专利名称：一种蛋白质含量检测方法
技术领域：
本发明属于生物化学分析检测技术领域，具体涉及一种蛋白质含量检测方法。
背景技术：
常规蛋白质浓度的检测方法主要有Lowry法、BCA(Bicinchoninic acid)法和 Bradford法。Lowry法主要依据是碱性条件下Cu2+与肽骨架的-CO-NH-基团形成蓝色络合物，然后将福林酚试剂中的鳞钨酸和鳞钼酸还原为钨和钼蓝进一步呈色的结果。BCA方法是利用BCA能够与Lowry法第一步反应形成的Cu+结合而生成的蓝紫色复合物来测定的。 Bradford法的依据是染料考马斯亮蓝G-250能够与蛋白质或分子量3 kD以上的肽中的赖氨酸和精氨酸结合形成有色物。这三种常用方法都是利用发色物质颜色的深浅与蛋白质浓度间存在线性关系而绘制标准曲线来测定样品中蛋白浓度的，但在实际应用中都有局限。Lowry法操作繁琐，而且还会受到很多化学成分的影响，例如表面活性剂Triton X-100或SDS含量仅达时，或者金属离子螯合剂EDTA浓度达到10 mM时，或者尿素含量达3 M,或者硫酸铵浓度达0. 25 M等就会严重干扰检测结果；虽然BCA方法受表面活性剂干扰影响小，但对还原剂、金属离子螯合剂以及硫酸铵的存在很敏感。Bradford方法操作简单，但与Lowry法类似，对表面活性剂的耐受性差，当0. 1% SDS或者0. 5%的TritonX-IOO 存在时，蛋白质样品吸光值会受到较大影响。所以这些方法的具体使用总会因为测定液或者蛋白质裂解液的构成而局限，或者说，如果有干扰物质存在，蛋白质浓度测定就需要针对不同的干扰物质采取不同的方法，这样给蛋白质含量测定带来不便。因此，基于上述需要，本发明是上述方法为基础，提高了对表面活性剂、还原剂、金属离子螯合剂等干扰物质的耐受性，而且也是具有较好稳定性的蛋白质检测方法。英文缩写、全称及中文对照
DTTDithiothretol/ 二硫苏糖醇
EDTAEthylene Diamine Tetraacetic Acid/乙二胺四乙酸
EGTAEthylene Glycol Tetraacetic Acid/乙二醇二乙醚二胺四乙酸
β -MEβ-Mercaptoethanol/ β-巯基乙醇
NP-40Nonidet Ρ-40/乙基苯基聚乙二醇
SDSSodium Dodecyl Sulfate/ 十二烧基硫酸钠
BSABovine serum albumin/牛血清蛋白。
发明内容
本发明为提高蛋白质检测对表面活性剂如SDS、TritonX-100和NP-40，还原剂DTT 和β -巯基乙醇，螯合剂EDTA和EGTA以及含氮化合物硫酸铵和尿素等干扰物质的包容性， 提供一种简单、快速而稳定性好的蛋白质浓度检测方法。本发明所述的蛋白质含量检测方法，流程如
图11所示，包括如下步骤
1)标准蛋白溶液的制备称取牛血清蛋白(BSA)溶解于蒸馏水中，将终浓度调配为4
3mg/mL，即为配制的标准蛋白溶液样品；
2)试剂配制试剂①碳酸钠1. 89 ι氢氧化钠1. 00 ι试剂②酒石酸钠0. 25 ι硫酸铜0. 125SDS2. 5 %
配制试剂②时，先将酒石酸钠和硫酸铜混合静置后再加入SDS ； 试剂③
将2 N福林酚溶液稀释，然后调整pH为1，最后定容至10倍体积； 3)检测蛋白质含量
将配制好的标准蛋白溶液按照二倍稀释法采用蒸馏水稀释至不同梯度浓度，然后于 96孔细胞培养板或者试管中分别加入同体积的标准蛋白溶液各梯度样品、待测样品、蒸馏水；
将试剂①和试剂②以50/1的体积比混合配成混合液，向上述96孔或者试管中分别加入样品体积5倍的试剂①和试剂②的混合液；再分别加入样品体积40倍的试剂③，混合均勻，在室温下放置30 min，在570-630 nm范围任一波长下测定吸光值，根据标准蛋白溶液各梯度样品对应的数据绘制标准曲线，并推定线性回归方程，再将待测样品吸光值导入标准曲线回归方程计算样品中蛋白质含量。本发明步骤3)中检测蛋白质含量的标准流程(微孔法和标准试管法)将配制完成的BSA标准蛋白溶液按照二倍稀释法采用蒸馏水稀释至最低浓度为0. 0625 mg/mL的7 个梯度浓度，然后于96孔细胞培养板或者试管中分别加入5 yL或者100 yL的BSA标准溶液各梯度样品，空白对照为同体积的蒸馏水。另外按照标准蛋白溶液同样体积将0. 1-4 mg/mL浓度区间的蛋白样品分别加入96孔板或者试管中，每个标准或者待测样品至少有3 个重复样；
根据实际计算所需用量按照2)试剂配制说明准备试剂①和试剂②的混合液，对96孔或者试管内各样品需分别加入25 μ L或者500 μ L的试剂①和试剂②的混合液；
然后于96孔或试管各样品中分别加入200 yL或者4 mL试剂③，混合均勻，在室温下放置30 min，在570-630 nm范围任一波长下测定吸光值。微孔法样品可直接利用酶标仪进行测定，试管法样品则将1 mL发色液倒入塑料比色杯在分光光度计中进行检测。获得数据后绘制标准曲线，并推定线性回归方程，再将待测样品吸光值导入标准曲线回归方程计算样品中蛋白质含量。本发明是在Lowry法基础上进行改进完善的。Lowry法是首先在蛋白质样品溶液加入NaOH溶液而使之处于碱性条件下，然后与现配的由2% Na2CO3:1% CuS04:2%酒石酸钾钠(100/1/1)组成的混合液混合，室温放置10 min，再加入福林酚试剂放置30-60 min，于 550 nm波长测定吸光度。本发明将Lowry法的第一步和第二步反应试剂做了重新安排，并且加入了表面活性剂成分SDS。此外，第三步反应步骤没有直接使用福林酚试剂，而是将其稀释使用，检测吸光值的波长处于570-630 nm之间都可以，以590 nm为最佳，且发色液可以保持数小时内没有显著变化。本发明是对干扰物质耐受性好及发色液稳定的蛋白质检测方法。 本发明以Lowry法为基础，结合三种常规蛋白质浓度测定方法的优点，绘制的标准曲线线性关系好，对干扰物质耐受性提高，见表1 表1.已测试的常见干扰物质及最大抗干扰浓度
权利要求
1. 一种蛋白质含量检测方法，包括如下步骤1)标准蛋白溶液的制备称取牛血清蛋白溶解于蒸馏水中，将终浓度调配为4 mg/mL, 即为配制的标准蛋白溶液样品；2)试剂配制试剂①碳酸钠1. 89 ι氢氧化钠1. 00 ι试剂②酒石酸钠0. 25 ι硫酸铜0. 125SDS2. 5 %配制试剂②时，先将酒石酸钠和硫酸铜混合静置后再加入SDS ； 试剂③将2 N福林酚溶液稀释，然后调整pH为1，最后定容至10倍体积； 检测蛋白质含量将配制好的标准蛋白溶液按照二倍稀释法采用蒸馏水稀释至不同梯度浓度，然后于 96孔细胞培养板或者试管中分别加入同体积的标准蛋白溶液各梯度样品、待测样品、蒸馏水；将试剂①和试剂②以50/1的体积比混合配成混合液，向上述96孔或者试管中分别加入样品体积5倍的试剂①和试剂②的混合液；再分别加入样品体积40倍的试剂③，混合均勻，在室温下放置30 min，在570-630 nm范围任一波长下测定吸光值，根据标准蛋白溶液各梯度样品对应的数据绘制标准曲线，并推定线性回归方程，再将待测样品吸光值导入标准曲线回归方程计算样品中蛋白质含量。
2.根据权利要求1所述的蛋白质含量检测方法，其特征在于，步骤3)中待测样品在检测前浓度调整至0. 1-4 mg/mL。
全文摘要
本发明涉及一种蛋白质含量检测方法，该方法是先配制标准蛋白样品、试剂①、②、③，将标准蛋白样品制成梯度，采用微孔法或标准试管法将试剂①、②、③加入到梯度样品和待测样品中，测定吸光度，绘制标准曲线，再根据待测样品的吸光值推算浓度。本发明方法既能准确检测蛋白质含量，还能适用于含多种干扰物质的蛋白质溶液。本发明提高了蛋白质分析检测过程中对表面活性剂、还原剂、螯合剂以及含氮化合物等干扰物质的包容性，是一种简单、快速、灵敏度高而稳定性好的蛋白质浓度检测方法，在生命科学研究领域具有广泛应用前景。
文档编号G01N21/31GK102252987SQ201110175208
公开日2011年11月23日 申请日期2011年6月27日 优先权日2011年6月27日
发明者卢山, 董源 申请人:南京师范大学