毒的检测，也能够实现对两组和三组人轮状病毒的同时扩增检测。
(3)本发明所采用的人轮状病毒组特异性检测探针，能够实现对人轮状病毒的检测和分组鉴定。
(4)本发明所采用的将所有能导致人类腹泻的人轮状病毒A、B、C三组的特异性探针点制在同一个检测微阵列上，能够实现对这三组人轮状病毒的同时检测。
总之，本发明涉及的芯片采用多重PCR扩增方式，可同时用于对多组人轮状病毒的基因检测和组别鉴定，具有广阔的应用前景，有望满足食品卫生监测，疾病预防控制和临床医疗领域对人轮状病毒检测的需要。
图1本发明所述同时检测A、B、C三组人轮状病毒的玻璃基因芯片的探针排布图，其中所述探针排布为a1，a2，b1，b2N-PbP(10μmol/L)；a3，a4，b3，b43×SSC；a5，a6，b5，b6N-PbEC(10μmol/L)；a7，a8，b7，b8N-PbP(10μmol/L)；c1，c2，d1，d2N-PbA1(10μmol/L)；c3，c4，d3，d4N-PbA2(10μmol/L)；c5，c6，d5，d6N-PbB1(10μmol/L)；c7，c8，d7，d8N-PbB2(10μmol/L)；e1，e2，f1，f2N-PbC1(10μmol/L)；e3，e4，f3，f4N-PbC2(10μmol/L)；e5，e6，f5，f6N-PbSA(10μmol/L)；e7，e8，f7，f8N-PbHBV(10μmol/L)；g1，g2，h1，h2N-PbP(10μmol/L)；g3，g4，h3，h43×SSC；g5，g6，h5，h6N-PbPSE(10μmol/L)；g7，g8，h7，h8N-PbP(10μmol/L)。
图2琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物其中所述各泳道是泳道M为核酸分子marker DL2000；泳道1为实施例2中所述对A组人轮状病毒的PCR扩增；泳道2为实施例3中所述对B组人轮状病毒的PCR扩增；泳道3为实施例4中所述对C组人轮状病毒的PCR扩增；泳道4为实施例5中所述对A、B、C三组人轮状病毒的PCR扩增。
图3A组人轮状病毒PCR扩增产物同基因芯片的杂交扫描结果结果显示，A组人轮状病毒PCR扩增产物同芯片上检测A组人轮状病毒的特异性探针杂交后出现阳性结果，同芯片上检测B、C组人轮状病毒的特异性探针杂交则出现阴性结果。阳性对照点的位置上也出现了阳性信号，阴性对照和空白对照点的位置上均出现阴性结果。
图4B组人轮状病毒PCR扩增产物同基因芯片的杂交扫描结果结果显示，B组人轮状病毒PCR扩增产物同芯片上检测B组人轮状病毒的特异性探针杂交后出现阳性结果，同芯片上检测A、C组人轮状病毒的特异性探针杂交则出现阴性结果。阳性对照点的位置上也出现了阳性信号，阴性对照和空白对照点的位置上均出现阴性结果。
图5C组人轮状病毒PCR扩增产物同基因芯片的杂交扫描结果结果显示，C组人轮状病毒PCR扩增产物同芯片上检测C组人轮状病毒的特异性探针杂交后出现阳性结果，同芯片上检测A、B组人轮状病毒的特异性探针杂交则出现阴性结果。阳性对照点的位置上也出现了阳性信号，阴性对照和空白对照点的位置上均出现阴性结果。
图6A、B、C三组人轮状病毒PCR扩增产物同基因芯片的杂交扫描结果结果显示，A、B、C三组人轮状病毒PCR扩增产物同芯片上检测A、B、C三组人轮状病毒的特异性探针杂交后均出现阳性结果。阳性对照点的位置上也出现了阳性信号，阴性对照和空白对照点的位置上均出现阴性结果。
具体实施例方式
下面结合实施例对发明的内容作进一步阐述实施例1本发明所述同时检测A、B、C三组人轮状病毒的玻璃基因芯片的制备(1)玻片处理取未经任何化学修饰的常规玻璃片裸片以体积百分比浓度为10％戊二醛水溶液浸泡1hr，得到醛基化的玻璃片作为芯片的基片；(2)确定探针根据A、B、C三组人轮状病毒基因序列，选择确定了6条人轮状病毒组特异性检测探针，其基因序列是ProbeA15′-ATTTATTGAATGCTTCGATAT-3′ProbeA25′-ACTGGTGAGTGGATTGTTTGA-3′ProbeB15′-ATCCCATTTGAGTAAATTCAG-3′ProbeB25′-ATGATAATTCAGCCAAGCC-3′ProbeC15′-CTGTATTAGCTACATGACCGT-3′ProbeC25′-AGCTATTGGAGTTTGGTAGTT-3′1条阳性对照探针，其基因序列是PbP5′-ATTTATTGAATGCTTCGATAT-3′4条阴性对照探针，其基因序列分别是PbEC5′-GATGAGAATGTGCCTTCGGGAA-3′PbSA5′-GAACATATGTGTAAGTAACTGTGC-3′
PbHBV5′-AGAAAGACCTTTAACCTA-3′PbPSE5′-TAGGTGGTTCAGCAAGTTGGAT-3′(3)芯片制备为了减少杂交时的空间位阻，将上述选择的人轮状病毒组特异性检测探针，阳性对照探针和阴性对照探针，以poly(dT)15作为连接臂，并在探针5′端加入带氨基的六碳基团；得人轮状病毒组特异性检测探针如下N-PbA15′-NH2-(CH2)6-(T)15-ATTTATTGAATGCTTCGATAT-3′N-PbA25′-NH2-(CH2)6-(T)15-ACTGGTGAGTGGATTGTTTGA-3′N-PbB15′-NH2-(CH2)6-(T)15-ATCCCATTTGAGTAAATTCAG-3′N-PbB25′-NH2-(CH2)6-(T)15-ATGATAATTCAGCCAAGCC-3′N-PbC15′-NH2-(CH2)6-(T)15-CTGTATTAGCTACATGACCGT-3′N-PbC25′-NH2-(CH2)6-(T)15-AGCTATTGGAGTTTGGTAGTT-3′以3×SSC作为稀释液将上述探针分别稀释为10μM，以3×SSC为空白对照，以5′-NH2-(CH2)6-(T)15-PbA1-Tamra-3′作为阳性对照(记为N-PbP)，以大肠杆菌特异性探针(记为N-PbEC)，金黄色葡萄球菌特异性探针(记为N-PbSA)，HBV乙肝病毒特异性探针(记为N-PbHBV)，铜绿假单胞菌特异性探针(记为N-PbPSE)作为阴性对照，以生物芯片点样仪Pixsys5500配以SMP3点样针接触式点制在所述醛基化玻璃基片上，取样板中液面高度是5mm，针在取样孔中停留时间是20ms，点样时，针在玻片上的停留时间是50ms，每种探针与对照及空白的点涂层以2×2方式在玻璃基片表面点制4个平行点，其中，阳性对照探针以常规方法在其3′端带上荧光标记，且所述阳性对照探针分布位于点涂层阵列的四角，各点的直径为0.15mm，同种探针或对照或空白点间距为0.4mm；不同探针或对照点间距为0.5mm，点涂层微阵列的大小为3.5mm×3.5mm(详见图1所示)；将点制后的芯片平放于紫外交联仪内，4500J/cm2下交联3min，即得所述同时检测A、B、C三组人轮状病毒的玻璃基因芯片。
实施例2利用本发明所述同时检测A、B、C三组人轮状病毒的玻璃基因芯片检测A组人轮状病毒(1)对人A组人轮状病毒标准毒株RV5和Wa株进行细胞培养，提取培养液上清中的病毒RNA，用Takara公司RNA PCR(AMV)VER 2.1试剂盒说明书操作对RNA进行逆转录反应。然后建立PCR体系25μl反应体系中含1.5μl MgCl2，2.5μl 10×PCR缓冲液(不含Mg-2)，2.0μldNTP(2.5mmol/L)，16.4μl灭菌双蒸水，0.125μlTaq酶(5U/μl)，1.0μl引物混合物(Tamra-PAu，PAd，Tamra-PBu，PBd，Tamra-PCu，PCd各10μmol/L)，0.5μl RT产物。
(2)PCR扩增产物的电泳检测取PCR产物5μl，用含有溴乙锭的1％琼脂糖凝胶进行电泳后观察结果，见图2。
(3)PCR扩增产物同检测多组人轮状病毒的玻璃基因芯片杂交取5μl PCR扩增产物与等体积的10×Denhardt’s/0.1％Tween20/10×SSPE杂交液混合后进行变性65℃30sec；98℃10min。然后迅速置于冰水浴中。剪HYBRI-Slips杂交盖片，约7mm×7mm。将杂交混合液吹打混匀，取5μl于盖片上，反扣于玻片上点制的阵列上。于杂交盒内50℃水浴杂交1hr。
(4)杂交后洗片和信号的扫描以2×SSC，0.2％SDS溶液洗片，120rpm，1.5min×2次。再换用2×SSC洗片1min。离心机内将玻片甩干，800rpm，离心5min。ScanArray 4000基因芯片扫描仪扫片，参数选择FluorophoreTAMRA；Laser Power 80；PFT 80并存储图像(见图3)。
结果显示，A组人轮状病毒PCR扩增产物同芯片上检测A组人轮状病毒的特异性探针杂交后出现阳性结果，同芯片上检测B、C组人轮状病毒的特异性探针杂交则出现阴性结果。阳性对照点的位置上也出现了阳性信号，阴性对照和空白对照点的位置上均出现阴性结果。
实施例3利用本发明所述同时检测A、B、C三组人轮状病毒的玻璃基因芯片检测B组人轮状病毒(1)对人B组人轮状病毒靶核酸序列建立PCR扩增体系25μl反应体系中含1.5μl MgCl2，2.5μl 10×PCR缓冲液(不含Mg-2)，2.0μldNTP(2.5mmol/L)，16.4μl灭菌双蒸水，0.125μlTaq酶(5U/μl)，1.0μl引物混合物(Tamra-PAu，PAd，Tamra-PBu，PBd，Tamra-PCu，PCd各10μmol/L)，0.5μl模板。
PCR程序为94。℃预变性2min，然后按94℃45sec，52℃45sec，72℃1min为一个循环，30个循环后，再72℃延伸5min。
(2)PCR扩增产物的电泳检测取PCR产物5μl，用含有溴乙锭的1％琼脂糖凝胶进行电泳后观察结果，见图2。
(3)PCR扩增产物同检测多组人轮状病毒的玻璃基因芯片杂交取5μlPCR扩增产物与等体积的10×Denhardt’s/0.1％Tween20/10×SSPE杂交液混合后进行变性65℃30sec；98℃10min。然后迅速置于冰水浴中。剪HYBRI-Slips杂交盖片，约7mm×7mm。将杂交混合液吹打混匀，取5μl于盖片上，反扣于玻片上点制的阵列上。于杂交盒内50℃水浴杂交1hr。
(4)杂交后洗片和信号的扫描以2×SSC，0.2％SDS溶液洗片，120rpm，1.5min×2次。再换用2×SSC洗片1min。离心机内将玻片甩干，800rpm，离心5min。ScanArray 4000基因芯片扫描仪扫片，参数选择FluorophoreTAMRA；Laser Power 80；PFT 80并存储图像(见图4)。
结果显示，B组人轮状病毒PCR扩增产物同芯片上检测B组人轮状病毒的特异性探针杂交后出现阳性结果，同芯片上检测A、C组人轮状病毒的特异性探针杂交则出现阴性结果。阳性对照点的位置上也出现了阳性信号，阴性对照和空白对照点的位置上均出现阴性结果。
实施例4利用本发明所述同时检测A、B、C三组人轮状病毒的玻璃基因芯片检测C组人轮状病毒(1)对人C组人轮状病毒靶核酸序列建立PCR扩增体系25μl反应体系中含1.5μl MgCl2，2.5μl 10×PCR缓冲液(不含Mg-2)，2.0μldNTP(2.5mmol/L)，16.4μl灭菌双蒸水，0.125μlTaq酶(5U/μl)，1.0μl引物混合物(Tamra-PAu，PAd，Tamra-PBu，PBd，Tamra-PCu，PCd各10μmol/L)，0.5μl模板。
PCR程序为94℃预变性2min，然后按94℃45sec，52℃45sec，72℃1min为一个循环，30个循环后，再72℃延伸5min。
(2)电泳检测PCR扩增产物取PCR产物5μl，用含有溴乙锭的1％琼脂糖凝胶进行电泳后观察结果，见图2。
(3)PCR扩增产物同检测多组人轮状病毒的玻璃基因芯片杂交取5μl PCR扩增产物与等体积的10×Denhardt’s/0.1％Tween20/10×SSPE杂交液混合后进行变性65℃30sec；98℃10min。然后迅速置于冰水浴中。剪HYBRI-Slips杂交盖片，约7mm×7mm。将杂交混合液吹打混匀，取5μl于盖片上，反扣于玻片上点制的阵列上。于杂交盒内50℃水浴杂交1hr。
(4)杂交后洗片和信号的扫描以2×SSC，0.2％SDS溶液洗片，120rpm，1.5min×2次。再换用2×SSC洗片1min。离心机内将玻片甩干，800rpm，离心5min。ScanArray 4000基因芯片扫描仪扫片，参数选择FluorophoreTAMRA；Laser Power 80；PFT 80并存储图像(见图5)。
结果显示，C组人轮状病毒PCR扩增产物同芯片上检测C组人轮状病毒的特异性探针杂交后出现阳性结果，同芯片上检测A、B组人轮状病毒的特异性探针杂交则出现阴性结果。阳性对照点的位置上也出现了阳性信号，阴性对照和空白对照点的位置上均出现阴性结果。
实施例5利用本发明所述同时检测A、B、C三组人轮状病毒的玻璃基因芯片检测对A、B、C组人轮状病毒(1)对A、B、C三组人轮状病毒靶核酸序列建立多重PCR扩增体系25μl反应体系中含1.5μl MgCl2，2.μl 10×PCR缓冲液(不含Mg-2)，2.0μldNTP(2.5mmol/L)，15.4μl灭菌双蒸水，0.125μlTaq酶(5U/μl)，1.0μl引物混合物(Tamra-PAu，PAd，Tamra-PBu，PBd，Tamra-PCu，PCd各10μmol/L)，三组模板各0.5μl。
PCR程序为94℃预变性2min，然后按94℃45sec，52℃45sec，72℃1min为一个循环，30个循环后，再72℃延伸5min。
(2)电泳检测三组人轮状病毒的多重PCR扩增产物取PCR产物5μl，用含有溴乙锭的1％琼脂糖凝胶进行电泳后观察结果，见图2。
(3)PCR扩增产物同检测多组人轮状病毒的玻璃基因芯片杂交取5μl PCR扩增产物与等体积的10×Denhardt’s/0.1％Tween20/10×SSPE杂交液混合后进行变性65℃30sec；98℃10min。然后迅速置于冰水浴中。剪HYBRI-Slips杂交盖片，约7mm×7mm。将杂交混合液吹打混匀，取5μl于盖片上，反扣于玻片上点制的阵列上。于杂交盒内50℃水浴杂交1hr。
(4)杂交后洗片和信号的扫描以2×SSC，0.2％SDS溶液洗片，120rpm，1.5min×2次。再换用2×SSC洗片1min。离心机内将玻片甩干，800rpm，离心5min。ScanArray 4000基因芯片扫描仪扫片，参数选择FluorophoreTAMRA；Laser Power 80；PFT 80并存储图像(见图6)。
结果显示，A、B、C三组人轮状病毒PCR扩增产物同芯片上检测A、B、C三组人轮状病毒的特异性探针杂交后均出现阳性结果。阳性对照点的位置上也出现了阳性信号，阴性对照和空白对照点的位置上均出现阴性结果。
实施例6利用本发明所述同时检测A、B、C三组人轮状病毒的玻璃基因芯片检测92例临床疑似A组RV感染的婴幼儿腹泻标本(1)婴幼儿腹泻标本中RNA的提取以1×PBS将粪便样本稀释10倍，10000rpm离心2min；取300μl上清，加入30μl 10％SDS，56℃保温30min；加入800μl Trizol试剂，室温放置5min；加入200μl氯仿，涡旋震荡15sec后，室温静置10min；4℃离心，12000rpm离心10min；小心吸取上层液至1.5ml离心管中，加500μl异丙醇，室温下放置10min；4℃离心，12000rpm离心10min；小心吸弃上清，加1ml 75％乙醇(高压灭菌后的0.5‰DEPC水配制)，4℃离心，7500rpm离心5min；弃乙醇，干燥后加20μl 0.5‰DEPC水(已高压灭菌)溶解，-80℃贮存。
(2)PCR扩增用Takara公司RNA PCR(AMV)VER 2.1试剂盒说明书操作对RNA进行逆转录反应。然后建立PCR体系25μl反应体系中含1.5μl MgCl2，2.5μl 10×PCR缓冲液(不含Mg-2)，2.0μldNTP(2.5mmol/L)，15.4μl灭菌双蒸水，0.125μlTaq酶(5U/μl)，1.0μl引物混合物(Tamra-PAu，PAd，Tamra-PBu，PBd，Tamra-PCu，PCd各10μmol/L)，0.5μl RT产物。
PCR程序为94℃预变性2min，然后按94℃45sec，52℃45sec，72℃1min为一个循环，30个循环后，再72℃延伸5min。
(3)PCR扩增产物的电泳检测取PCR产物5μl，用含有溴乙锭的1％琼脂糖凝胶进行电泳后观察结果。
(4)PCR扩增产物同检测多组人轮状病毒的玻璃基因芯片杂交取5μl PCR扩增产物与等体积的10×Denhardt’s/0.1％Tween20/10×SSPE杂交液混合后进行变性65℃30sec；98℃10min。然后迅速置于冰水浴中。剪HYBRI-Slips杂交盖片，约7mm×7mm。将杂交混合液吹打混匀，取5μl于盖片上，反扣于玻片上点制的阵列上。于杂交盒内50℃水浴杂交1hr。
(5)杂交后洗片和信号的扫描以2×SSC，0.2％SDS溶液洗片，120rpm，1.5min×2次。再换用2×SSC洗片1min。离心机内将玻片甩干，800rpm，离心5min。ScanArray 4000基因芯片扫描仪扫片，参数选择FluorophoreTAMRA；Laser Power 80；PFT 80并存储图像。
经上述本发明所建立的同时检测A、B、C三组人轮状病毒的玻璃基因芯片杂交后，检测结果显示A组人轮状病毒检测阳性的有88例，阴性的有4例。
(6)同时对相同的92例临床疑似A组RV感染的婴幼儿腹泻标本进行ELISA试剂盒(深圳安群生物工程公司，生产批号20050115)抗原检测。
检测结果显示78例为ELISA试剂盒抗原检测阳性，14例为阴性。
证明我们所建立的检测多组人轮状病毒的玻璃基因芯片的检测灵敏度高于现在临床上普遍使用的轮状病毒抗原检测试剂盒。
权利要求
1.一种同时检测A、B、C三组人轮状病毒的玻璃基因芯片，包括玻璃基片和阵列式分布的寡核苷酸探针与对照及空白的点涂层，其特征在于，所述的玻璃基片是经醛基化处理的玻璃片；所述的寡核苷酸探针与对照及空白的点涂层分布于玻璃基片上，包括6条不同组别的人轮状病毒组特异性检测探针，1条阳性对照探针，4条阴性对照探针以及空白点样液对照，其中，所述的6条人轮状病毒组特异性检测探针的基因序列是ProbeA15′-ATTTATTGAATGCTTCGATAT-3′ProbeA25′-ACTGGTGAGTGGATTGTTTGA-3′ProbeB15′-ATCCCATTTGAGTAAATTCAG-3′ProbeB25′-ATGATAATTCAGCCAAGCC-3′ProbeC15′-CTGTATTAGCTACATGACCGT-3′ProbeC25′-AGCTATTGGAGTTTGGTAGTT-3′所述1条阳性对照探针的基因序列是PbP5′-ATTTATTGAATGCTTCGATAT-3′所述4条阴性对照探针的基因序列分别是PbEC5′-GATGAGAATGTGCCTTCGGGAA-3′PbSA5′-GAACATATGTGTAAGTAACTGTGC-3′PbHBV5′-AGAAAGACCTTTAACCTA-3′PbPSE5′-TAGGTGGTTCAGCAAGTTGGAT-3′上述的人轮状病毒组特异性检测探针，阳性对照探针和阴性对照探针以poly(dT)15作为连接臂，并在探针5′端加入带氨基的六碳基团，其中，所述阳性对照探针在其3′端带荧光标记；上述每种探针与对照及空白的点涂层以2×2方式在玻璃基片表面点制4个平行点，各点的直径为0.15mm，同种探针或对照或空白点间距为0.4mm；不同探针或对照点间距为0.5mm，点涂层微阵列的大小为3.5mm×3.5mm。
2.如权利要求1所述的同时检测A、B、C三组人轮状病毒的玻璃基因芯片，其特征在于，所述阳性对照探针在其3′端带有的荧光标记是Tamra荧光，且所述阳性对照探针分布位于点涂层阵列的四角。
3.如权利要求1所述的同时检测A、B、C三组人轮状病毒的玻璃基因芯片，其特征在于，所述经醛基化处理的玻璃片是指将未经任何化学修饰的玻璃片裸片以体积百分比浓度为5％-10％戊二醛水溶液浸泡处理制得的玻璃片。
4.权利要求1所述的同时检测A、B、C三组人轮状病毒的玻璃基因芯片的制备方法，其步骤如下(1)玻片处理取未经任何化学修饰的常规玻璃片裸片以体积百分比浓度为5％-10％戊二醛水溶液浸泡0.5～1.5hr，得到醛基化的玻璃片作为芯片的基片；(2)确定探针根据A、B、C三组人轮状病毒基因序列，选择确定了6条人轮状病毒组特异性检测探针，其基因序列是ProbeA15′-ATTTATTGAATGCTTCGATAT-3′ProbeA25′-ACTGGTGAGTGGATTGTTTGA-3′ProbeB15′-ATCCCATTTGAGTAAATTCAG-3′ProbeB25′-ATGATAATTCAGCCAAGCC-3′ProbeC15′-CTGTATTAGCTACATGACCGT-3′ProbeC25′-AGCTATTGGAGTTTGGTAGTT-3′1条阳性对照探针，其基因序列是PbP5′-ATTTATTGAATGCTTCGATAT-3′4条阴性对照探针，其基因序列分别是PbEC5′-GATGAGAATGTGCCTTCGGGAA-3′PbSA5′-GAACATATGTGTAAGTAACTGTGC-3′PbHBV5′-AGAAAGACCTTTAACCTA-3′PbPSE5′-TAGGTGGTTCAGCAAGTTGGAT-3′(3)芯片制备将上述选择的人轮状病毒组特异性检测探针，阳性对照探针和阴性对照探针，以poly(dT)15作为连接臂，并在探针5′端加入带氨基的六碳基团；以3×SSC作为稀释液将上述探针分别稀释为10μM，以点样液为空白对照，以生物芯片点样仪Pixsys5500配以SMP3点样针接触式点制在所述醛基化玻璃基片上，取样板中液面高度是4-6mm，针在取样孔中停留时间是20ms，点样时，针在玻片上的停留时间是50ms，每种探针与对照及空白的点涂层以2×2方式在玻璃基片表面点制4个平行点，其中，阳性对照探针在其3′端带上荧光标记，且所述阳性对照探针分布位于点涂层阵列的四角，各点的直径为0.15mm，同种探针或对照或空白点间距为0.4mm；不同探针或对照点间距为0.5mm，点涂层微阵列的大小为3.5mm×3.5mm；将点制后的芯片平放于紫外交联仪内，4500J/cm2下交联3min，即得所述同时检测A、B、C三组人轮状病毒的玻璃基因芯片。
5.如权利要求4所述的同时检测A、B、C三组人轮状病毒的玻璃基因芯片的制备方法，其特征在于，所述人轮状病毒组特异性检测探针的选择原则是每条探针的解链温度在±3℃以内，以避免发夹和二聚体结构的形成。
6.如权利要求4所述的同时检测A、B、C三组人轮状病毒的玻璃基因芯片的制备方法，其特征在于，所述阳性对照探针在其3′端带上的是以常规方法标记的Tamra荧光。
7.权利要求1所述的同时检测A、B、C三组人轮状病毒的玻璃基因芯片在制备临床诊断试剂中的应用。
8.如权利要求7所述的同时检测A、B、C三组人轮状病毒的玻璃基因芯片在制备临床诊断试剂中的应用，其特征在于，针对A、B、C三组人轮状病毒分别设计的各组特异性上下游引物的序列是A组人轮状病毒上游引物5′-AACGAACAGTATGTTTCATCA-3′下游引物5′-TTGAAGGTCGTGATTGTGTTG-3′B组人轮状病毒上游引物5′-TGGAACATACGAAGTTACAG-3′下游引物5′-TACATCATAGTCTCGATAAAATA-3′C组人轮状病毒上游序列5′-GAAGAGTAGCATCAGGGAC-3′下游引物5′-TAAACGTAAATCATTGATTT-3′
9.如权利要求7或8所述的同时检测A、B、C三组人轮状病毒的玻璃基因芯片在制备临床诊断试剂中的应用，其特征在于，PCR反应中用于标记人轮状病毒组特异性上游引物的荧光标记物是Tamra荧光。
10.如权利要求7或8所述的同时检测A、B、C三组人轮状病毒的玻璃基因芯片在制备临床诊断试剂中的应用，其特征在于，杂交中所使用的杂交液为10×Denhardt’s/0.1％Tween20/10×SSPE。
全文摘要
本发明公开了一种同时检测A、B、C三组人轮状病毒的玻璃基因芯片，包括经醛基化处理的玻璃片和阵列式分布于玻璃基片上的寡核苷酸探针、对照和空白的点涂层，所述点涂层是6条不同组别的人轮状病毒组特异性检测探针，1条阳性对照探针，4条阴性对照探针以及空白点样液对照，并且所述检测探针与对照探针以poly(dT)15作为连接臂，并在探针5′端加入带氨基的六碳基团。本发明还公开了所述芯片的制备方法与该芯片在制备临床诊断试剂中的应用。本发明的芯片采用多重PCR扩增方式，可同时用于对多组人轮状病毒的基因检测和组别鉴定，具有广阔的应用前景，有望满足食品卫生监测，疾病预防控制和临床医疗领域对人轮状病毒检测的需要。
文档编号C12Q1/68GK1772924SQ200510104339
公开日2006年5月17日 申请日期2005年10月26日 优先权日2005年10月26日
发明者黄海燕, 韩金祥, 王健伟 申请人:山东省医药生物技术研究中心