专利名称：反向蛋白质芯片的制作方法
技术领域：
本发明涉及反向蛋白质芯片及其制备、检测。蛋白质芯片属于生命科学领域。蛋白质芯片是一种在固态基底上有序排布的蛋白质或多肽阵列，以实现对蛋白质进行并行检测、识别、鉴定和诊断的器件。广泛应用于生物学、医学及其相关领域。
背景技术：
我们以前申请的蛋白质芯片专利，用于免疫分析的蛋白质芯片(申请号01105795.5)，主要技术路线是将待测蛋白质所对应的探针点样于固态基底，然后加待测样品与探针杂交，并加入荧光标记物，最后根据荧光强度判断待测样品中某种待测成分的浓度。这种方法用于抗原、抗体或配体、受体的分析、检测，有非常好的效果，也可用于多样品多指标的检测(见多样品微阵列生物芯片，申请号01112783.X)。
但是，第一，这种方法可检测的样本数有局限，如果用于多样品微阵列生物芯片，由于每个腔室只能检测一个样本，因此上述技术只适用于几个至几十个样本的检测。如果腔室过多，造成的后果，其一为腔室间距很小，操作较困难，容易造成交叉污染；其二为腔室本身空间很小，会增加点样的难度，减少可检测的项目。因此，目前的技术尚不适用于大量样品的检测分析。其次，由于通常采用一种荧光标记，每一个点只能检测一个指标，而生物芯片的目的就是要高度集成，因此，如果能突破一个点只检测一个样本、一个指标的现状，则更能体现生物芯片的有效性。第三，目前的蛋白质芯片应用过程中，需要经过两次杂交，如果能减少杂交次数，必然方便操作使用，减少误差。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可以将一个样品的多种成分的检测集成于同一个点上的反向蛋白质芯片。
本发明的目的通过下述技术方案实现将待测样品点阵于固相载体上，样品中的待测蛋白质或多肽及其他生物分子通过化学键连接于固相载体上而被固定，固相载体表面经过封闭后，加入标记了荧光的探针，与固相生物分子进行杂交反应，洗去未结合的物质后，样品点的荧光强度与样品中待测成分的浓度成正比。
在上述技术方案基础上，所述点阵于固相载体上的待测样品，可以是血清、体液、组织液、组织的细胞裂解液、也可以取细胞培养液、组织培养液，或分子生物学表达产物等；所述探针为待测成分相应的抗体、受体或配体。这样的点样方式，可以同时测大量的样品，密度可以超过每平方厘米100个样品，可以用于大量样本的检测分析，例如大规模体检、筛药、组织分析、不同个体的比较分析、表达分析等。
本发明用一种或多种荧光进行标记，每一种荧光标记一种探针，将多种荧光探针同时与样品点进行杂交，最后用相应于不同荧光标记物的不同的激发波长和发射波长对芯片进行扫描，分别检测到几种荧光的成像。可以将一个样品的多种成分的检测集成于同一个点上，突破了一个点检测一个样品、一种成分的束缚。还可以在这几个成分之间进行比较分析。所加入的荧光探针，亦可以选择具有竞争性的几种探针，让它们竞争性地与某种固相分子结合，以研究该待测标本中某种分子的特性。
其中，固相载体可以是表面带有活化基团的玻璃片，也可以是醋酸纤维薄膜、硝酸纤维薄膜、尼龙膜、硅片、钢片、陶瓷片等。
如果本发明与多样品微阵列生物芯片结合使用，更可以随需要增加检测指标，或做重复性实验等。
本发明的优越性在于第一，可多样品同时检测。反向蛋白质芯片可以把大量的待测样品点阵于固相载体之上，可以同时测大量的样品，密度可以超过每平方厘米100个样品，适用于大量样本的检测分析，例如大规模体检、筛药、比较分析等。第二，采用多种荧光标记，突破了一个点检测一个样品、一种成分的束缚。而且增加了检测结果的应用范围，可以应用于检测多种成分，几种成分的比较，也可以用来研究某种分子的特性。第三，更节省待测样品的量，每个点需要样品量达到纳升级。第四，大量标本的检测操作更简单，更准确，更减少交叉污染。
图1反向蛋白质芯片作用原理图。
图2用反向蛋白质芯片同时进行两种配体-受体的测定。
图3用反向蛋白质芯片进行肿瘤三项综合检查。
具体实施例方式
如图1反向蛋白质芯片作用原理图所示，反向蛋白质芯片，是将待测样品点阵于固相载体上，样品中的待测蛋白质或多肽及其他生物分子通过化学键连接于固相载体上而被固定，固相载体表面经过封闭后，加入标记了荧光的探针，与固相生物分子进行杂交反应，洗去未结合的物质后，样品点的荧光强度与样品中待测成分的浓度成正比。
其中载体材料的选择固相载体可以是表面带有活化基团的玻璃片，也可以是醋酸纤维薄膜、硝酸纤维薄膜、尼龙膜、硅片、钢片、陶瓷片等。
反向蛋白质芯片的点样、制作技术(1)样品的制备采血清、取组织液，或将组织捣碎、裂解后，取细胞裂解液，也可以取细胞培养液、组织培养液，或分子生物学表达产物。(2)用高速点样机器人，根据样品的数量和种类确定点阵的排列方式和点样位置。(3)点样针从多孔板取出样品后直接高密度点阵于固相载体上。(4)室温过夜或37℃温育1小时，以固定样品。(5)在载体表面加上封闭液，37℃温育1小时。(6)用双蒸水充分洗涤并室温干燥。
探针的标记用不同的荧光染料标记不同的探针，除去未结合成分后，将几种标记探针混合。
杂交反应在点好样的芯片上滴加荧光标记探针混合液，37℃避光温育30分钟。洗净并室温晾干。
结果的检测反应结束后，利用专业的芯片扫描分析仪进行结果的判读。具体为针对每一种荧光染料，采用相应的激发波长进行激发，并在相应的发射波长进行扫描。搜集数据，进行分析。
本发明应用例1如图2用反向蛋白质芯片同时进行两种配体-受体的测定，即同时用不同荧光标记的肿瘤坏死因子(TNF)和Fas配体(FasL)检测细胞裂解液中的TNF受体(TNF-R)和Fas。点样阵列为4×4，其中A1、B1为阳性对照，C1、D1为阴性对照，其它为待测标本。左图为检测TNF-R结果，荧光的强弱代表细胞中TNF-R含量的高低；右图为检测Fas结果，荧光的强弱代表细胞中Fas含量的高低。
本发明应用例2如图3用反向蛋白质芯片进行肿瘤三项综合检查。点样方式如应用例1，待测样品为病人血清，探针为相应抗体。左、中、右图分别为甲胎蛋白(AFP)、前列腺特异性抗原(PSA)和癌胚抗原(CEA)指标的检测扫描结果。
权利要求
1，反向蛋白质芯片，是将待测样品点阵于固相载体上，特征在于样品中的待测蛋白质或多肽及其他生物分子通过化学键连接于固相载体上而被固定，固相载体表面经过封闭后，加入标记了荧光的探针，与固相生物分子进行杂交反应，洗去未结合的物质后，样品点的荧光强度与样品中待测成分的浓度成正比。
2，根据权利要求1所述的反向蛋白质芯片，特征在于所述点阵于固相载体上的待测样品，可以是血清、体液、组织液、组织的细胞裂解液、也可以取细胞培养液、组织培养液，或分子生物学表达产物，探针为待测成分相应的抗体、受体或配体。
3，根据权利要求1、2所述的反向蛋白质芯片，特征在于用一种或一种以上荧光染料进行标记，每一种荧光染料标记一种探针，将多种荧光探针同时与样品点进行杂交，最后用相应于不同荧光标记物的不同的激发波长和发射波长对芯片进行扫描，分别检测到几种荧光的成像。
4，根据权利要求1、2所述的反向蛋白质芯片，特征在于固相载体可以是表面带有活化基团的玻璃片，也可以是醋酸纤维薄膜、硝酸纤维薄膜、尼龙膜、硅片、钢片、陶瓷片等。
5，一种反向蛋白质芯片的制备方法，包括样品制备及点样，特征在于样品的制备采血清、取组织液，或将组织捣碎、裂解后，取细胞裂解液，也可以取细胞培养液、组织培养液，或分子生物学表达产物；点样用高速点样机器人，根据样品的数量和种类确定点阵的排列方式和点样位置；点样针从多孔板取出样品后直接高密度点阵于固相载体上；固定样品室温过夜或37℃温育1小时；在载体表面加上封闭液，37℃温育1小时；用双蒸水充分洗涤并室温干燥。
6，一种反向蛋白质芯片的检测方法，利用专业的芯片扫描分析仪进行结果的判读，特征在于针对每一种荧光染料，采用相应的激发波长进行激发，并在相应的发射波长进行扫描、搜集数据、结果分析。
全文摘要
本发明涉及反向蛋白质芯片及其制备、检测。蛋白质芯片属于生命科学领域。广泛应用于生物学、医学及其相关领域。反向蛋白质芯片,样品中的待测蛋白质或多肽及其他生物分子通过化学键连接于固相载体上而被固定,固相载体表面经过封闭后,加入标记了荧光的探针,与固相生物分子进行杂交反应,洗去未结合的物质后,样品点的荧光强度与样品中待测成分的浓度成正比。本发明可以把大量的待测样品点阵于固相载体之上;采用了多种荧光标记,突破了一个点检测一个样品、一种成分的束缚,可以应用于检测多种成分,几种成分的比较,研究某种分子特性;节省待测样品量;大量标本的检测操作更简单、准确,减少交叉污染。
文档编号G01N33/50GK1335506SQ0112648
公开日2002年2月13日 申请日期2001年8月15日 优先权日2001年8月15日
发明者张涛, 李宾, 彭永济, 任一萍 申请人:上海晶泰生物技术有限公司