专利名称：检测变应原蛋白质的方法
技术领域：
本发明涉及一种检测蛋白质的方法，特别涉及一种检测变应原蛋白质的方法。
背景技术：
变应原蛋白质广泛存在于我们的生活环境中。变应原蛋白质显示导致食物变态反应、家尘变态反应、花粉病等的有害作用，并且有时诱导例如过敏反应的致命症状。为了说明变态反应的发作机制并开发一种针对变态反应的保护性方法，广泛地筛选变应原蛋白质是一个重要目标。
作为常规的筛选变应原蛋白质的方法，利用一种基于免疫印迹法的检测方法，它包括将蛋白质转移到膜如硝化纤维类或PVDF上、让蛋白质与变态反应病人血清中的IgE抗体反应以及随后检测结合到蛋白质上的抗体(例如，Weiss，W.等，Electrophoresis，18，826-833(1977))。当利用这种方法时，以极小量存在的变应原蛋白质在转移到膜上后容易损失，表明一些重要的变应原蛋白质可能被忽略并且仍然未得到检测。因此，需要一种不需任何印迹法检测变应原蛋白质的方法。
同时，作为一种检测蛋白质的一般方法，常规地使用一种包括将含有蛋白质的样品进行二维电泳(O’Farrell，P.H.等，Journal ofBiological Chemistry，250，4007-4021(1975))并且通过利用例如银染、染料染色(考马斯染色)、负染色或荧光染色的染色凝胶来显现蛋白质的方法。
另外，还使用一种已知的方法，它包括预先将样品中的蛋白质还原、利用monobromobimane将蛋白质进行荧光标记、将经标记的蛋白质进行二维电泳以及显现荧光信号，由此以高度灵敏性检测蛋白质(Urwin，V.E.，和Jackson，P.，Anal.Biochem.209，57-62(1993))。
但是，没有能够以高度灵敏性检测变应原蛋白质的已知方法。
发明内容
本申请要求日本专利申请号2002-236048的优先权，本文引入它的说明书/附图中的内容。
本发明的一个目的是提供一种以高度灵敏性检测具有二硫键的蛋白质或变应原蛋白质的方法。
作为实现以上目的的透彻研究的结果，我们已开发了一种通过保护侍测样品中的蛋白质的游离SH基、断裂蛋白质的二硫键以暴露形成该键的SH基以及随后检测暴露的SH基，来检测具有二硫键的蛋白质的方法。
基于这些结果完成的本发明如下[1]一种检测具有二硫键的蛋白质的方法，包括通过化学修饰保护待测样品中蛋白质的游离SH基；断裂游离SH基受保护的蛋白质的二硫键以暴露SH基；以及检测暴露的SH基。
在本方法中，优选通过将暴露的SH基与一种SH基标记物质反应以及检测经标记的SH基来检测暴露的SH基。在这种情况中，优选在检测经标记的SH基之前，通过二维电泳分离待测样品中的蛋白质。
在本方法中，特别优选用碘乙酰胺的烷基化作用来化学修饰游离SH基并使用monobromobimane作为一种SH基标记物质。
一种检测变应原蛋白质的方法，该方法利用根据上面[1]的检测具有二硫键的蛋白质的方法。
待测样品的优选的例子包括来自禾本科植物种子、花粉、螨和屋尘的蛋白质提取物。
一种检测具有二硫键的蛋白质或变应原蛋白质的试剂盒，包含一种SH基保护剂和一种SH基检测物质。
一种检测具有二硫键的蛋白质或变应原蛋白质的试剂盒，包含碘乙酰胺和monobromobimane。
和[4]的试剂盒可以进一步包含一种还原剂。
本发明的方法一般能够通过，但不限于，例如下列(A)到(C)的步骤来实施。
图1以示意图表示这些步骤。
(A)将待测样品中的蛋白质与一种SH基保护剂反应的步骤。在该步骤中，蛋白质的游离SH基经化学修饰从而失去其反应性并进入一种被保护的状态(图1[A])。
(B)将游离SH基受保护的蛋白质与一种还原剂反应的步骤。因而，蛋白质的二硫键(在图1中表示为“S-S”)得到断裂，并且形成二硫键的SH基随后被暴露(图1[B])。
(C)将具有暴露的SH基的蛋白质与SH基标记物质反应的步骤，从而仅标记蛋白质的这种暴露的SH基(图1[C])。随后，通过检测经标记的SH基，检测具有暴露的SH基的蛋白质。以这种方式检测的蛋白质鉴定为具有二硫键的蛋白质。
根据本发明的方法，能够以高度灵敏性特定地检测具有二硫键的蛋白质。而且，当将这种检测具有二硫键的蛋白质的方法应用于检测一种变应原蛋白质时，待测样品中的变应原蛋白质能够进行有效地检测。根据本发明的检测变应原蛋白质的方法，通过常规筛选变应原蛋白质的方法难以检测的以极小量存在的变应原蛋白质也能够以高度的灵敏性进行检测。
本发明详述如下。
1.本文所用的基本术语的定义在本说明书中，下列术语根据如下定义的意思进行使用。
(1)“蛋白质”理论上意指一种通过氨基酸之间的缩合而产生的多肽链或肽链。但是，本发明中的“蛋白质”不但包括简单的蛋白质，由它通过水解仅产生氨基酸，也包括缀合的蛋白质，由它通过水解产生氨基酸和除了氨基酸之外的有机物(例如，核蛋白、糖蛋白、脂蛋白、磷蛋白和色蛋白)，和可诱导蛋白质(例如，明胶、蛋白胨和 )。可以对这些蛋白质进行进一步酶学地和化学地修饰。
(2)“具有二硫键的蛋白质”意指一种蛋白质，其中在蛋白质分子内或蛋白质分子间于非还原条件下形成一个二硫键。该二硫键可以是一个在蛋白质中体内形成的二硫键或者可以是一个并非在体内形成的二硫键。
(3)“变应原”意指一种引发人或哺乳动物中变态反应的抗原性物质。“变应原蛋白质”意指一种能够引发人或哺乳动物中变态反应的蛋白质(即，一种作用为变应原的蛋白质)。一种变应原蛋白质可以是由一个基因通过转录和翻译产生的生长蛋白质或其一个片段。此外，一种物质的“变应原性”意指诱导人或哺乳动物中变态反应的能力。
(4)“SH基”意指一种蛋白质的硫氢基。通常，这种基团也可以称为硫羟基或巯基。
2.检测具有二硫键的蛋白质的方法(1)待测样品在本说明书中，将本发明的方法对其进行应用的蛋白质称为“待测样品”。作为一种待测样品，只要它被怀疑含有具有二硫键的蛋白质或变应原蛋白质，任何样品都能够使用。待测样品可以包含一种蛋白质或几种蛋白质。待测样品也可以包含未分离的蛋白质或预先分离的蛋白质。待测样品可以仅由预先分离的蛋白质组成。
待测样品的例子包括食物、药物、医学材料、化妆品、纺织品、建筑材料、环境检测样品(例如，空气、水和土壤样品)、植物样品、动物样品、变应原候选物、已知的变应原、已知的变应原蛋白质和研究样品(例如，预期其中具有二硫键形成的蛋白质)。具体的样品包括但不限于由例如鱼、肉、乳产品(例如，奶、酸牛乳和干酪)、含蛋产品(例如，蛋黄酱、蛋糕和鸡蛋面)、预制食物、调味料、香料、营养补充物、毛产品、羽产品、家尘、螨(例如，粉尘螨(Dermatophagoides farinae)和屋尘螨(Dermatophagoidespteronyssinus))、花粉(例如，香柏花粉和豚草花粉)、食物变应原(例如，禾本科植物如水稻和小麦的种子、荞麦、大豆、清蛋白和奶)、来自动物(例如，狗、猫、小鼠、大鼠、马和牛)的变应原、来自植物(例如，花生和漆树)的变应原、昆虫变应原、寄生虫变应原或霉菌变应原制备的蛋白质提取物。另外的待测样品的例子包括纯化的蛋白质如卵清蛋白、卵类粘蛋白、β-乳球蛋白、α-酪蛋白、螨抗原(例如，粉尘螨抗原)、牛血清清蛋白、胰蛋白酶/淀粉酶抑制物、谷蛋白、α-球蛋白、大豆球蛋白、分离的天然蛋白质、重组蛋白质、具有改变的天然氨基酸序列的蛋白质、合成的蛋白质和变应原候选蛋白质。这些待测样品可以单独使用或可以进行结合并用于一个单一的样品中。
(2)待测样品中蛋白质的游离SH基的保护在本方法中，首先通过化学修饰保护包含在以上2-(1)小节中所述的待测样品中的蛋白质的游离SH基，从而引发游离SH基丧失它们的反应性。本说明书的“游离SH基”意指一种蛋白质中的SH基，它在能够形成二硫键的条件下(例如，非还原性条件如中性或酸性条件)不参与二硫键。
在本发明的方法中，为了保护包含在待测样品中的蛋白质的游离SH基，将一种SH基保护剂加入到待测样品中并使其与蛋白质反应。当加入SH基保护剂时的反应条件没有特别限制，只要它们是非还原性条件。优选将条件调整至适于使用SH基保护剂的条件。
在本发明的方法中，当在二硫键的断裂后检测SH基时，以保护游离SH基起始使得可以只检测形成二硫键的SH基而不会检测到这类游离SH基。
在本说明书中，通过化学修饰保护蛋白质的游离SH基，从而避免相对于游离SH基的反应的物质称为“SH基保护剂”。由这样的SH基保护剂引发的“化学修饰游离SH基”的具体的例子包括硫醇盐的形成、烷基化作用、和伴随着SH基的二硫化物交换的氧化作用。
在本发明中，作为一种SH基保护剂，能够使用如上所述任何化学修饰SH基以保护它们的物质。具体的SH基保护剂的例子包括SH试剂，它用作蛋白质中SH基的保护性修饰剂，以及与蛋白质中的SH基反应以抑制反应性的SH封闭试剂。
具体的SH基保护剂的例子包括，但不限于在下面(1)到(4)中所述的那些(1)一种硫醇盐形成剂，如重金属(例如，汞、银、镉、铅或铜)和重金属化合物(例如，对汞基苯甲酸(PMB)、对氯汞苯甲酸(PCMB)、对汞基苯磺酸(PMBS)、乙酸苯汞(PMA)、二乙汞、4-氯汞-4’-二甲氨基苯、4-氯汞苯偶氮基-β-萘酚、萨利甘酸、S-汞丹磺酰基染料)；(2)一种烷基化剂如卤代烷(例如，碘乙酸或碘乙酰胺)和顺丁烯二酰亚胺衍生物(例如，N-乙基顺丁烯二酰亚胺(NEM))；(3)一种氧化剂如5，5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB，Ellman氏试剂)，4，4-二硫吡啶，2，2’(4，4’)-联吡啶二硫化物、连四硫酸(或连四硫酸盐)、四硝基甲烷、2，6-二氯苯靛酚(DCIP)或氧化型谷胱甘肽；和(4)三氧化二砷和亚砷酸盐本发明的SH基保护剂优选不干扰针对二硫键的还原作用。在游离SH基的保护之后和二硫键的还原处理之前，在使用一种可能干扰还原作用的SH基保护剂情况下，优选例如通过脱盐将残余的SH基保护剂从待测样品中去除。
作为在本发明中的SH基保护剂，优选使用一种烷基化剂，特别优选使用碘乙酰胺(IAA)。
(3)二硫键的断裂随后将蛋白质的二硫键断裂，从而暴露形成二硫键的SH基。优选通过利用一种还原剂还原二硫键来进行二硫键的断裂。为了使用一种还原剂断裂二硫键，根据以上2-(2)小节中所述的对待测样品中蛋白质的游离SH基进行保护，随后引发蛋白质与还原剂反应。还原剂可以在蛋白质的游离SH基和SH基保护剂之间的反应之后加入到待测样品中。但是，只要蛋白质在该蛋白质的自由基保护之后与还原剂反应，就可以在蛋白质的游离SH基与SH基保护剂的反应之前或同时向待测样品加入还原剂。例如，通过与SH基保护剂一起向待测样品加入封闭于可溶性胶囊中的还原剂，游离SH基用一种SH基保护剂加以保护并且随后蛋白质的二硫键被从溶解的胶囊中释放到反应溶液中的还原剂所断裂。
作为一种在本发明中用于断裂二硫键的“还原剂”，可以使用任何能够断裂蛋白质二硫键的物质从而将SH基进行暴露。还原剂的具体例子包括但不限于二硫苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇(DTE)、谷胱甘肽、硫氧还蛋白、谷胱甘肽还原酶、巯基乙醇、三丁基膦、NaBH4、NADPH、巯基乙酸和NO(一氧化氮)。
(4)暴露的SH基的检测随后，检测由二硫键的断裂所暴露的SH基。可以利用一种已知的能够用作检测或量化SH基的方法进行暴露SH基的检测。
例如，通过一种已知的利用一种SH试剂检测SH基的方法，能够检测和/或量化暴露的SH基。这种检测SH基的方法的例子包括电流滴定法，该方法利用暴露的SH基与一种为SH试剂的硫醇盐形成剂的硫醇盐的形成，以及一种量化SH基的方法，该方法包括将对汞基苯甲酸(PMB)、N-乙基顺丁烯二酰亚胺(NEM)、5，5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)等与暴露的SH基反应以及测量由此得到的产物的吸光度。另一个优选使用的SH试剂的例子是4’，4’-双(二甲氨基)二苯基甲醇。
在另一个实施方案中，能够通过将一种SH基结合物质(例如，一种能够结合到SH基上的固相)与具有暴露的SH基的蛋白质反应并且随后检测已结合到蛋白质上的SH基结合物质而对暴露的SH基进行检测和/或量化。或者，也能够通过分离已结合到SH基结合物质上的蛋白质并且检测该蛋白质对具有暴露的SH基的蛋白质进行检测和/或量化。例如，暴露的SH基选择性地结合到能够结合到SH基上的固相(例如，珠、滤器、膜或柱)，只有已结合到固相上的蛋白质从待测样品中得到分离，并且随后可以对分离的蛋白质进行检测。能够结合到SH基上的固相的具体例子包括谷胱甘肽柱(由Pharmacia Corponation制造的谷胱甘肽琼脂糖凝胶柱)以及具有导入其中的顺丁烯二酰亚胺基的磁珠。通过本方法，测量SH基结合物质与蛋白质的结合引起的质量的增加，并且随后能够基于增强的量进行蛋白质二硫键的量化以及二硫键位点的测定。
作为另一个例子，能够通过将SH基标记物质与具有暴露的SH基的蛋白质进行反应以及随后检测经标记的SH基而对暴露的SH基进行检测和/或量化。如本文所用的，“标记”包括但不限于荧光标记、放射性同位素标记、抗体标记以及酶标记。
当使用一种SH基标记物质时，依赖于标记的类型来确定检测标记的方法。当标记为荧光标记时，可以通过例如用荧光检测器检测从标记的蛋白质发出的荧光来检测来目标记的信号，所述蛋白质用紫外光进行照射。荧光信号能够通过利用分光光度计基于相应于荧光波长的吸光度测量荧光量而进行检测。由于荧光在量上一般是高的，所以能够基于定量测定的荧光值(测量值)检测二硫键的数量或二硫键位点。另外，当标记为放射性同位素标记时，能够通过利用液体闪烁计数仪等测量放射性而检测标记的信号。或者，通过放射自显影进行显现，并随后对放射性进行检测以检测标记的信号。当标记为抗体标记时，例如，能够通过将一种特异于用作标记的抗体的抗原与该抗体反应对标记进行检测。另外，当标记为酶标记时，能够通过加入一种酶的底物与酶反应，以及随后检测源自酶反应的显色反应、荧光反应等而对标记进行检测。当使用非荧光性标记时，在检测后对标记的信号量进行定量地测定从而能够由测量值估计二硫键的数量或结合位点。
在本发明的方法中，SH基的荧光标记试剂能够适当地用作SH基标记物质。具体的SH基标记物质的例子包括但不限于monobromobimane、苯并呋咱(benzofurazan)(苯并二唑)衍生物(例如，4-氟-7-氨磺酰苯并呋咱(ABD-F))、氮丙啶如丹磺酰氮丙啶、乙酸荧光素汞(FMA)、S-汞-N-丹磺酰基染料(MDC)、N-(碘乙酰基氨基乙基)-5-萘胺-磺酸(1，5-I-AEANS)及其1，8-异构体、4-氯-7-硝基苯并呋咱(4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑)(NBD-Cl)，和具有导入其中的荧光基团(例如，2-苯基苯并咪唑、荧光素、各种罗丹明以及花青染料)的N-取代顺丁烯二酰亚胺(例如，N-(7-二甲氨基-4-甲基coumarynyl)顺丁烯二酰亚胺(DACM)，N-[4-(6-二甲氨基-2-苯并呋喃基)苯基]顺丁烯二酰亚胺，和花青染料-顺丁烯二酰亚胺)。
在本说明书中，能够用作检测和量化SH基的物质，如上述的SH试剂、SH基结合物质以及SH基标记物质称作“SH基检测物质”。
用于本发明的方法中的SH基检测物质可以是能够用作在以上2-(2)小节中所述的SH基保护剂的任何物质。但是，在本发明的方法中，优选在单一检测系统中使用彼此不同的SH基保护剂和SH基检测物质。而且，例如，为了特异性地检测暴露的SH基，优选通过使用非荧光试剂作为SH基保护剂以及一种荧光试剂作为SH基检测物质，利用SH基检测物质进行检测而不必检测SH基保护剂的保护性修饰。
在本发明的方法中，能够特别优选使用的SH基保护剂和SH基检测物质的结合是作为SH基保护剂的碘乙酰胺和作为SH基检测物质的monobromobimane的结合。
可以在加入还原剂的同时、之前或之后；或在加入SH基保护剂的同时、之前或之后向待测样品中加入一种SH基检测物质，只要在蛋白质的SH基如上所述被暴露后引起SH基检测物质与蛋白质的反应。一个这种情况的例子是SH基检测物质包含在可溶性胶囊等中，将这种SH基检测物质与一种SH基保护剂一起加入到待测样品中以便SH基保护剂化学修饰游离SH基，随后SH基检测物质释放到反应溶液中。在这种情况中，可以使用包含于单个胶囊中的SH基检测物质和还原剂，或包含在分离的胶囊中的SH基检测物质和还原剂，或单独包含在一胶囊中的SH基检测物质。在本说明书中，向待测样品中“加入”一种SH基检测物质的含义不仅包括将SH基检测物质混合入待测样品中，也包括将SH基检测物质与处于其它各种状态的待测样品相接触。例如，“加入”的含义包括，当SH基检测物质为能够结合到SH上的固相物质时，将SH基检测物质置于待测样品中或将待测样品应用于SH基检测物质之上。
用于本发明的SH基检测物质优选是一种物质，它与暴露SH基的反应不受其与SH基保护剂和/或还原剂共存的干扰。但是，当使用一种SH基检测物质，它与SH基的反应受其与SH基保护剂和/或还原剂共存的干扰时，通过在加入SH基检测物质之前的脱盐、蛋白质分离等来去除SH基保护剂和/或还原剂。此外，如果必要，本发明的SH基检测物质可以与辅助剂如着色底物一起加入。
在本发明的方法中，使用SH基检测物质检测暴露的SH基可以通过普通方法进行。当使用这种SH基检测物质检测暴露的SH基时，暴露的SH基被引发与SH基检测物质反应，随后能够对含有多种蛋白质的待测样品直接进行检测。但是，在暴露的SH基与SH基检测物质的反应之后，可以通过一种常规公知的蛋白质分离方法预先分离待测样品，随后可以检测暴露的SH基。例如，可以通过一种本领域技术人员所公知的方法，如一维电泳、二维电泳、高效液相层析(HPLC)、柱层析或质谱分析法对以上待测样品中的蛋白质进行分离。在通过将待测样品进行电泳的蛋白质分离之后，可以在电泳凝胶上进行检测。在通过将待测样品进行高效液相层析(HPLC)的蛋白质分离之后，可以在洗脱的分子量级分中进行检测。在本发明的方法中，特别优选通过二维电泳分离蛋白质，及随后对其进行检测。在应用二维电泳时，有一个益处即不仅蛋白质以高分辨率和高准确度得以分离，随后的对于一个待测样品的检测也能够在一个单一的检测中完成。
在另一实施方案中，如果游离SH基检测物质以及暴露的SH基可以使用一种SH基检测物质进行检测，优选在检测暴露的SH基之前将待测样品中的蛋白质与游离SH基检测物质分离。这种情况的一个例子是发射标记信号的SH基标记物质自身用作SH基标记物质，如具有导入其中的荧光素作为荧光基团的顺丁烯二酰亚胺试剂。而且，当将一种本身为非荧光性的但其通过与SH基反应产生的衍生物为荧光性的物质(例如，具有导入其中作为荧光基团的2-苯基苯并咪唑的N-取代顺丁烯二酰亚胺)用作SH基检测物质时，能够选择性地检测经标记的SH基而不必从游离SH基检测物质中分离蛋白质。
在另一个实施方案中，例如，对吸光度进行测量从而检测和量化暴露的SH基，所述吸光度出现在280nm附近，相应于具有由二硫苏糖醇和二硫键之间的反应产生的分子内S-S键的环状结构，此时将二硫苏糖醇用作还原剂以断裂二硫键。以这种技术，也能够通过检测或量化由二硫键的还原反应产生的产物对暴露的SH基进行检测。
根据本发明的方法，具有二硫键的蛋白质能够通过如上所述对暴露的SH基进行检测而得以鉴定。当通过本发明的方法从待测样品中检测暴露的SH基时，待测样品包含具有二硫键的蛋白质。而且，当在每种由电泳等分离的蛋白质中均检测到暴露的SH基时，该蛋白质具有二硫键。
3.具有二硫键的蛋白质的分离和鉴定随后，能够从待测样品中分离具有二硫键的蛋白质，在所述样品中已检测到暴露的SH基。可以通过本领域技术人员公知的方法分离蛋白质。例如，当已对电泳凝胶检测暴露的SH基时，其中在该凝胶中分离了待测样品中的蛋白质，将其中检测到暴露的SH基的凝胶的每个有关斑点部分切出，随后从凝胶中提取蛋白质。例如，当对一个通过HPLC分离待测样品中的蛋白质所获得的分子量级分进行暴露的SH基的检测时，如果必要，通过一种纯化技术如层析将包含在该级分中的蛋白质进行进一步的纯化。如果包含在该级分中的蛋白质得到充分纯化，该级分可以直接用作一种包含分离的蛋白质的溶液。或者，也可以通过使用本文中所用的标记抗体对以上待测样品或以上级分进行亲和柱纯化而将靶蛋白质分离。此外，当，例如，使用一种能够结合到SH基上的固相物质作为SH基检测物质时，暴露的SH基将选择性结合到能够结合到SH基上的固相(例如，珠、滤器、膜或柱)上，且具有SH基的蛋白质利用该结合从待测样品中进行分离，随后将具有SH基的蛋白质从固相上离解出来，从而获得具有二硫键的蛋白质。如果必要，由此得到的蛋白质也能够由一种纯化技术如层析通过进一步的分离和纯化而分离成每一种蛋白质级分。通过以上分离步骤，能够分离具有二硫键的蛋白质，也能够测定待测样品中的蛋白质的分子量、含量等。
在本发明的方法中，如上所述分离的蛋白质也能够通过进一步的特征描述进行鉴定。在本发明中“鉴定蛋白质”意为将蛋白质分类成已知蛋白质的蛋白质组或属于与已知蛋白质相同类别的蛋白质组。
在本发明中，为了鉴定分离的蛋白质，对蛋白质进行特征描述，并且将由此揭示的特征与已知蛋白质的特征进行比较从而发现在该蛋白质与已知蛋白质之间的共同特征。在本发明中“共同特征”意为与那些已知蛋白质的特征相同的或具有大部分共同性的特征。例如，如果一种特征涉及氨基酸序列，那么在这种情况下“共同特征”会包括具有相同的氨基酸序列或具有与用作比较的蛋白质共享高度同源性的氨基酸序列。另外，在本发明中“特征描述”意为基于电泳结果、部分或完整氨基酸序列的测定、一个编码该蛋白质的基因或cDNA序列的检索和测定、该蛋白质的质谱分析等对一种分离的蛋白质进行该蛋白质的分子量和/或等电点等的确定。为了测定氨基酸序列，优选使用肽酶等部分降解蛋白质并随后通过对每一片段运用Edman降解法而测定内部氨基酸序列。同时，存在多个包含蛋白质的这种特征的数据库(例如，GenBank，PIR，PRF，EMBL，SwissProt和PDBSTR)。通过在这些数据库中检索本发明中分离的蛋白质的特征，能够从数据库中提取已知的与其具有共同特征的蛋白质。当一种具有与本发明所分离的蛋白质的特征相同的特征的已知蛋白质从这些数据库中提取出来时，分离的蛋白质被鉴定为该已知蛋白质。当一种具有与本发明所分离的蛋白质的特征相似的特征的已知蛋白质从这些数据库中提取出来时，分离的蛋白质被分类为与该已知蛋白质相同类别的蛋白质。
如上所述，能够对在本发明中分离的具有二硫键的蛋白质进行鉴定。
4.利用检测具有二硫键蛋白质的方法的另一个实施方案在本发明中，通过利用上述检测具有二硫键的蛋白质的方法，能够显示包含在待测样品中的纯化的特异性蛋白质的二硫键形成的存在或缺失以及二硫键形成位点。
近年来，利用遗传重组技术的蛋白质生产正在积极地进行中。关于利用遗传重组技术的蛋白质生产，一种利用大肠杆菌(Escherichiacoli)作为宿主细胞的方法是普遍性的。但是，由于已知二硫键在大肠杆菌中生产的蛋白质中不正确地形成，所以根据情况使用其它培养细胞，如昆虫细胞来生产重组蛋白质。蛋白质中的二硫键很大程度上参与这类蛋白质的三维结构形成并对蛋白质活性的保持具有重大影响。因而，在利用重组方法的蛋白质生产过程中，确认相应于生产的重组蛋白质的天然蛋白质是否具有二硫键以及鉴定天然蛋白质的二硫键的形成位点对于重组蛋白质的生产是重要的。因此，使用本发明的检测具有二硫键的蛋白质的方法对天然蛋白质的二硫键分析，能够在重组蛋白质的生产中有用。
5.检测变应原蛋白质的方法如在下面实施例中所示，通过以上方法检测的具有二硫键的蛋白质被揭示为变应原蛋白质。因此，根据本发明，能够利用上面检测具有二硫键的蛋白质的方法对待测样品中的变应原蛋白质进行检测。能够通过一种本发明的检测变应原蛋白质的方法检测的变应原蛋白质也与二硫键涉及蛋白质的变应原性的报告相一致(例如，Huby，R.D.等，Toxicological Sciences 55，235-246)。与通过使用IgE抗体的免疫印迹方法进行的常规检测方法相比，本发明的检测变应原蛋白质的方法高度灵敏。
本发明的检测变应原蛋白质的方法可以与以上那些检测具有二硫键的蛋白质的方法相似的方法实施。具体地该方法可以通过下列步骤a)到c)进行a)通过化学修饰保护蛋白质的游离SH基；b)断裂游离SH基受保护的蛋白质的二硫键以暴露形成二硫键的SH基；和c)检测暴露的SH基，其中具有暴露的SH基的蛋白质鉴定为一种变应原蛋白质。
适于应用本发明的检测变应原蛋白质的方法检测变应原蛋白质的待测样品与那些有关以上检测具有二硫键的蛋白质的方法所述的样品相似。更加优选使用一种怀疑含有变应原蛋白质的蛋白质样品作为待测样品。特别优选使用的待测样品的例子包括来自禾本科植物的种子、家尘、花粉、螨等的蛋白质提取物。
为了进行本发明的检测变应原蛋白质的方法，特别优选的具体方法如下(1)向待测样品中加入一种非荧光试剂碘乙酰胺；(2)另外加入二硫苏糖醇作为还原剂；(3)另外加入荧光试剂monobromobimane，随后将得到的反应溶液进行二维电泳分离；和(4)将得到的电泳凝胶用紫外光照射，随后检测获得的对应于变应原蛋白质的荧光斑点。
本方法与常规方法相比尤其具有以下益处。
.能够使用荧光标记检测甚至以极小量存在的变应原蛋白质。
.二维电泳的分离带来蛋白质的较高分析分辨率。
.不需要转移到膜而且损失以极小量存在的蛋白质的危险低。
在本发明的另一个实施方案中，可能通过利用以上检测变应原蛋白质的方法检测待测样品是否具有变应原性。在这种情况下，如果在待测样品中检测到变应原蛋白质，待测样品就确定为具有变应原性。
在另一个实施方案中，通过利用以上检测变应原蛋白质的方法，能够进行来自待测样品中的变应原蛋白质的筛选。在这种情况下，在待测样品中检测的变应原蛋白质的分离步骤中能够筛选包含在待测样品中的变应原蛋白质。在以上具有二硫键的蛋白质的分离中通过普遍公知的方法能够进行蛋白质的分离。
对于如上所述分离的变应原蛋白质，通过特征描述的鉴定能够以一种类似于具有二硫键的蛋白质所用方式的方式进行。具体是，对分离的变应原蛋白质进行特征描述，随后将由此显示的特征与已知变应原蛋白质的特征相比，从而发现在该蛋白质与已知变应原蛋白质之间的共同特征。“共同特征”和“特征描述”的意思与对于以上具有二硫键的蛋白质所述的意思相同。
关于变应原蛋白质特征的信息也可以从数据库等获得(例如，GenBank，PIR，PRF，EMBL，SwissProt、PDBSTR，以及Farrp变应原数据库(http//www.allergenonline.com))。例如，将本发明中分离的变应原蛋白质的特征在这些数据库中进行检索，从而能够从这些数据库中提取具有共同特征的已知变应原蛋白质。当一种具有与分离的变应原蛋白质特征相同的特征的已知变应原蛋白质从这些数据库中提取出来时，分离的变应原蛋白质被鉴定为该已知蛋白质。当一种具有与分离的变应原蛋白质的特征相似特征的已知变应原蛋白质从这些数据库中提取出来时，分离的蛋白质被分类为与该已知变应原蛋白质相同类别的变应原蛋白质。
在变应原蛋白质的鉴定中，本领域一般使用下列方法。具体是，通过Edman降解法测定目标蛋白质的内部氨基酸序列(部分序列)，随后将部分序列作为查询序列在氨基酸数据库中进行检索。如果一种变应原蛋白质的部分序列由数据库中提取出来，所述部分序列与目标蛋白质的部分序列完全相同，目标蛋白质就鉴定为这种由数据库提取的变应原蛋白质。类似地，如果一种与目标蛋白质的部分序列具有同源性的变应原蛋白质的部分序列由数据库中提取出来，该蛋白质就鉴定为与由数据库中提取的变应原蛋白质属于相同类别的变应原蛋白质。在本发明中，还优选在分离的变应原的鉴定中利用这种方法。
6.除检测方法之外的实施方案如本发明所提供的分析蛋白质的任何方法都利用以上“检测具有二硫键的蛋白质的方法”。优选使用一种包含用作检测具有二硫键的蛋白质的SH基保护剂和一种SH基检测物质的试剂盒以实施根据本发明的检测具有二硫键的蛋白质的方法，根据本发明的检测变应原蛋白质的方法，以及任何利用这些方法分析蛋白质的方法。一种检测具有二硫键的蛋白质或变应原蛋白质的试剂盒，它包含一种SH基保护剂和一种SH基检测物质，也包含在本发明的范围中。优选地，该试剂盒包含碘乙酰胺和monobromobimane并用于检测具有二硫键的蛋白质或变应原蛋白质。该试剂盒可以进一步包含一种还原剂，优选二硫苏糖醇。
附图简述图1图示了在本发明的检测具有二硫键的蛋白质的方法所进行的一般步骤。具有二硫键的蛋白质显示于左侧而不具二硫键的蛋白质显示于右侧。每个白圈(○)表示用SH基保护剂进行的SH基的修饰而每个实圈(●)表示用一种SH基标记物质进行的SH基的修饰。[A]蛋白质的游离SH基与SH基保护剂的反应。[B]游离SH基受保护的蛋白质与还原剂的反应。[C]蛋白质的暴露的SH基与SH基标记物质的反应。
图2显示了展现利用水稻种子提取物作为待测样品根据本发明的方法获得的二维电泳的结果照片。照片A显示通过考马斯蓝染色对所有包含的蛋白质进行显现的结果。照片B显示蛋白质荧光检测的结果，其中SH基根据本发明的方法进行了暴露并且随后以monobromobimane进行荧光标记。1-8表示其内部氨基酸序列进行了测定的蛋白质的斑点。
图3显示了展现利用花粉提取物作为待测样品根据本发明的方法获得的二维电泳的结果照片。作为荧光检测的结果用白色表示以monobromobimane进行荧光标记的蛋白质。1-6表示其内部氨基酸序列进行了测定的蛋白质的斑点。
图4显示了展现利用螨提取物作为待测样品根据本发明的方法获得的二维电泳的结果照片。作为荧光检测的结果用白色表示以monobromobimane进行荧光标记的蛋白质。1-3表示其内部氨基酸序列进行了测定的蛋白质的斑点。
图5显示了展现利用大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)和肌红蛋白(Mg)作为待测样品根据本发明的方法获得的二维电泳的结果照片。照片A显示通过考马斯蓝染色对包含在待测样品中的蛋白质进行显现的结果。照片B显示蛋白质荧光检测的结果，其中显露的SH基以monobromobimane进行荧光标记。
实施发明的最佳方式下面将通过参考实施例对本发明进行详细描述。但是，这些实施例并不限制本发明的范围。
实施例1在水稻提取物中具有二硫键的蛋白质的检测使用研钵研磨20克的水稻种子。将粉末放入400ml的1M氯化钠溶液中并且随后搅动1小时，从而在缓冲液中由种子提取蛋白质。将溶液于14,000g离心5分钟以沉淀不溶性组分后，收集上清液。通过透析将上清液脱盐并随后进行冷冻干燥。将1/80量的冷冻干燥产品(等价于0.25克的水稻种子)溶于缓冲液中以进行等电聚焦(8M尿素、0.5％CHAPS和0.1％Bio-Lytes)。将碘乙酰胺作为SH基保护剂加入到溶液中(终浓度5mM)，并随后将溶液于室温温育1小时。接下来，将二硫苏糖醇作为还原剂加入到溶液中(终浓度5mM)，并随后将溶液于室温温育1小时。另外，将monobromobimane作为SH基标记物质加入到溶液中(终浓度10mM)，并随后将溶液于室温温育15分钟。
将如上所述获得的反应溶液进行二维电泳，由此分离在反应溶液中的蛋白质。
使用PROTEAN IEF Cell System(Bio-Rad Laboratories Inc.)根据生产商的说明进行一维电泳。电泳在上限8,000V和电压-时间积分值35,000VH的条件下进行6小时。电泳后，将得到的凝胶浸入在含有62.5mM Tris-HCl缓冲液、5％巯基乙醇、2％SDS和5％蔗糖的缓冲液中10分钟，随后进行二维电泳。
根据Laemmli’s技术进行二维电泳(Laemmli，U.K.，Nature，227，680-685(1970))。使用含有375mM Tris/甘氨酸缓冲液和具有从10％到20％的浓度梯度的丙烯酰胺凝胶。使用含有0.1％SDS的25mMTris/甘氨酸缓冲液作为运行缓冲液。电泳于250V进行3小时。
对于由此获得的电泳凝胶，使用荧光检测器(FAS-2525，TOYOBO)检测荧光信号。在凝胶上荧光检测的斑点对应于以monobromobimane荧光标记的蛋白质(图2B)。在图2B中，发现了例如表示为1-6的荧光斑点。
此外，在该实施例中，所有蛋白质由考马斯蓝染色进行检测(图2A)以作为对照实验。在图2A中，发现了例如表示为1-8的染色斑点。
当比较图2A和图2B时，图2B中的每个染色斑点1-6都被发现位于相应于图2A中所示的每个染色斑点1-6的位置上。即，显示了相应于斑点1-6的蛋白质是具有二硫键的蛋白质。这些结果提示存在于斑点1-6上的蛋白质为变应原蛋白质。
另一方面，对于图2A中的染色斑点7和8，在图2B的相应位置上没有发现荧光斑点。因而，提示相应于斑点7和8的蛋白质不是变应原蛋白质。
实施例2包含在水稻提取物中的变应原蛋白质的分析将图2B中检测到荧光信号的斑点1-6从凝胶上切下并且随后用胰蛋白酶在凝胶内进行消化，从而使斑点中的蛋白质片段化。在将片段化的蛋白质进行HPLC分离之后，通过Edman法测定内部氨基酸序列。由此测定的每个斑点中的蛋白质的内部氨基酸序列显示于表1中。显示于表1中的内部氨基酸序列中的“CmRRr”表示具有以monobromobimane经标记的SH基的半胱氨酸残基。接下来，在氨基酸序列数据库(GenBank和PIR)中利用FASTA程序和BLAST程序将每个内部氨基酸序列作为查询序列进行同源性检索。检索结果显示来自每个斑点的蛋白质的内部氨基酸序列都与一种已知的变应原蛋白质的部分氨基酸序列相同或具有高度同源性(表1)。
表1
如表1中所示，相应于斑点2-6的蛋白质的内部氨基酸序列与已知变应原蛋白质的部分氨基酸序列100％匹配，所述已知变应原蛋白质作为与其具有高度同源性的蛋白质由数据库中提取。因此，斑点2-6的蛋白质鉴定为已知的变应原蛋白质。同时，斑点1的一个内部氨基酸序列与一种已知为变应原蛋白质的胰蛋白酶/淀粉酶抑制物的部分氨基酸序列(SEQ ID NO1)具有77.8％的同源性，所述胰蛋白酶/淀粉酶抑制物作为与其具有高度同源性的蛋白质由数据库中提取。另外，对于相应于斑点的1的另外两个内部氨基酸序列(SEQ ID NO2和SEQ ID NO3)，没有与其具有高度同源性的蛋白质由数据库中提取出来(在表1中以n.d.表示)。因此，据推理斑点1的蛋白质属于与胰蛋白酶/淀粉酶抑制物相同类别的变应原蛋白质，但为一种未知的变应原蛋白质。
如上所述，在水稻提取物中含有的具有二硫键的蛋白质已经根据本发明的方法进行了荧光检测并能够鉴定为未知的变应原蛋白质(斑点1)或已知的变应原蛋白质(斑点2-6)，所述未知的变应原蛋白质属于与已知变应原蛋白质类别相同的变应源蛋白质。
实施例3花粉提取物中具有二硫键的蛋白质的检测用研钵将豚草(三裂叶豚草(Ambrosia trifida))花粉在含有1mMPASF和1mM EDTA的100mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中研磨，并且随后将产物于14,000g离心30分钟。离心后，收集上清液，过滤通过Ultrafree-Cl离心滤器(Millipore)，并且随后通过MicroconYM-10离心滤器进行脱盐。将脱盐后的残余物溶于缓冲液中进行等电聚焦(8M尿素、0.5％CHAPS和0.1％Bio-Lytes)。将碘乙酰胺作为SH基保护剂加入到溶液中(终浓度5mM)，随后将溶液于室温温育1小时。另外，将二硫苏糖醇作为还原剂加入(终浓度5mM)并与溶液混合，随后将溶液于室温温育1小时。另外，将monobromobimane作为SH基标记物质加入(终浓度10mM)并与溶液混合，随后将溶液于室温温育15分钟。将由此获得的反应溶液进行二维电泳，以与实施例1中相似的方式分离反应溶液中的蛋白质，随后利用荧光检测器检测荧光信号(图3)。
实施例4包含在花粉提取物中的变应原蛋白质的分析将图3中检测到荧光信号的斑点1-6从凝胶上切下，并且随后以与实施例2相似的方式测定蛋白质的内部氨基酸序列。随后，以与实施例2相似的方式对内部氨基酸序列进行同源性检索。检索结果显示来自每个斑点的蛋白质的内部氨基酸序列都与已知的变应原蛋白质的部分氨基酸序列具有高度同源性(表2)。
表2
如表2中所示，相应于斑点1的蛋白质的内部氨基酸序列与一种富含半胱氨酸的抗真菌蛋白质的部分氨基酸序列具有81.8％的同源性，所述富含半胱氨酸的抗真菌蛋白质作为具有高度同源性的蛋白质由数据库中提取。另外，相应于斑点的2的蛋白质的内部氨基酸序列与一种花药特异性蛋白质SF18的部分氨基酸序列具有87.5％的同源性，所述花药特异性蛋白质SF18作为具有高度同源性的蛋白质由数据库中提取。已知富含半胱氨酸的抗真菌蛋白质和花药特异性蛋白质SF18都属于变应原的防卫素家族。因此，显示斑点1的蛋白质和斑点2的蛋白质分别与富含半胱氨酸的抗真菌蛋白质和花药特异性蛋白质SF18属于相同类别。而且，相应于斑点3的蛋白质的内部氨基酸序列与变应原ABA-1的部分氨基酸序列具有66.7％的同源性，所述变应原ABA-1作为与其具有高度同源性的蛋白质由数据库中提取。因此，显示斑点3的蛋白质是与变应原ABA-1属于相同类别的变应原蛋白质。对于分别相应于斑点4-6的蛋白质的内部氨基酸序列，没有与其具有高度同源性的蛋白质由数据库中提取出来(在表2中以n.d.表示)。这提示斑点4-6的蛋白质是新的变应原蛋白质。
实施例5螨提取物中的具有二硫键的蛋白质的检测用研钵将屋尘螨在含有1mM PASF和1mM EDTA的100mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中研磨。将产物于14,000g离心30分钟。离心后，收集上清液，过滤通过Ultrafree-Cl离心滤器(Millipore)，并且随后通过Microcon YM-10离心滤器进行脱盐。将脱盐后的残余物溶于缓冲液中进行等电聚焦(8M尿素、0.5％CHAPS和0.1％Bio-Lytes)。将碘乙酰胺作为SH基保护剂加入到溶液中(终浓度5mM)，随后将溶液于室温温育1小时。另外，将二硫苏糖醇作为还原剂加入(终浓度5mM)，随后将溶液于室温温育1小时。随后，将monobromobimane作为SH基标记物质加入(终浓度10mM)，随后将溶液于室温温育15分钟。将由此获得的反应溶液进行二维电泳，以与实施例1中相似的方式分离反应溶液中的蛋白质，随后利用荧光检测器检测荧光信号(图4)。
实施例6包含于螨提取物中的变应原蛋白质的分析将图4中检测到荧光信号的斑点1-3从凝胶上切下，并且随后以与实施例2相似的方式测定蛋白质的内部氨基酸序列。随后，以与实施例2相似的方式对内部氨基酸序列进行同源性检索。检索结果显示来自每个斑点的蛋白质的内部氨基酸序列都与每种已知的变应原蛋白质的部分氨基酸序列具有高度同源性(表3)。
表3
如表3中所示，相应于斑点1和2的蛋白质的内部氨基酸序列与一种已知变应原螨变应原DER P2的部分氨基酸序列具有100％同源性，所述螨变应原DER P2作为与其具有高度同源性的蛋白质由数据库中提取。另外，相应于斑点3的蛋白质的内部氨基酸序列与一种已知变应原螨变应原GLY D2的部分氨基酸序列具有80％同源性，所述螨变应原GLY D2作为与其具有高度同源性的蛋白质由数据库中提取。因此，显示斑点3的蛋白质是一种属于与螨变应原GLY D2相同类别的变应原蛋白质。
如上所述，在螨提取物中含有的具有二硫键的蛋白质已经通过本发明的方法进行了荧光检测，并能够鉴定为已知的变应原蛋白质(斑点1和2)或未知的变应原蛋白质(斑点3)，所述未知的变应原蛋白质属于与已知变应原蛋白质类别相同的变应原蛋白质。
实施例7利用模式蛋白质检测将50pmol的大豆胰蛋白酶抑制物(STI)、具有一个自由半胱氨酸残基(即，一个游离SH基)和两个分子内二硫键的变应原蛋白质以及250pmol的无二硫键并具有一个自由半胱氨酸残基(即，一个游离SH基)的肌红蛋白(Mg)蛋白质，分别与10μl含有62.5mM Tris-HCl缓冲液(pH6.8)和2％SDS的溶液混合。将碘乙酰胺作为SH基保护剂加入到溶液中(终浓度5mM)，随后将溶液于室温温育1小时。接下来，将二硫苏糖醇作为还原剂加入到溶液中(终浓度5mM)，随后将溶液于室温温育1小时。另外，将monobromobimane作为SH基标记物质加入到溶液中(终浓度10mM)，随后将溶液于室温温育15分钟。将由此获得的反应溶液进行SDS-PAGE以分离反应溶液中的蛋白质。根据Laemmli’s的方法以与实施例1相似的方式进行SDS-PAGE。
当通过考马斯蓝染色对所有的蛋白质进行检测时，STI和Mg蛋白质都以与每种蛋白质的量一致的方式进行检测(STI50pmol而Mg250pmol)(图5A)。相反地，当检测通过以荧光物质monobromobimane标记蛋白质进行时，只检测到具有分子内二硫键的变应原STI，而只具有自由半胱氨酸残基却没有二硫键的Mg则没有检测到(图5B)。据认为，如果不仅形成二硫键的SH基而且自由半胱氨酸残基的SH基都一起以monobromobimane通过本发明的方法进行标记，那么应该以相同的荧光强度检测出两种类型的SH基。因此，通过本发明的方法只有STI蛋白质被检测到的结果提示只有形成STI蛋白质中的分子内二硫键的SH基以monobromobimane进行了标记。
由以上结果，显示具有二硫键的蛋白质(即，变应原蛋白质)能够通过本发明的方法进行特异性地检测。
工业实用性本发明提供了一种以高度灵敏性检测待测样品中具有二硫键的蛋白质的方法以及一种以高度灵敏性检测待测样品中变应原蛋白质的方法。根据本发明的方法，具有二硫键的蛋白质或变应原蛋白质不仅能够进行特异性地检测、分离和/或鉴定，也能够以高度灵敏性进行分析而不会损失以极小量存在的蛋白质。
本文引入所有在此引用的出版物、专利和专利申请的全部内容作为参考。
序列表序列表<110>国家农业研究组织<120>检测变应原蛋白质的方法<130>PH-1779-PCT<140>PCT/JP2003/008668<141>2003-08-07<150>JP 2002-236048<151>2002-08-13<160>18<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>9<212>PRT<213>水稻<220>
<223>发明人Yano，Hiroyuki；Kuroda，Shigeru<400>1Cys Asp Ala Leu Ser Val Leu Val Arg1 5<210>2<211>8<212>PRT<213>水稻<400>2Gln Leu Leu Glu Pro Cys Cys Arg1 5<210>3<211>18<212>PRT
<213>水稻<400>3Cys Asn Leu Gln His Thr Gly Phe Phe Gly Cys Pro Met Phe Gly Gly1 5 10 15Gly Met<210>4<211>12<212>PRT<213>水稻<400>4Leu Ser Glu Ala Leu Gly Val Ser Ser Gln Val Ala1 5 10<210>5<211>8<212>PRT<213>水稻<400>5Leu Gln Ala Phe Glu Pro Ile Arg1 5<210> 6<211>8<212>PRT<213>水稻<400>6Asp Phe Leu Leu Ala Gly Asn Lys1 5<210>7<211>12<212>PRT<213>水稻
<400>7Ser Gln Ala Gly Thr Thr Glu Phe Phe Asp Val Ser1 5 10<210>8<211>12<212>PRT<213>水稻<400>8Val Glu Pro Gln Gln Cys Ser Ile Phe Ala Ala Gly1 5 10<210>9<211>11<212>PRT<213>水稻<400>9Val Ile Gln Pro Gln Gly Leu Leu Val Pro Arg1 5 10<210>10<211>11<212>PRT<213>三裂叶豚草<220>
<221>不清楚<222>9<223>不清楚<400>10Leu Cys Glu Lys Pro Ser Leu Thr Xaa Ser Gly1 5 10<210>11<211>8<212>PRT
<213>三裂叶豚草<400>11Cys Ile Glu Trp Glu Gly Ala Lys1 5<210>12<211>9<212>PRT<213>三裂叶豚草<400>12Val Asp His Ile Val Gly Glu Glu Lys1 5<210>13<211>10<212>PRT<213>三裂叶豚草<400>13Gly Asp Phe Pro Val Phe Tyr Val Thr Lys1 5 10<210>14<211>12<212>PRT<213>三裂叶豚草<400>14Gln Ile Ala Gln Gly Asp Glu Leu Val Phe Asn Tyr1 5 10<210>15<211>11<212>PRT<213>三裂叶豚草<400>15Gln Ile Val Gln Gly Asp Glu Leu Val Phe Lys
1 5 10<210>16<211>7<212>PRT<213>屋尘螨<400>16Tyr Thr Trp Asn Val Pro Lys1 5<210>17<211>12<212>PRT<213>屋尘螨<400>17Gly Lys Pro Phe Gln Leu Glu Ala Val Phe Glu Ala1 5 10<210>18<211>10<212>PRT<213>屋尘螨<400>18Phe Ile Asp Cys Gly His Asn Glu Val Lys1 5 10权利要求
1.一种检测具有二硫键的蛋白质的方法，包括通过化学修饰保护待测样品中的蛋白质的游离SH基；断裂游离SH基受保护的蛋白质的二硫键以暴露SH基；和检测暴露的SH基。
2.权利要求1的方法，其中通过将暴露的SH基与SH基标记物质反应并检测经标记的SH基而对暴露的SH基进行检测。
3.权利要求2的方法，其中在检测经标记的SH基之前，通过二维电泳分离待测样品中的蛋白质。
4.权利要求2或3的方法，其中通过碘乙酰胺的烷基化作用进行化学修饰并且SH基标记物质为monobromobimane。
5.一种检测变应原蛋白质的方法，包括通过化学修饰保护待测样品中的蛋白质的游离SH基；断裂游离SH基受保护的蛋白质的二硫键以暴露SH基；和检测暴露的SH基。
6.权利要求5的方法，其中通过将暴露的SH基与一种SH基标记物质反应并检测经标记的SH基而对暴露的SH基进行检测。
7.权利要求6的方法，其中在检测经标记的SH基之前，通过二维电泳分离待测样品中的蛋白质。
8.权利要求6或7的方法，其中通过碘乙酰胺的烷基化作用进行化学修饰并且SH基标记物质为monobromobimane。
9.权利要求5-8任一项的方法，其中待测样品为来自禾本科植物的种子、花粉、螨或家尘的蛋白质提取物。
10.一种检测具有二硫键的蛋白质或变应原蛋白质的试剂盒，其包含一种SH基保护剂和一种SH基检测物质。
11.一种检测有二硫键的蛋白质或变应原蛋白质的试剂盒，其包含碘乙酰胺和monobromobimane。
12.权利要求10或11的试剂盒，还包含一种还原剂。
全文摘要
本发明涉及一种检测具有二硫键的蛋白质或变应原蛋白质的方法，包括通过化学修饰保护待测样品中的蛋白质的游离SH基；断裂SH基被保护的蛋白质的二硫键以暴露SH基；和检测暴露的SH基。
文档编号G01N27/447GK1688886SQ0382416
公开日2005年10月26日 申请日期2003年7月8日 优先权日2002年8月13日
发明者矢野裕之, 黑田秧 申请人:独立行政法人农业.生物系特定产业技术研究机构