专利名称：基于pcr技术的海带种质纯度检测方法
技术领域：
本发明涉及一种藻类种质鉴定与种质纯度检测的方法，更具体地说是涉及一种基于PCR技术的海带种质纯度检测方法。
背景技术：
良种对农业和海水养殖业发展具有重要的意义。海带优良品种的应用可大幅度提高养殖产量，并且优良品种具备的抗逆、优质等性状使其经济价值也远高于普通品种。因此，进行品种的鉴定和苗种纯度检测对于优良品种的养殖应用和长期使用具有重要的意义和价值。
现有海带品种甄别和苗种的一致性判别主要是通过后期海上养殖，根据成熟个体的藻体长度、宽度、色泽等形态特征进行检测。因其外观表现形态受环境影响较大，不仅在品种区分上存在着很大的难度，并且根据外观形态判别种质纯度也存在无法精确定性和时效性差的问题，造成了多数养殖品种无法进行区分，并且无法验证海带苗种的纯度。因此，以现有方法进行苗种繁育的亲本选育，常造成选种上的混乱、导致繁育的子代苗种发生遗传混杂，丧失了原有的优良经济性状。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于PCR技术的海带种质纯度检测方法，它能够实现在整个生活周期内对海带种质纯度进行精确检测，弥补现有海带种质纯度检测工作的不足。
基于PCR技术的海带种质纯度检测方法，其步骤是提取海带DNA，利用限制性内切酶进行酶切；然后连接扩增引物进行PCR扩增；将扩增后的DNA片段，滴定到与电泳仪相连的电泳槽中进行凝胶电泳，电泳2-8小时后，用凝胶成像仪拍摄电泳图谱。不同分子量与序列差异的DNA片段在电泳图谱上分布于不同的位置，通过比较和分析DNA片段序列差异形成的多态性扩增片段数量及其电泳图谱的位置差异，计算遗传相似度和群体平均杂合度，进行对海带个体间以及世代间种质纯度的判别。
在上述步骤中，也可以在提取海带DNA后，不利用限制性内切酶进行酶切，直接连接扩增引物进行PCR扩增。
本发明的检测方法，具有准确性高、不受被测样品的环境影响、可在海带整个生活周期内进行检测等优点。
图1是不同海带品种经PCR扩增后的DNA片段的电泳图谱。
其中1.生产种；2.本牛种；3.荣福海带；4.福建种海带；5.远杂10号；6.901海带；M是用于纠正实验偏差的标准分子量。
具体实施例方式
下面通过基于PCR技术的随机扩增多态性分析实施例进一步说明本发明。
本实施例的实验材料为不同品种的海带幼苗，是通过成熟的海带孢子体采苗后，根据海带夏苗苗种繁育技术培养出的小叶状体(由于海带幼苗阶段其组织尚未分化，不同海带品种的幼苗外部形态特征高度一致，目前无法进行种质判别以及遗传纯度检测)。
实验方法提取海带DNA，检测DNA纯度和浓度(此步骤为保证实验质量)，然后直接连接扩增引物进行PCR扩增，将扩增后的DNA片段，滴定到与电泳仪相连的电泳槽中进行凝胶电泳，电泳2-8小时后，用凝胶成像仪拍摄电泳图谱。
1.海带核基因组DNA提取称取0.2-0.3g海带叶状体(基部生长点或叶缘)组织，放于研钵(-20℃预冷)中，倒入液氮，并用研杵反复研捣至微细粉末状(期间缓慢注入液氮)。
①.将研磨的实验材料移入5ml的离心管中；加入提取缓冲液(2％CTAB，2M NaCl，20mM EDTA，100mM Tris-HCl(pH＝8.0))，0.2％的β-巯基乙醇，65℃水浴50-60min，缓慢振荡。
②.加入200μg/ml的蛋白酶K(消除提取液中的蛋白质)，50-56℃，2h，约0.5小时振荡一次；离心管加入等体积的氯仿-异戊醇(24∶1)，轻微倒转混匀3min；12000rpm/min常温离心10min，取上清液。
③.上清液中加入2/3体积异丙醇，混匀，-20℃冰箱中半小时沉淀。12000rpm/min常温离心10min，弃上清。
④.加250μl双蒸水溶解，轻微振荡溶解1min，加等体积1mol/L CaCl2溶液轻轻摇匀，放置10min。
⑤.加等体积酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)，轻微倒转混匀1min，12000rpm/min离心10min，取上清。
⑥.加0.5-1μl的RNAase，37℃，30min。
⑦.加等体积氯仿-异戊醇，轻微倒转混匀1min，12000rpm/min，10min；取上清。
⑧.重复上一步骤。
⑨.加入1/10体积的NaAc(3mol/L)和两倍体积的无水乙醇，沉淀DNA，-20℃冰箱中放置2个小时，12000rpm/min常温离心10min，弃上清。
⑩.沉淀用1ml70％乙醇洗涤10min后，吹干，加20-30μl TE缓冲液(pH7.6)溶解。4℃保存待用。
.将提取的DNA溶解进行纯度分析和定量检测利用紫外/可见分光光度计进行DNA纯度分析和定量检测。将提取的DNA溶液分别在260和280nm下检测，分别记录吸收光度值。OD260/OD280值在1.7～1.9范围内基本可满足实验需要。用260nm波长进行分光测定DNA浓度，光径值为1cm，H2O稀释DNA样品，并以H2O为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度DNA(mg/ml)＝50×OD260读数×稀释倍数/1000；其中OD值为1相当于大约50μg/ml双链DNA。
2.PCR扩增反应在PCR扩增仪进行PCR反应。20ul反应体系中含有1.5mM的MgCl2、0.25mM的dNTP、1U/L的TaqDNA聚合酶、0.5μM的引物(引物序列为5’-GTTTCGCTCC-3’)和25ngDNA；反应程序为94℃，4min；94℃(30s)、37℃(90s)、72℃(120s)，40个循环；72℃保温10min。
3.琼脂糖凝胶电泳实验根据DNA定量检测的结果，用H2O稀释PCR扩增产物至200ng/μL备用。
TAE电泳缓冲液50×TAE电泳缓冲液12.2g Tris，2.85ml冰醋酸，10ml 0.25mol/L EDTA(pH8.0)，加水至50ml。
凝胶制备以电泳缓冲液为溶剂，称取1g琼脂糖，加2ml 50×TAE电泳缓冲液和98ml蒸馏水，在电炉或微波炉上溶解，配制成1％琼脂糖凝胶100ml，稍冷后，加5μl 10mg/ml EB，混匀；安装好电泳槽和样品梳，灌胶；琼胶冷却后，在电泳槽内倒入1×TAE电泳缓冲液，取出样品梳。
样品配制与加样10μl扩增后的DNA样品用加2μ1 6×上样缓冲液稀释(6×上样缓冲液含有0.25％二甲苯青FF、0.25％溴酚蓝、30％甘油)，混匀后用微量进样器加样。
电泳连接电极，在100V恒压条件进行电泳，电泳时间为2-8小时，以扩增的DNA条带充分展开为止。
4.结果观察取出凝胶，在凝胶成像仪上观察并自动记录结果。
实验结果如图1所示，通过凝胶电泳图可以直观地观察出不同海带品种的核基因组DNA多态性扩增条带的数量以及分布位置的差别，证实了不同海带之间存在着遗传差异。而且荣福海带3为福建种海带4和远杂10号海带5的杂交子代，其三者电泳图谱也揭示了三者之间遗传上的同质性与遗传差异。
荣福海带3是以福建种海带4和远杂10号海带5为亲本杂交选育出的海带杂交种。如图1所示，荣福海带3总计有4条扩增带，福建种海带4有3条扩增带，而远杂10号5有3条扩增带，其中荣福海带、福建种海带和远杂10号海带的扩增带均为特异性带，是其他海带品种不具有的，这证明在遗传上这3个海带品种与其他品种的差异；而荣福海带、福建种海带和远杂10号海带三者之间有2条扩增带相同的，这说明三者遗传基因较为一致；在荣福海带、福建种海带和远杂10号海带的扩增带中，荣福海带和福建种海带有3条同样的扩增带，荣福海带和远杂10号海带仅有2条同样的扩增带，这说明荣福海带在遗传上更为接近福建种海带，而荣福海带有1条特异性扩增带，是福建种海带和远杂10号海带所不具有的，因此，可以将该扩增带的有无作为荣福海带种质鉴定与检测的直接证据。
权利要求
1.一种基于PCR技术的海带种质纯度检测方法，其特征在于它包括以下步骤(1)提取海带DNA；(2)连接扩增引物进行PCR扩增；(3)将扩增后的DNA片段进行凝胶电泳；(4)比较和分析DNA片段序列差异形成的多态性扩增片段数量及其电泳图谱的位置差异，对海带个体间以及世代间的种质纯度进行判别。
2.根据权利要求1所述的海带种质纯度检测方法，其特征在于提取海带DNA后，利用限制性内切酶进行酶切，然后连接扩增引物进行PCR扩增。
3.根据权利要求1所述的海带种质纯度检测方法，其特征在于对提取的海带DNA还要检测其纯度和浓度。
全文摘要
本发明公开了一种基于PCR技术的海带种质纯度检测方法，其步骤是提取海带DNA；连接扩增引物进行PCR扩增；将扩增后的DNA片段进行凝胶电泳，电泳2－8小时后，用凝胶成像仪拍摄电泳图谱；通过比较和分析DNA片段序列差异形成的多态性扩增片段数量及其电泳图谱的位置差异，对海带个体间以及世代间的种质纯度进行判别。本发明的检测方法，具有准确性高、不受被测样品的环境影响、可在海带整个生活周期内进行检测等优点。
文档编号C12Q1/68GK1769885SQ20051010437
公开日2006年5月10日 申请日期2005年10月28日 优先权日2005年10月28日
发明者刘涛, 崔竞进, 王翔宇, 张晶 申请人:中国海洋大学