专利名称：肠道传染性非a/非b型肝炎病毒因子及其特有的抗原决定簇的制作方法
本申请是美国申请序号07/505，888(1990年4月5日申请的后续部分。No.07/505，888是美国申请序号No.420，921(1989年10月13日申请)的连续部分，而No.420，921是美国申请序号No.367，486(1989年6月16日申请)的后续部分。No.367，486是美国申请序号No.336，672(1989年4月11日申请)的后续部分，No.336，672是美国申请序号No.208，997(1988年6月17日申请)的后续部分，所有以上申请都作为本文参考文献。
本发明涉及重组蛋白质，基因和基因探针，更具体是说涉及从一种通过肠道传染的非A/非B型肝炎病毒因子获得的重组蛋白质和探针，涉及利用这样的蛋白质和探针的诊断方法和疫苗的应用，以及编码特异性抗原决定基(以及含有这些抗原决定基的人工生产的蛋白质)的基因片段，这些抗原决定基尤其适用于诊断和予防目的。
已报道在亚洲、非洲、欧洲和墨西哥，以及印度次大陆，一些流行和散发肝炎病例是由肠道传染性非A/非B型肝炎病毒因子(ET-NANB，本文也称之为HEV)引起的。尽管该病毒可通过身体紧密接触而传播，但通常感染是由粪便污染的水引起的。看来该病毒不引起慢性感染。通过用贮存粪便中的分离株感染志愿者已证明ET-NANB的病毒病因学;免疫电子显微镜(IEM)研究显示得自已感染的个体粪便的病毒粒子直径为27-34nm。该病毒粒子与地理位置不同区域的被感染个体之血清的抗体反应，表明世界范围内发现的大多数ET-NANB肝炎是由单一类的病毒因子引起的。在由非肠道传染性NANB病毒(也称为肝炎C病毒或HCV)感染的个体血清中没有发现抗体反应，表明两种类型NANB有不同的特异性。
除了血清学的不同，两种类型的NANB感染显示不同的临床症状。ET-NANB特征是急性感染，常伴随有发热和关节痛，且在肝活组织检查样本中可见有胆汁淤滞(Arankalle)。通常症状在六周内消退。相反非肠道传染的NANB，有约50%的病例是慢性感染。很少看到发热和关节痛，并且炎症主要分布在实质性组织(Khuroo，1980)。一般在健康个体中ET-NANBH的过程较平稳，绝大多数HCV感染患者恢复时没有慢性后遗症。但这种疾病的一个奇怪的流行病学特征是在怀孕妇女中死亡率极高;在大多数研究中报道的这一比例近似于10-20%。在许多流行病学研究中可看到这种情况，但至今还不能解释其原因。是否这种结果反映了病毒的致病性，病毒和免疫抑制(怀孕)寄主的相互作用导致死亡，或者反映出一个敏感的营养不良的群体出生前的健康衰弱，仍有待证实。
根据原始的寄主的敏感性可区分两种病毒因子。ET-NANB，但不是非肠道传染的因子，可传染Cynomolgus猴。非肠道传染性因子比ET-NANB更容易传染黑猩猩(Bradley，1987)。
在世界各地已作了许多努力来鉴定和克隆与ET-NANB肝炎相关的病毒基因组序列。这一研究工作的目的之一是获得特异性病毒基因组序列，以及鉴定和表征病毒及其蛋白质产物的性质。另一个目的是生产能用于基于抗体的诊断方法和用作疫苗的重组病毒蛋白质。尽管作了这些努力，但到目前为止没有能成功地鉴定和克隆与ET-NANB肝炎相关的病毒序列，也没有鉴定和生产出任何病毒特异性蛋白质。
相关文献Arankalle，V.A.，et al.，The Lancet，550(March 12，1988).
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本发明提供了新的组合物，以及制备方法及该组合物的使用，该组合物含有来自ET-NANB病毒因子的病毒蛋白质及其片段。本发明还公开了尤其适用于诊断和疫苗生产的许多特异性病毒蛋白(和相应的遗传序列)的片段。制备ET-NANB病毒蛋白的方法包括分离ET-NANB基因组序列，然后在寄主细胞中克隆和表达该序列。发现得到的重组病毒蛋白质可用作诊断试剂及疫苗。基因组序列及其片段可用于制备ET-NANB病毒蛋白质并作为检测病毒的探针。
图1显示载体的构造以及在获得被克隆的ET-NANB片段及其序列分析时使用的操作程序。
图2A-2B显示Southern印迹，其中放射性标记的ET-NANB探针与放大的cDNA片段进行杂交，图2A中的cDNA片段是从感染的(I)和非感染(N)的胆汁源分离的RNA制备的，图2B中的cDNA片段来自感染的(I)和非感染的(N)粪便样品来源分离的RNA制备的。
本发明提供了含有ET-NANB的病毒因子之遗传序列及其片段的组合物和利用基因组序列生产的重组病毒蛋白质，以及这些组合物的使用方法。已鉴定了病毒蛋白质的抗原决定基，它们尤其适用于诊断和生产疫苗。利用ET-NANB感染病人的多倍血清可识别含有表面决定基的小肽。
可通过两种截然不同的方法完成HEV的分子克隆。基于假定的HEV cDNA克隆与来自被感染和未感染的Cyno胆汁的异源cDNA的特异性杂交反应，首先成功地鉴定一个分子克隆。用32P标记两种来源的cDNA到高比活性，以鉴定与被感染源探针特异性杂交的克隆。这些最初的实验是使用HEV的缅甸分离株感染的Cyno猴进行的。该操作步骤的敏感性直接与对整个本底的特异性序列的相对丰度相关。在对照实验中，发现在小至每1000个本底序列中有1个特异性部分的情况下，可特异性地鉴定一个靶序列。通过这种方法并利用从被感染(缅甸分离株)和对照组未感染的Cyno胆汁中制备的基因文库和探针可鉴别许多克隆。借助这种方法纯化的16个噬菌斑中第一个被充分定性的克隆被命名为ET1.1。
首先鉴定出ET1.1是根据其来源于被感染源的cDNA并且对这一来源是独具的。利用序列非依赖性单一引物扩增技术(SISPA)对未自被感染和未感染源的异源cDNA进行扩增。该技术描述于共同待批申请序号208，512中(申请日1988年6月17日)。然后通过酶促反应扩增从缅甸感染的Cyno胆汁制备的有限量的cDNA贮存物，再用假设的HEV克隆作探针进行克隆和杂交。ET1.1特异性地与来自感染源的原始胆汁的cDNA进行杂交。利用ET1.1序列和存在于SISPA cDNA中之序列的相似性可进一步确征该克隆来自HEV基因组，其中SISPA cDNA是从流行于索马里，塔什干，婆罗洲，墨西哥和巴基斯坦的五个不同ETNANBH之人粪便样品中制备的。这些分子流行病学研究试验确证了该已分离序列来源于代表世界各地ET-NANBH之主要病因的病毒。
由于发现该克隆特异性地与从感染的Cyno肝中提取的RNA杂交，进一步确定了ET1.1的病毒特异性。对聚腺苷化RNA的杂交分析证实，一个特有的7.5Kb聚腺苷化转录本不存在于未感染的肝中。该转录本的大小提示它相当于完整长度的病毒基因组。链特异性寡核苷酸也可用于探测直接由人粪便样品制备之半纯化病毒粒子直接提取的病毒基因组RNA。链特异性是基于在ET1.1中鉴别的RNA指导的RNA聚合酶(RDRP)开放读码(ORF)(见下文)只有检测有意义链的探针与该核苷酸杂交。这些研究将HEV定性为一个有意义的单链基因组。与从肝中提取的RNA的链特异性杂交反应也证实绝大多数细胞内转录本是正意义的。除病毒表达的新机理外，与有意义链相比时，负意义链(虽然不能检测)以小于1∶100的比例存在。
已有文献报导可利用来源于未被感染的人、被感染和未感染的Cyno猴的基因组DNA，也可用来源于大肠杆菌和各种噬菌体源的基因组DNA进行Southern印迹杂交和PCR试验，证明ET1.1是外源性的。为了排除轻微污染，对在cDNA构建和扩增期间进行的许多酶促操作中引入的外源性序列进行后一试验。还发现ET1.1克隆的核苷酸序列并不与Genebank数据库记载的任何序列同源。但是ET1.1克隆的已转译的开放读码显示出与RNA指导的RNA聚合酶对应的相符氨基酸残基具有有限的同源性。所有正链RNA病毒共有这一相符氨基酸部分，且如上文所述，这一部分存在于HCV基因组的3′末端。因此，推测该1.3Kb克隆至少部分地来源于该病毒基因组的非结构部分。
由于本发明已经证明了ET-NANB之不同病毒株相互之间的关系，故在本说明书中将ET-NANB病毒因子基因组限定为含有同源于质粒pTZKF1(ET1.1)中之1.33Kb DNA EcoRI插入序列的区域，其中质粒pTZKF1由大肠杆菌菌株BB4携带且其ATCC寄存登记号为67717。现已从两个方向鉴定了该完整序列(如下文所述)。由于两条链都可编码蛋白质，因而提供了两条链序列。但已将从一个方向鉴定的序列命名为“正向”序列，因为与已知蛋白质具有统计学上相似性，且已知该正向序列是优势蛋白质编码序列。该序列与其它三个可能的转译序列一起示于下文中。其中有起始于有一个异亮氨酸的第145位核苷酸，并延伸至该序列末端的一个长开放读码。其它两个读码有许多终止密码子。在本说明书中此处及别处使用了核苷酸和氨基酸的标准缩写符号。
下文列出的基因序列基本上相同于原始申请中列出的序列。本序列不同之处在于删除了5′末端的前37个核苷酸，以及3′末端的最后13个核苷酸，这些核苷酸来源于克隆中使用的接头，而不是来源于病毒。另外，删除了在原始申请中给出之序列第227位上的(G)。
下述的基因序列有SEQ ID No.1;起始于读码中核苷酸1的第一个氨基酸序列有SEQ ID No.2;起始于读码中核苷酸2的第二个氨基酸序列有SEQ ID No.3;起始于读码中核苷酸3的第三个氨基酸序列有SEQ ID No.4。
正向序列SEQ ID NO.1:
本文称为“反向序列”的互补序列以上面列出的正向序列的相同方式列示如下。该反向序列中存在着短于正向序列中之长开放读码的几个开放读码。由于这些在相反方向上的开放读码相对较短，因此可能它未被表达。
下面的基因序列有SEQ ID No.5。
反向序列
已通过定位在从缅甸分离的一个病毒株中的相应序列而证实了该序列与病原因子中的序列完全相同。该缅甸人分离株含有下示的核苷酸序列(列出一条链及开放读码)。下面的基因序列有SEQ ID No.6;与ORF1相应的蛋白质序列有SEQ ID No.7;与ORF2相应的序列有SEQ ID No.8;与ORF3相应的序列有SEQ ID No.9。
HEV的序列(Burma病毒株)
在该序列中列出的碱基总数为7195个。已删除了存在于已克隆之序列中的poly A尾部。
已通过鉴定得自墨西哥分离株的遗传材料证实了用本文所述方法从其它NANB肝炎菌株中分离和鉴定遗传材料的能力。该分离株的序列大约有75%与上文的SEQ ID No.1中列出的ET1.1序列相同。利用下面的II.B部分中提出的条件通过杂交以鉴定该序列。
在用于分离病毒的该不同方法中，直接由在Telixtac爆发流行的ET-NANB收集到的半纯化人粪便样品中制备cDNA文库。利用序列非依赖性单一引物扩增法(SISPA)确保回收到cDNA以及构建有代表性的文库。用已测知有“高”效价抗-HEV抗体(通过分析被感染Cynos的肝组织切片的直接免疫萤光法检测)的血清筛选可得到扩增之cDNA群体的λgt11中构建的cDNA文库。利用这种方法从筛选的总数60，000个克隆中鉴定出两个cDNA克隆并命名为406.3-2和406.4-2。通过与HEV(缅甸)序列的同源性比较而证实这些克隆的该相同序列定位为病毒基因组的3′侧半数序列，其中所说的HEV序列是从用最初的ET1.1克隆进行杂交筛选的文库所分离的克隆中得到的。
将这些分离到的cDNA抗原决定基用作从被感染Cyno胆汁中提取之RNA的Northern吸印试验的杂交探针时，与由ET1.1探针进行的Northern印迹相比得到稍有不同的结果。除了在用ET1.1时可看到的单一的7.5Kb转录产物外，使用这些抗原决定基中的任一个作杂交探针还可鉴定出另外两个3.7和2.0Kb的转录本。用3′最末端的抗原决定基克隆(406.3-2)作探针可鉴定出这些聚腺苷化转录本，因此确证这些转录本与该基因组3′末端有共同的末端(见下文)。随后证实该抗原决定基克隆(406.4-2)之一以特定方式与5份在不同流行区(索马里，缅甸，墨西哥，塔什干和巴基斯坦)收集的抗血清反应。406.3-2克隆与这5个流行病例中的4个的血清反应(Yarbough et al.，1990)。两克隆仅与来自感染之Cyno猴的接种后抗血清反应。后一实验进一步证实了实验感染的Cynos猴的血清转化与分离到的外源性克隆序列相关。
下面列出一个混成cDNA序列(来自于墨西哥病毒株的几个克隆)。混成的墨西哥病毒株序列(SEQ ID No.10)
上述序列从聚腺苷化克隆中获得。为清楚起见，已删去了3′polyA尾部。
上述序列含有由1661个核苷酸组成的一部分cDNA序列，并在本申请相连续的先前申请中鉴别了该序列。经适当的修正后将该先前鉴定的部分序列列示如下(SEQ ID No.11)。这种修正包括缺失以前报道之序列的前80个碱基，它的是克隆过程中人工加进的;在先前所述序列的174位点后插入G，在270位后插入C;在279位后插入GGCG;将先前序列709位的C改变成T;722-723位的GC变成CG;1238-39位的CC变成TT;1606位的C变成G;缺失先前序列765位的T;以及缺失先前序列的最后11个碱基(它似是接头序列的一部分，而不是属于病毒来源的。
非-A 非-B T墨西哥株;SEQ ID No.11
比较来自缅甸人和墨西哥人的病毒株，可看出起始于墨西哥株的第13位核苷酸和缅甸株的第3251位核苷酸的1372个核苷酸交叠部分有76.7%相同。
按照同样方式，从得自塔什干(U.S.S.R.)的分离物中鉴定出HEV的不同病毒株。下面列出的是塔什干序列(SEQ ID No.12)
如下面给出的序列比较所示，塔什干(Tash.)序列比墨西哥序列更相近于缅甸序列，这正是所期望的，得自相对地理区域较接近的两个病毒株，它们的序列也更接近。比较时使用的编号系统以缅甸序列为基础。
缅甸、塔什干和墨西哥DNA序列的比较已发现上文列出的DNA序列内有许多可能是编码区的开放读码。正如已说明的，已鉴定了在HEV(缅甸)病毒株克隆ET1.1中RNA指导的RNA聚合酶(RDRP)之相符残基。一旦积累了一组相邻重叠的克隆，则含有RDRP及鉴定为解螺旋酶区域之对应残基的非结构元件被定位于第一个开放读码(ORF1)中就变得明显了。ORF1复盖了基因组5′端的一半区域，从第一个被编码的蛋氨酸开始，第27个bp之后为非编码序列，然后延伸5079bp到达终止密码子。在正1读码中ORF1终止密码子下游的37bp开始的是第2个大开放读码(ORF2)，其延伸1980bp，到距离polyA附加物上游的68bp处终止。HEV中也利用了第三个正向ORF(在正2读码中)。ORF3只有370bp长且通过鉴定来自墨西哥SISPA cDNA文库的免疫反应性cDNA克隆406.4-2而推断病毒利用该ORF3(见下文详细讨论)。该抗原决定基证实病毒利用ORF3，尽管表达该ORF的方式还没有完全阐明。如果我们假定第一个蛋氨酸被利用，则ORF3在其5′末端与ORF1有一个bp交迭，在其3′端与ORF2有328个bp交迭。ORF2含有宽的反应活性406.3-2抗原决定基且在5′末端有一个信号序列。该ORF2的前半序列还具有相似于其它病毒衣壳蛋白质具有的高pI值(＞10)。这些数据表明ORF2可能是HEV的优势结构基因。
亚基因组转录本的存在激发我们进行一系列实验以检测这些RNA是否从基因组的5′端经切接而产生的。利用来自整个基因组，包括5′终末端的亚基因组探针的分析没有提供切接了转录本的证据。但是，发现基因组的一个区域与从Sindbis株中鉴定出的作为RNA转录(用于生产它的亚基因组信使)之可能的内部起始位点的21bp片段表现有高度同源性。21个核苷酸中有16个(76%)是相同的。
已分离并定性了编码HEV之抗原决定基(该抗原决定基可被从不同的ET-NANB流行区域收集的血清所识别，即一个能被普遍识别的抗原决定基)的两个cDNA克隆，其中一个克隆与得自不同感染个体的8份人血清有免疫反应，且另一个克隆与被试人血清中的7份有免疫反应。两个克隆特异性地与感染的动物Cyno血清发生免疫反应，而与未感染动物的血清则没有显示出免疫学反应。已测定了在这些(命名为406.3-2和406.4-2)重组噬菌体的cDNA序列。HEV开放读码显示能编码由HEV感染之病人的血清特异性识别的抗原决定基。该cDNA序列以及它们编码的多肽如下所示。
来自HEV墨西哥株的抗原决定基406.4-2序列(核苷酸序列有SEQ ID No.13;氨基酸序列有SEQ ID No.14)
406.3-2 序列(核苷酸序列有SEQ ID NO.15;氨基基序列有SEQ ID NO.16)
这些抗原决定基的通用性可由编码这些抗原决定基的DNA显示的同源性得到证实。如果将上文显示的来自墨西哥株的抗原决定基编码序列与来自其它株(如也在上文中列出的缅甸株)的DNA序列相比，即可找到相似性的证据，有关比较如下所示。
HEV墨西哥和缅甸株406.4-2抗原决定基的比较
在33个氨基酸的交迭部分有73.5%相同。
HEV墨西哥和缅甸株406.3-2抗原决定基的比较墨西哥株(SEQ ID No.19)
缅甸株(SEQ ID No.20)在42个氨基酸交迭部分有90.5%相同。
分子遗传学领域的技术人员将会理解到，上文列出的每一个特异性DNA序列均显示有一个相应的互补DNA序列以及与所示基本序列和互补DNA序列相对应的RNA序列。另外给出了编码肽的开放读码，且公开了该核苷酸序列的可表达肽，而没有象上文所示ET1.1序列或其它序列之氨基酸序列一样详细地列出该肽的氨基酸序列。
1.定义本文中下面限定的术语具有下述含意1.“肠道传染性非-A/非-B肝炎病毒因子，ET-NANB或HEV”是指一种病毒，病毒类型，或病毒类别，(ⅰ)它引起来源于水的，传染性肝炎，(ⅱ)它可在cynomolgus猴中传染，(ⅲ)该病毒在血清学特性上不同于肝炎A病毒(HAV)、肝炎B病毒(HBV)、肝炎C病毒(HCV)、和肝炎D病毒，(ⅳ)该病毒含有一个同源于插入pTZKF1(ET1.1)中之1.33Kb cDNA的基因组区域，所说质粒由ATCC寄存登记号67717的大肠杆菌菌株BB4携带。
2.如果两个核苷酸片段在Maniatis等人.(文献同上，pp.320-323)描述的杂交条件下能够相互杂交，则它们是同源的。而利用下述洗涤条件2XSCC，0.1%SDS，室温下洗两次，每次30分钟;然后2XSCC，0.1%SDS，50℃洗一次，30分钟;然后2XSCC，室温下洗两次，每次10分钟，可鉴定出含有最大约有25-30%碱基对错配的同源性序列。较优选的是含有15-25%碱基对错配，更优选的是含有5-15%碱基对错配。在鉴定基因文库(或其它遗传物质来源)中的克隆时，可使用更严格的洗涤条件来选择这些不同程度的同源性。
3.如果使用有突变缺口距阵和缺口障碍数为6或更大的ALIGN程序，得出两个氨基酸序列或两个核苷酸序列(两核苷酸序列间同源性的可选择定义)具有调准比数大于5(标准偏差单位)，则可认为他们是同源的(该术语更适用于本说明书)(参见Dayhoff.M.O.，Atlas of Protein Sequence and Structure(1972)Vol.5.National Biomedical Research Foundation.pp.101-110，以及该卷增刊2.pp.1-10)。用上文所述的ALIGN程序进行最大调准时如果两个序列(或它们的一部分，最好至少有30个氨基酸长)的氨基酸大于或相当于有50%相同，则它们有更好的同源性。
4.如果一个DNA片段的碱基对序列相同于或基本上相同于ET-NANB病毒因子基因组的一个区域，则该DNA片断即是“得自于”该病毒因子。
5.如果一种蛋白质是由得自ET-NANB病毒因子的DNA或RNA片段的开放读码编码的，则该蛋白质即是“衍生于”ET-NANB病毒因子。
Ⅱ.得到克隆的ET-NANB片段根据本发明的一个方面，已发现通过(a)从已知感染ET-NANB的Cynomolgus猴胆汁中分离RNA，(b)克隆该DNA片段以产生一个片段库以及(c)通过与得自感染和非感染之胆汁源的放射性标记cDNA进行特异性杂交而筛选该文库，可生产病毒特异性DNA克隆。
A.cDNA片段混合物用得自病人之27-34nm ET-NANB颗粒(平均直径32nm)阳性粪便的10% w/v悬浮液静脉接种Cynomolgus猴造成ET-NANB感染。监测被感染动物升高之丙氨酸转氨酶水平，表明已感染了肝炎。按照已公开的方法(Gravelle)根据血清阳性抗体与类病毒颗粒(VLPS)的免疫特异性结合而证实ET-NANB感染。简单地说，感染3-4周后，从被感染动物收集粪便(或胆汁)样品，用磷酸盐缓冲盐水1∶10稀释，经低速离心并用1.2和0.45μm滤膜连续过滤以澄清该10t悬浮液。将该物质通过30%蔗糖层离心沉淀而进一步纯化之(Bradley)。得到的VLP制剂与得自于已知ET-NANB感染之病人的稀释的血清混合。保温过夜后，将该混合物离心过夜以沉淀免疫聚集物，染色并用电子显微镜检查与VLPS结合的抗体。
从血清转变为VLP阳性血清也可证实有ET-NANB感染。此外被感染动物的血清按上面所述与从被感染人的粪便标本中分离的27-34nm VLP混合，并用电子显微镜检查与VLPS结合的抗体。
利用胆管插管收集胆汁或者在尸体解剖时排空胆汁的方法，可从ET-NANB阳性动物中收集胆汁。如例1A中所述用热酚提取法从胆汁中提取总RNA。也如实施例1A所述，利用随机引导法由该RNA片段合成相应的双股cDNA片段。经凝胶电泳或密度梯度离心方法分级分离该cDNA片段，以获得期望大小的片段，如500-4，000碱基对片段。
虽然不同来源的病毒材料，如从粪便样品中获得VLP(如实施例4所述)可用于制备cDNA部分，但优选的是胆汁来源的。依据本发明所述的一个方面，已发现，如用免疫电子显微镜观察到的，ET-NANB感染的猴的胆汁比从粪便样本中获得的材料有更大量的完整病毒颗粒。从ET-NANB感染的人或Cynomolgus短尾猴得到的胆汁作为ET-NANB病毒蛋白或基因组材料的来源或完整病毒，是本发明的一部分。
B.cDNA文库及其筛选将上述步骤中得到的cDNA片段克隆到一个合适的克隆载体内以形成cDNA文库。该过程可由下列步骤完成利用一个合适的末端接头如EcoRI序列制成一个具有平头的片段，再将该片段插入到克隆载体的恰当的插入位点，如独特的EcoRI位点中。在最初克隆之后，如果需要可将该文库再次克隆以提高含有插入片段之载体的百分数。实施例1B中描述的文库构建是上述过程的具体实例。此处cDNA片段被切成平头，接上了EcoRI末端，且插入到λ噬菌体载体gt10的EcoRI位点。分离显示有小于5%插入片段的该文库噬菌体，将该插入段片段再克隆到λgt10载体中，产生95%以上含插入片段的噬菌体。
根据与来自被感染的和未感染源之cDNA探针的不同杂交，从该cDNA文库中筛选对ET-NANB特异的序列。如上所述，可从感染的和未感染来源的胆汁或粪便分离物制备cDNA片段。按照常规方法(Maniatis，pp.109)通过随机标记、缺口转译、或末端标记对该片段进行放射性标记。如实施例2中详细描述的，通过将上述的cDNA文库转移至二张硝酸纤维素滤膜上，并与被感染来源和未感染来源(对照)之放射性标记的探针进行杂交以筛选该cDNA文库。如果根据Maniatis等人文献(pp.320-323)中描述的条件进行杂交，并利用下述洗涤条件2×SCC，0.1%SDS，室温下洗两次，每次30分钟;然后用2×SCC，0.1%SDS，50℃下洗一次，30分钟;然后用2×SCC，室温下洗两次，每次10分钟，对克隆进行选择，可得到以优选最大限度为25-30%碱基错配进行杂交的序列。用ET1.1序列作探针，可在这些条件下鉴定上文中讨论的墨西哥分离株。最好将显示出与被感染来源之探针选择性杂交的噬菌斑以低铺板密度再次铺板，并按上述再次筛选之，以分离到对ET-NANB序列特异的单个克隆。如实施例2中说明的，利用这些操作步骤可鉴别出16个与感染来源探针特异性杂交的克隆。将其中含有一个1.33Kb插入片段的克隆命名为λgt101.1。
C.ET-NANB序列利用经典的序列分析法测定B部分中ET-NANB片段上的被克隆区域的碱基对序列。在实施例3中描述的一种具体方法中，从选择到的克隆载体上切下该插入片段，通过凝胶电泳分离之，并插入到一个其中插入位点两侧的碱基对序列都是已知的载体中。实施例3中使用的特定载体是显示于图1中左边的pTZKF1载体。将gt101.1噬菌体的ET-NANB片段插入到pTZKF1质粒的唯一EcoRI位点上。如实施例3描述的，通过与分离的1.33Kb片段杂交来鉴定携带预期插入段的重组体。一个鉴定为pTZKF1(ET1.1)的选择的质粒用EcoRI消化后得到预期的1.33Kb片段。用pTZKF1(ET1.1)质粒感染的大肠杆菌菌株BB4已寄存于美国典型培养物保藏中心(Rockville，MD)，其寄存登记号为ATCC 67717)。
图1的下部图解显示了该pTZKF1(ET1.1)质粒。插入片段具有分别以A和C表示的5′和3′末端区域，并有一个以B代表的中间区域。这些区域中的序列可用标准的二脱氧序列分析法测定，且在本系列申请的较早申请中列出。这三个短序列(A，B和C)来自同一插入链。如将在下文实施例3中看到的，事实上B区域序列是从相对链上测得的，因此上述的B序列代表已进行序列分析链的互补序列。该部分序列的碱基数是一个近似值。
本发明人在以后的实验室工作中鉴定出列于上文中的全部序列。利用限制性核酸内切酶很容易制备该总序列的各片段。对正向和反向序列进行的计算机分析已鉴定出许多切割位点。
Ⅲ.ET-NANB片段根据另一个方面，本发明包括能与ET-NANB基因组序列或其cDNA片段杂交的ET-NANB特异性片段或探针。该片段可包含第Ⅱ部分中描述的全长cDNA片段，或可以是得自己克隆之cDNA片段内的较短序列区域。如在第Ⅳ部分中将要描述的，可在产生预期大小片段的条件下，对全长片段进行酶促消化制备较短的片段。另外，可利用由cDNA片段衍生的序列，通过寡聚核苷酸合成方法制备这些片段。可以利用产生被选择序列寡聚核苷酸片段的方法或通过商业途径购买到。通常用作探针的片段至少有12个核苷酸长，更好是至少有14、20、30或50个核苷酸。探针可以是全长片段或长度小于500个，更好是小于300或200个核苷酸。
为了证实一个给定的ET-NANB片段事实上来源于ET-NANB病毒因子，该片段应显示出与来自感染源的cDNA进行选择性杂交。利用图解描述方式，证明pTZKF1(ET1.1)质粒的1.33Kb片段是来源于ET-NANB。从质粒pTZKF1(ET1.1)上切除该片段，纯化，并利用随机标记方法进行放射性标记。使带放射性标记的片段与从感染源和非感染源分级分离出的cDNA杂交，以证实该探针仅与被感染来源的cDNA反应。该方法举例说明于实施例4中，其中包括检测来自pTZKF1(ET1.1)质粒的上述已放射性标记之1.33Kb片段与从感染和非感染来源制备的cDNA的结合情况。感染来源是(1)从用病毒株感染之Cynomolgus短尾猴得到的胆汁，该病毒株是从已知感染了ET-NANB的缅甸病人的粪便样品得到的，(2)从墨西哥的ET-NANB病人的粪便样品中得到的病毒因子。利用实施例4中描述的一种接头/引物扩增反应方法首先扩增每一种片段混合物中的cDNA，在琼脂糖凝胶上进行片段的分离，随后进行Southern吸印分析，再进行杂交反应，使该放射性标记的1.33Kb片段与分级分离的cDNA结合。如所期望的，在含有得自感染来源之cDNA的泳道上显示一条结合有探针的模糊谱带(预期利用接头/引物扩增方法扩增的cDNA的大小范围很宽)。没有观察到得自非感染来源的扩增之cDNA与探针结合。该结果表明1.33Kb探针是对与ET-NANB感染相关联的cDNA片段特异的。利用ET1.1作为探针，进行的同类型研究已证明该探针与从塔什干、索马里，婆罗洲和巴基斯坦收集到的ET-NANB样品杂交。其次，由该探针对来自不同大陆(亚洲，非洲和北美洲)之ET-NANB相关序列有特异性，意味着被克隆的ET-NANB缅甸序列(ET1.1)衍生于引起世界范围内ET-NANB肝炎感染的共同ET-NANB病毒或病毒纲。
在相关的验证性研究中，检测了从人或cynomolgus短尾猴基因组DNA(感染和非感染的)制备的经分级分离之基因组片段与探针的结合。没有观察到探针与任何基因组部分结合，表明该ET-NANB片段不是内源性人或cynomolgus猴基因组片段，并且还证明HEV是一种RNA病毒。
此类片段中ET-NANB特异性序列的另一个证据是由该片段上的编码区域能表达ET-NANB蛋白质，且已证明在已记载的ET-NANB爆发流行期间收集的血清与这些蛋白质有特异性血清反应性。利用这些片段表达蛋白质的方法在下文第Ⅳ部分中讨论。
ET-NANB特异性片段的一个重要用途是用于鉴定ET-NANB衍生的含有其它序列信息的cDNA。换句话说，新近鉴定的cDNA产生新的片段探针，可进一步重复使用该探针，直至鉴定出整个病毒基因组并完成其序列分析。通常鉴定其它的ET-NANB文库克隆和由之产生新探针的步骤是接着第Ⅱ部分中描述的克隆和选择步骤之后进行的。
此类片段(和由上述给出序列制备的寡聚核苷酸)也可用作为检测病人样品中ET-NANB病毒基因组材料之聚合酶链反应方法中的引物，该诊断方法将在下文第V部分中描述。
已鉴定出来源于墨西哥病毒株的两个编码免疫原性抗原决定基的特异性遗传序列，本文中确定为406.3-2和406.4-2。此可通过分离编码抗原决定基(其可与HEV感染的病人和实验动物的血清产生特异性的免疫反应)的克隆而完成。将该分离的序列与基因序列Genebank保藏中心的序列相比较，表明这些病毒序列是新的。由于这些序列是独特的，故可用于鉴别HEV的存在以及用于区分该肝炎病毒株与HAV，HBV和HCV病毒株。该序列也可用于设计寡聚核苷酸探针以诊断样品中存在的病毒。它们也可用于合成多肽，这些多肽本身则可用于免疫分析。可将特异性的406.3-2和406.4-2序列掺入其它遗传材料如载体中，以易于表达或复制。他们也可用于(如上文中证实的)鉴定由相关病毒株(如缅甸株)编码的相似抗原区域。
Ⅳ.ET-NANB蛋白质如上文所述，可通过表达ET-NANB片段中的开放读码编码区域制备ET-NANB蛋白质。在一优选的方法中，用于表达蛋白质的ET-NANB片段来源于已克隆的cDNA，该cDNA已经过处理以产生所期望大小的片段，且最好是大小基本在约100到300bp之间的随机片段。
实施例5描述了通过消化DNA制备这种片段的方法。由于期望获得含约30-100个氨基酸的肽抗原，故在消化后的片段中分级分离出优选大小的片段(如用凝胶电泳法)，以选择大小范围约100-300bp的片段。另一方法是，如果该片段被克隆到一个恰当的表达载体上，则可直接筛选特异性地从含HEV来源(如胆汁或粪便)构造的cDNA文库(详见下文)。
例如，由406.3-2和406.4-2序列表达的ET-NANB蛋白质(及其肽片段)是最优选的，因为已证明这些蛋白质与各种不同的人血清发生免疫反应，从而表明在蛋白质表面上存在一个或多个对HEV特异的抗原决定基。可通过直接筛选gt11文库鉴定这些克隆。
A.表达载体将ET-NANB片段插入到合适的表达载体中。一个典型的表达载体是λgt11，该载体含有特有的EcoRI插入位点，其位于β-半乳糖苷酶基因之转译终止密码子上游53bp处。因此，该插入的序列将表达为β-半乳糖苷酶融合蛋白质，该蛋白质含有β-半乳糖苷酶基因的N-末端部分、异源肽、以及含有或不含有β-半乳糖苷酶肽的C-末端区域(如果异源肽编码序列不含有转译终止密码子，则可表达C-末端部分)。该载体还产生一个温度敏感性抑制物(C1857)，它在许可的温度如32℃时能引起病毒的溶原现象，在提高温度后如37℃可导致病毒溶解。该载体的优点包括(1)高效率地产生重组体，(2)如果寄主细胞在许可的温度而不是非许可温度下生长，能选择溶原化寄主细胞，(3)生产高水平的重组融合蛋白质。再者，由于含有异源插入序列的噬菌体能产生失活的β-半乳糖苷酶，因此可利用β半乳糖苷酶-底物显色反应很容易地鉴定出带有插入序列的噬菌体。
为了插入到表达载体中，可根据需要按常规方法对消化的病毒片段进行修饰以使之含有选择的限制性位点接头，如EcoRI接头。实施例1描述了将消化片段克隆到λgt11中的方法，其包括将该片段切成平齐末端，与EcoRI接头连接，及将该片段引入到EcoRI切割的λgt11中等步骤。检查所得到的病毒基因组文库，证明已产生了相对大的文库。对于λgt11载体的情况，则可通过感染合适的细菌寄主铺板培养该细菌，并检查失去β半乳糖苷酶活性的噬菌斑来完成。利用实施例1中描述的方法，约有50%的噬菌斑丧失了酶活性。
B.肽抗原的表达筛选上面形成的病毒基因组文库用以生产与ET-NANB血清阳性个体之抗血清发生免疫反应的肽抗原(作为融合蛋白表达)。在一优选的筛选方法中，如上文所述将用噬菌体文库载体感染的寄主细胞进行平板培养，用硝酸纤维素滤膜吸印该平板，以将细胞产生的重组蛋白质抗原转移至滤膜上。然后使ET-NANB抗血清与该滤膜反应，洗掉未结合的抗体，并与带报道标记的抗人抗体反应，该抗体通过抗ET-NANB抗体以夹心方式结合到滤膜上。
以相对低的密度重新检测其重组抗原的产生以鉴定产生抗体反应性融合蛋白质的典型噬菌斑。利用该方法鉴定了几个产生免疫反性重组抗原的重组噬菌体克隆。
可用筛选的表达载体进行扩大生产，用以纯化重组蛋白质。利用许多已报道过的方法之一进行扩大生产，包括a)用选择的λgt11重组体使适当的寄主细胞如大肠杆菌溶原化，b)在能产生高水平异源肽的条件下培养该被转导的细胞，c)从溶解细胞中纯化该重组抗原。
在有上述λgt11克隆载体参与的一个优选方法中，用选择的文库噬菌体感染大肠杆菌高生产菌宿主BNN103，并于两个平板上重复铺板。平板之一培养于32℃，其可出现病毒的溶源现象，另一平板培养于42℃，这种情况下感染噬菌体处于溶解阶段，并因此阻止了细胞生长。故可确认在较低而不是较高温度下生长的细胞被成功地溶原化了。
然后在有助于高水平表达含病毒插入段之融合蛋白质的液体培养条件下培养该溶原化的宿主细胞，并通过快速冷冻溶解细胞以释放出预期的融合蛋白质。
C.肽的纯化可利用标准蛋白质纯化方法纯化该重组蛋白质，包括差速离心、分子筛层析、离子交换层析、等电聚焦、凝胶电泳和亲和层析。对于融合的蛋白质，如上述制备的β半乳糖苷酶融合蛋白质，可用与分离天然蛋白质中使用的相同方法分离之。因此为分离可溶性β半乳糖苷酶融合蛋白质，可通过简单的亲和层析，使细胞溶解产物通过表面结合有抗β半乳糖苷酶抗体的固相基质，很容易分离到该蛋白质。
D.病毒蛋白质也可直接从ET-NANB病毒因子得到本发明的ET-NANB蛋白质。如上所述，从被感染个体的粪便或肝样品中分离到的VLP或蛋白质是病毒蛋白质材料的一个合适来源。在进行蛋白质分离以前，通过亲和层析可进一步纯化从粪便样品分离的VLPs(见下文)。该病毒因子也可由细胞培养物中产生，能提供方便的和潜在的高浓度的病毒蛋白质来源。本发明人的美国专利申请序号No.846，757(申请日1986，4，1)中描述了细胞培养物中支持NANB感染的永久化trioma肝细胞。该trioma细胞系是通过将人肝细胞与根据人染色体稳定性而选择的小鼠/人融合对象融合而制备的。可利用免疫荧光法，和抗ET-NANB人抗体鉴定含有所期望之NANB病毒因子的细胞。
在进行蛋白质分离前，利用常规方法，包括超声波处理，高或低盐条件，或使用去污剂破碎该病毒因子。
使用按标准方法吸附到适当固相载体上的纯化的抗ET-NANB抗体，通过亲和层析法纯化ET-NANB病毒蛋白质。通过亲和层析法，抗体本身可得以纯化，其中如上文所述将免疫反应性重组ET-NANB蛋白质吸附到固相载体上，以从免疫血清源中分离抗ET-NANB抗体。利用标准方法从载体上释放结合的抗体。
另外，抗ET-NANB抗体可以是用重组ET-NANB蛋白质免疫小鼠或其它动物而制备的抗血清或单克隆抗体(Mab)。为生产单克隆抗体，从该动物中分离淋巴细胞且用合适的融合对象使之永久化，然后筛选能与重组蛋白质免疫原反应的成功地融合产物。依次对它们进行上文所述的亲和纯化步骤，以得到天然ET-NANB抗原。
V 实用性虽然ET-NANB的作用主要是对人有影响，但最近的资料已显示该病毒因子还能感染其它动物，尤其是哺乳动物。因此，本文讨论的实用性适于作人和兽药使用，尤其是作商品兽药使用，如诊断和治疗猪、牛、羊、马和其它家畜。
A.诊断方法本发明的病毒颗粒和抗原，以及遗传材料可用于诊断分析中。检测ET-NANB肝炎存在的方法包括分析生物学样品，如血样品，粪便样品或肝活组织标本中是否存在与ET-NANB肝炎病毒相关的分析物。
该分析物可以是能与探针进行杂交的核苷酸序列，该探针包括至少约16个相邻核苷酸，通常是30-200个核苷酸组成的序列，最大达到基本上是上面所显示的序列(cDNA序列)的全部长度。
该分析物也可以是RNA或cDNA。典型的分析物是猜测为ET-NANB的病毒颗粒或是该分类上被排除的颗粒。进一步将该病毒颗粒定性为有一个RNA病毒基因组，该基因组含有一个序列，其至少约有70%同源于上文所述的“正向”和“反向”序列的至少12个连续核苷酸序列，通常至少约80%同源于两序列内的至少约60个连续核苷酸，该基因组也可以包含一个基本上同源于全长序列的序列。为了检测与探针杂交的分析物，该探针应含有可检测的标记。特别优选的探针序列是来自本文描述的406.3-2和406.4-2克隆的连续核苷酸序列，因为这些克隆显示出特别适用于诊断HEV。
该分析物也可包括能识别ET-NANB病毒粒子上的抗原如细胞表面抗原的抗体。该分析物还可以是ET-NANB病毒抗原。分析物是抗体和抗原时，可分别用标记的抗原或抗体与该分析物结合，以形成一种免疫复合物，然后借助该标记可检测之。
检测分析物如表面抗原和/或整个颗粒的典型方法是基于免疫分析。可进行免疫分析以检测由ET-NANB肝炎病毒感染宿主所产生的抗体，或者用该分析法直接检测病毒颗粒或抗原的存在。这些技术是已知的，在此无须详细描述。实施例中包括异源和同源免疫分析技术。两种技术都是基于检测病毒颗粒或其抗原与相应特异性抗体之间形成的免疫复合物。病毒抗原的典型异源分析是利用结合到固相载体上的特异性单克隆或多克隆抗体。夹心法已逐渐被普通使用。也可以使用在没有固相存在的溶液中进行的同源分析，例如可通过测定因游离抗体与酶-抗原结合物结合而导致的不同酶活性。在美国专利3，817，837、4，006，360和3，996，345号中公开了许多适用的分析方法。
当检测是否存在ET-NANB病毒诱导的抗体时，可用本发明的病毒和抗原作为特异性结合因子，用于检测IgG或IgM抗体。由于典型情况下，IgM抗体是感染过程中出现的第一个抗体，因此当IgG合成尚未开始时，特异性地区分宿主血流中存在的IgM和IgG抗体，将使内科医生或其它研究人员能确定感染是新近出现的还是已到恢复期。由本发明描述的406.3-2和406.4-2克隆表达的蛋白质及其肽片段特别适于用作特异性结合因子用于检测抗体，因为已证明它们是与许多不同的人HEV血清有反应性的。再者，它们也与急性期的和恢复期的血清有反应性。
在一种诊断方式中，试验血清与表面已结合了ET-NANB蛋白质抗原的固相试剂反应。在将抗-ET-NANB抗体与该试剂结合并洗掉未结合的血清成份后，将该试剂与带报道标记的抗人抗体反应，以使报道物固相载体上结合之抗ET-NANB抗体的量成比例地结合到该试剂上。再次洗涤该试剂以除去未结合的带标记抗体，并测定与该试剂相联系的报道物的量。典型的报道物是一种酶，可在适于用萤光光度或分光光度法测定的底物存在下保温该固相以检测之。
上述分析法中的固相表面试剂可用已知技术，将蛋白质物质吸附到固相载体材料如聚合物小珠、蜡棒或滤纸材料上制备。这些吸附方法一般包括蛋白质在载体上的非特异性吸附或蛋白质的共价结合，典型地是通过一个游离氨基共价吸附到固体载体的化学活性基团如反应活性羧基、羟基或醛基上。
在第二种诊断方式中，即同源分析法中，与固相载体结合的抗体在反应介质中发生某种变化，而这种变化可直接在基质中检测到。因此，所提出的已知一般类型的同源分析法包括a)带自旋标记物的报道物，其中根据报道的迁移率的变化(加宽了自旋分裂峰)来检测与抗原结合的抗体，b)荧光标记报道物，其中根据荧光效率的变化检测结合情况，c)酶报道物，其中抗体结合影响到酶/底物相互作用，d)结合脂质体的报道物，其中抗原与抗体结合可导致脂质体溶解并释放被包裹的报道物。按照常规方法使这些方法适用于本发明的蛋白质抗原，以制备同源分析试剂。
上述描绘的任一种分析方法中，均包括使试验个体的血清与蛋白质抗原反应，检测结合抗体上存在的抗原。检测方法包括将带标记的抗人抗体结合到待检抗体IgM(急性期)或IgG(恢复期)上，然后按第一种方法测定结合到固相载体上之报道物的量，或者按第二种方法观察结合到同源分析试剂上之抗体的效力。
完成上述的分析法所用的分析系统或药盒也是本发明的一部分。通常该分析药盒包括表面结合有重组蛋白质抗原的载体，该抗原(a)与肠道传染性非A/非B病毒因子感染的个体中存在的抗体发生反应，(b)衍生于肝炎病毒因子，该因子的基因组含有同源于质粒pTZKF1(ET1.1)(由大肠杆菌菌株BB4(ATCC No.67717)携带)中存在之1.33Kb DNA EcoRI插入段的区域。分析药盒中的报道物标记的抗人抗体被用以检测表面结合的抗ET-NANB抗体。
B.病毒基因组的诊断应用在许多分析法中，本发明的遗传材料本身均可作为存在于天然发生的感染中之遗传材料的探针。经杂交试验进行的最新分析中，已知扩增靶核苷酸的一种方法是聚合酶链反应或PCR技术。利用寡核苷酸引物，可用PCR技术检测可疑的病理学样品中本发明所说的病毒颗粒，其中寡核苷酸引物相互之间相隔开，并且是根据上面列出的遗传序列合成的。这些引物与一条双链DNA分子的相对链互补，且一般间隔约50-450nt或更多(通常不超过2000nt)。该方法包括制备特异性寡核苷酸引物，然后重复循环下列步骤靶DNA变性、引物结合、用DNA聚合酶延伸以获得间隔开引物所需长度的DNA片段。由一个引物产生的延伸产物可作为其它引物的附加靶序列。一个靶序列的扩增程度可由所完成的循环次数来控制，且可按简单通式2n从理论上计算出扩增程度，式中n是循环次数。如果每次循环的平均效率为大约65%-85%，则25次循环可产生0.3-4.8×106个靶序列的拷贝。在许多出版物中描述了该PCR方法，包括Saiki et al.，Science(1985)2301350-1354;Saiki et al.，Nature(1986)324163-166;Scharf et al.，Science(1986)2331076-1078。另外可参见美国专利4，683，194、4，683，195和4，683，202号说明书。
本发明包括一种特异性诊断方法，该方法是基于选择性扩增ET-NANB片段以检测ET-NANB病毒因子。该方法利用了一对单链引物，它们来源于双股DNA片段之相对链的非同源性区域，而该双股DNA片段本身则来自于肠道传染性肝炎病毒因子，其中所说的因子之基因组含有同源于质粒pTZKF1(ET1.1)(由大肠杆菌BB4菌株，ATCC No.67717携带)中的1.33Kb DNA的EcoRI片段插入物的一个区域。作为本发明一个方面的这些“引物片段”，可从上文第Ⅲ部分描述的ET-NANB片段制得。随后用于扩增选择之核苷酸序列的方法可参见上文讨论的美国专利4，683，202号中公开的内容。
C.肽疫苗本发明的任一种抗原均可用于制备疫苗。制备疫苗所优选的起始材料是从胆汁中分离到颗粒抗原。如上文所述的这些抗原最初是作为完整的颗粒被回收的。但是，也可以从其它来源分离到颗粒或非颗粒重组体抗原以制备适用的疫苗。如果利用非颗粒抗原(典型的是可溶性抗原)，可优选得自于病毒被膜或病毒衣壳的蛋白质制备疫苗。可按上文所述用亲和层析法纯化这些蛋白质。
如果纯化的蛋白质是无免疫原性的，则可将其结合到载体上，使该蛋白质具有免疫原性。这些载体包括牛血清白蛋白、钥孔 血蓝蛋白等。最好(但不是必要的)纯化抗原使之基本上不含人蛋白质。但最重要的是抗原中不能含有来源于人以外的蛋白质、病毒和其它物质。这些物质可能是通过(或污染了)培养或由获得病毒所用的培养基、细胞系、组织或病理体液引入的。
可按照常规方式进行疫苗接种。例如可在合适的稀释剂如水、盐水、缓冲盐水、完全或不完全佐剂中使用该抗原(无论是病毒颗粒还是蛋白质)。可按标准技术用该免疫原诱导抗体，如用含有失活的或减毒的病毒颗粒或抗原的生理学上相容的无菌溶液进行皮下接种。通过疫苗注射产生免疫反应的病毒颗粒的典型给药量一般为一毫升的体积或更少。
疫苗组合物的特定实例包括存在于药物学上可接受之佐剂中的重组蛋白质或从肠道传染性非A/非B肝炎病毒因子得到的蛋白质混合物。其中非A/非B病毒因子基因组含有一个与存在于pTZKF1(ET1.1)质粒中的1.33Kb DNA EcoRI片段插入物同源的区域。该pTZKF1(ET1.1)质粒由E.coli BB4菌(ATCC No.67717)所携带。按预定的间隔期接种该疫苗，直到在血清中检测到有足够高效价的抗ET-NANB抗体。该疫苗可用于防止ET-NANB感染。
由本文描述之406.3-2和406.4-2克隆表达的蛋白质及其等效物，包括被表达之蛋白质的片段，特别适用于制造疫苗。由于已证明这些克隆与各种人HEV阳性血清具有反应活性，故表明它们可用于保护个体免受各种HEV病毒株的感染。
D.预防和治疗抗体和抗血清除用作疫苗外，该组合物还可用于制备抗ET-NANB病毒颗粒抗体。该抗体可直接用作为抗病毒剂。为了制备抗体，可用病毒颗粒或如上文所述将由该病毒颗粒衍生的非颗粒抗原结合到载体上后免疫宿主动物。经过适当时间间隔后收集宿主血清或血浆，以提供含有与病毒颗粒有反应活性之抗体的组合物。可使用饱和硫酸铵或DEAE葡聚糖或本领域内技术人员熟知的其它技术，得到γ球蛋白部分或IgG抗体。这些抗体基本上没有与其它抗病毒因子如药物相关联的许多有害副作用。
通过尽量减少可能有害的免疫系统反应，制得与宿主系统更相容的抗体组合物。可通过除掉所有或部分外来抗体的FC部分或者利用与宿主动物属相同的抗体，如利用产生于人/人杂交瘤的抗体达到上述目的。
该抗体也可用作为提高免疫反应的工具，因为抗体-病毒复合物可被巨噬细胞识别，该抗体的使用量与抗体在其它治疗中的给药量相似。例如在其它病毒性疾病如狂犬病、麻疹和乙型肝炎的早期潜伏期，可以0.02-0.1ml/每磅体重的量使用贮备的γ-球蛋白，用以阻止病毒进入细胞内。因此，能与ET-NANB病毒反应的抗体可单独或与另一种抗病毒剂结合后被动地用于ET-NANB病毒感染的宿主，以提高其免疫反应性和/或增加抗病毒药物的效能。
另外，可用抗异型抗体作为免疫原诱导抗ET-NANB病毒抗体。简单地说，可用按上述方法制备的纯化的抗ET-NANB病毒抗体制剂诱导宿主动物中的抗异型抗体。将该组合物溶于合适的稀释剂中施用于宿主动物。给药后，通常需重复给药，以使宿主产生抗异型抗体。为排除对FC区域的免疫反应，可利用与宿主动物相同种的动物产生的抗体，或者除去所用抗体的FC区域。在宿主动物体内诱导产生抗异型抗体后，收集血清或血浆以提供抗体组合物。可按上述纯化抗ET-NANB病毒抗体的方法，或者使用与亲和基质结合的抗ET-NANB病毒抗体经亲和层析纯化该组合物。所产生的抗异型抗体在构象上与真正的ET-NANB抗原相似，且比使用ET-NANB颗粒抗原更适于制备ET-NANB疫苗。
如用作为诱导病人产生抗ET-NANB病毒抗体的工具时，注射抗体的方式与疫苗接种方法相同，即通过肌肉内，腹腔内或皮下等途径，以合适的浓度并加用生理学上合适的稀释剂以及加或不加佐剂一起注射。可取的是进行一次或多次加强注射。诱导抗ET-NANB病毒抗体之抗异型抗体方法可减小因被动使用抗ET-NANB病毒抗体所引起的问题，如不利的免疫反应，而且这些问题是与使用纯化的血液成分相关，如感染迄今尚未发现的病毒。
本发明所述的由ET-NANB衍生的蛋白质还可用于生产在接触病原体前后之预防目的的抗血清。此外ET-NANB蛋白质或蛋白质混合物可用适当的稀释剂配制且通过注射用于人志愿者，按照已知的方法生产人抗血清。在免疫后的几个星期内，按照上述ⅡA部分所述，定期采血以检测血清中抗ET-NANB抗体的存在，以监测对注射之蛋白质的抗体反应。
从被免疫个体获得的抗血清可作为接触前之预防措施而用于有被感染危险的个体。该血清也可用于治疗已接触后的个体。可使用类似于接触后预防之抗乙型肝炎病毒的高效价抗血清。
E.单克隆抗体为了在体内使用ET-NANB病毒颗粒抗体、蛋白质和抗异型抗体以及诊断应用，可优选单克隆抗体。可按下述方法生产单克隆抗病毒颗粒抗体或抗异型抗体。用本领域内技术人员已知的方法切掉被免疫动物的脾脏或收集淋巴细胞，使之永久化，或用于制备杂交瘤。为生产人-人杂交瘤，先选择人淋巴细胞供体。已知感染了ET-NANB病毒的供体(其中感染可根据血中存在抗病毒抗体或通过病毒培养法而证实)可作为合适的淋巴细胞供体。可从外周血样品中分离淋巴细胞，或者如果该供体作了脾切除术也可用脾细胞。用Epstein-Barr病毒(EBV)保持人淋巴细胞不死亡，或用一个人融合对象生产人-人杂交瘤。在生产人单克隆抗体时也可用肽作第一次体外免疫。
筛选永久化细胞所分泌的抗体，以检测分泌有所需特异性之抗体的克隆。对于单克隆抗病毒颗粒抗体，该抗体必须结合到ET-NANB病毒颗粒上。对于单克隆抗异型抗体，必须结合到抗病毒颗粒抗体上。筛选产生有所需特异性之抗体的细胞。
下面的实施例描述了本发明的各个方面，但不是以任何方式限制本发明的范围。
下述实施例中所用的材料包括酶从Boehringer-Mannheim Biochemicals(BMB，Indianapolis，IN)得到DNA酶I和碱性磷酸酶，以及得自于New England Biolabs(NEB，BeVerly MA)的EcoRI、EcoRI甲基化酶、DNA连接酶、和DNA聚合酶I和得从Sigma(St.Louis，MO)的RNA酶A。
其它试剂EcoRI接头，得自NEB。硝基蓝四唑(NBT)，S-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸酯(盐)(BCIP)，S-溴-4-氯-3-吲哚-B-D-吡喃半乳糖苷(Xgal)和异丙基B-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，得自Sigma。
可用从Boehringer-Mannheim Biochemicals(BMB，Indianapolis，IN)得到cDNA合成试剂盒和随机引物标记试剂盒。
实施例1制备cDNA文库A.ET-NANB病毒来源两只Cynomolgus猴(cynos)用贮存之粪便的10%悬浮液作静脉内注射，该粪便贮存物是从用缅甸病例中分离到的ET-NANB病毒株感染cynos，经两次传代后得到的。根据粪便中27-34nm病毒样颗粒(VLPs)与已知的ET-NANB病人的免疫血清结合而证实该粪便样品为ET-NANB阳性。接种后24-36天，动物体内的丙氨酸氨基转氨酶(ALT)水平提高，且在感染的急性前期动物胆汁中分泌出27-34nm VLPs。
在每只被感染动物的胆汁管中插入套管，且每天收集约1-3cc的胆汁。用经典的RNA分离方法，用热酚提取法从胆汁标本(cyno＃121)中提取RNA。使用得自Boehringer-Mannheim(INdianapolis，IN)的cDNA合成试剂盒，以第一条链产生的随机引物，从分离到的RNA制备双链cDNA。
B.克隆双链片段在标准条件下，用T4DNA聚合酶将该双链cDNA片段修成平头(Maniatis，P.118)，然后用苯酚/氯仿提取，并用乙醇沉淀。在标准条件下(Mamiatis，pp.396-397)用EcoRI接头连接该带平端的材料，并用EcoRI消化以除去多余的接头末端。然后经异丙醇沉淀除去未连接的接头。
从Promega Biotec(Madison，WI)得到λgt10噬菌体载体(Huynh)。该克隆载体在噬菌体cI阻遏基因上有一个特异的EcoRI克隆位点。将上面得到的cDNA片段按下述方法引入EcoRI位点中，即将0.5-1.0μg EcoRI切割的gt10，0.5-3μl上述双链片段，0.5μl 10X连接缓冲液，0.5μl连接酶(200单位)相混合，加入蒸馏水，至总体积为5μl。将该混合物在14℃下保温过夜，按标准方法(Maniatis，pp.256-268)进行体外包裹。
用已包裹的噬菌体感染大肠杆菌hf1菌株，如HG415菌株。另外也可使用得自Promega Biotec，Madison，WI.的大肠杆菌C600菌株。经分析20个噬菌斑得出由于插入带EcoRI末端之片段而产生的重组噬菌斑的百分率小于5%。
将得到的cDNA文库进行铺板，并在选择的平板上加入洗脱缓冲液以洗脱噬菌体。从噬菌体中提取DNA后，用EcoRI消化DNA释放出异原性插入物群体，并在琼脂糖上分离该DNA片段，以除去噬菌体片段。分离出500-4，000bp插入物，按上述方法再克隆到λgt10中，并用已包裹的噬菌体感染大肠杆菌株HG415。成功的重组体的百分率在95%以上。将噬菌体文库在大肠杆菌菌株HG415上铺板，在总共8个平板上，每平板约为5000个噬菌斑。
实施例2筛选ET-NANB克隆片段A.cDNA探针按实施例1所述从未感染和ET-NANB感染的Cynomolgus猴制备双链cDNA片段。用得自Boehringer-Mannheim(Indianapolis，IN)的随机引发标记药盒，通过随机引发来放射性标记该cDNA片段。
B.克隆筛选按照标准方法(Maniatis，pp.320-323)，将实施例1中得到的铺板的cDNA文库转移到两张硝酸纤维素滤膜上，并通过烘烤使该噬菌体DNA固定在滤膜上。二张重复的滤膜与上述得到的感染源探针或对照cDNA探针杂交。检测二张滤膜的放射自显影图，以识别出仅与来源于感染源的放射性标记的cDNA探针杂交的文库克隆，即不与来自非感染源的cDNA探针杂交的文库克隆。在被检测的约40，000个克隆中，用这种减除选择法鉴定出16个这样的克隆。
挑取16个克隆中的每一个，以低浓度在琼脂平板上再次铺板。按照农业上使用的移植秧苗的方法将每一平板上的克隆转移到两张硝酸纤维素膜上。并按上述方法检测与来自感染和未感染来源的放射性标记之cDNA探针的杂交情况。选择与感染来源之探针选择性结合的克隆(即与感染来源探针结合而基本上不与非感染来源探针结合)分离选择性地与感染来源探针结合的克隆之一作进一步的研究。选择到的载体被鉴定为λgt10-1.1并描绘于图1中。
实施例3ET-NANB序列得自实施例2的克隆λgt10-1.1用EcoRI消化以释放出异源性插入物，通过凝胶电泳从载体片段中分离出该插入物。该片段的电泳迁移率与1.33Kb片段相一致。将含有EcoRI末端的该片段插入到pTZKF1载体的EcoRI位点，有关该载体的构建和性质已有本发明人共有的美国专利申请(Cloning Vector System and Method for Rare Clone Identification)No.125，650(申请日1987.11.25)中述及。简单地说(并描述于图1中)，该质粒含有与一个T7聚合酶启动子位点相连接的独特的EcoRI位点，且含有质粒和噬菌体的复制原点。与EcoRI位点每一端直接相邻的序列是已知的。用该质粒转化大肠杆菌BB4菌株(该菌株从Stratagene(La Jolla，CA)得到)。
可通过下列步骤制备放射性标记的ET-NANB探针，包括从实施例2中的λgt10-1.1噬菌体上切除1.33Kb插入物，以凝胶电泳法分离该片段，并按前述方法随机标记之。按照实施例2中描述的方法，通过重复移植和与放射性标记的ET-NANB探针杂交筛选出由上述pTZKF1转染且含有所期望之ET-NANB插入物的细菌。
用一个含有成功的重组体的细菌菌落对其中的1.33Kb插入物部分进行序列分析。该命名为pTZKF1(ET1.1)的分离物已寄存于美国典型培养物保藏中心并有寄存登记号No.67717。利用标准的二脱氧序列分析方法，以及以EcoRI位点为两侧翼的序列引物，测得该插入物的5′末端区域和3′末端区域约200-250bp的序列。该序列已在上文第Ⅱ部分中给出。利用相同的方法进行下面的序列分析，从两个方向进行，得到完整序列，也示于上面第Ⅱ部分中。
实施例4检测ET-NANB序列按上述方法从未感染的和ET-NANB感染的cynomolgus猴胆汁中制备cDNA片段混合物。按下述方法制备由人粪便样本得到的cDNA片段。将从诊断为由于ET-NANB爆发流行而感染了ET-NANB的墨西哥病例得到的30ml 10%粪便悬浮液、以及相似体积的健康未感染者的粪便悬浮液复盖在30%蔗糖密度梯度层的上层，并用SW27转子于15℃下以25，000Xg离心6小时。从感染来源粪便的离心沉淀材料中含有特征性的27-34nmVLP颗粒即说明被感染粪便样品有ET-NANB感染。在感染和未感染样品的蔗糖梯度沉淀物中分离出RNA，并按实施例1中描述的方法将分离到的RNA用于产生cDNA片段。
利用描述于共同待批专利申请序号07/208，512(“DNA扩增和减去方法”，申请日1988.6.17)中的新的接头/引物复制方法，分别扩增感染和非感染胆汁来源以及感染和非感染人粪便来源的cDNA片段混合物。简单说，用DNA polI将各样品中的片段制成平齐末端，然后用苯酚/氯仿提取，并用乙醇沉淀。用有下示序列(上部或5′端序列为SEQ ID No.21)接头连接有平端的片段5′-GGAATTCGCGGCCGCTCG-3′3′-TTCCTTAAGCGCCGGCGAGC-5′用NruI消化该双链片段以除去接头二聚体，并与具有序列5′-GGAATTCGCGGCCGCTCG-3′的引物混合，然后加热变性，冷却至室温，以形成单链DNA/引物复合物。加入水生栖热菌(Taq)聚合酶和所有四种脱氧核苷酸，复制该复合物以形成双链片段。复制步骤包括连续的链变性，形成链/引物复合物及复制，重复25次。
使用2%琼脂糖基质，经琼脂糖凝胶电泳分离已扩增的cDNA序列。在将该DNA片段从琼脂糖凝胶上转移至硝酸纤维纸上后，用32P随机标记的探针与该滤纸杂交。按下述方法制备该探针。(ⅰ)用EcoRI处理上面得到的pTZKF1(ET1.1)质粒，(ⅱ)分离释放出的1.33Kb ET-NANB片段，(ⅲ)随机标记该分离到的片段。按常规Southern吸印法进行探针杂交(Maniatis，pp.382-389)。图2显示了与得自感染(I)及非感染(N)之胆汁来源(2A)和感染(I)及非感染(N)之人粪便源(2B)的cDNA杂交所得到的杂交图型。可以看到，ET-NANB探针与从两种感染来源得到的片段杂交，但不同源于从任一种非感染来源得到的序列，从而证实所得序列的特异性。
也可用来自人和cynomolgus猴DNA的基因组DNA片段制备该放射性标记之1.33Kb片段的Southern印迹。没有观察到该探针与任一种基因组片段混合物杂交，证实ET-NANB序列对于人或cynomolgus猴基因组来说是外源性的。
实施例5表达ET-NANB蛋白质A.制备ET-NANB编码序列用EcoRI消化实施例2中制得的pTZKF1(ET1.1)质粒，以释放1.33Kb ET-NANB插入段，经凝胶电泳从线性化的质粒中纯化该插入段，将该纯化片段悬浮于标准消化缓冲液(0.5M Tris HCl，pH7.5，1mg/ml BSA;10mM MnCl2)中至浓度约为1mg/ml，并用DNA酶I在室温下消化约5分钟。先经校正研究确定反应条件，其中测定主要产生100-300bp片段所需要的保温时间。用苯酚/氯仿提取该材料，然后用乙醇沉淀之。
按实施例1所述将消化混合物中的片段修成平端并与EcoRI接头相连接。使用Phix 174/HaeIII和λ/HindIII大小标志物，在1.2%琼脂糖凝胶上电泳(5-10v/cm)分析所得到的片段。在NA45条(Schleicher和Schuell)上洗提100-300bp部分，然后将洗提物放入含洗脱溶液(1M NaCl，50mM 精氨酸，pH9.0)的1.5ml微试管中，在67℃下保温30-60分钟。洗提到的DNA用苯酚/氯仿提取，然后用2倍体积的乙醇沉淀。该沉淀物重新悬浮于20μl TE(0.01M Tris HCl，pH7.5，0.001M EDTA)中。
B.在表达载体中克隆由Promega Biotec(Madison，WI)得到λgt11噬菌体载体(Huynh)。该克隆载体中有一个独特的EcoRI克隆位点，位于β-半乳糖苷酶转译终止密码子上游的53bp处。按下述方法将直接从编码序列(例5)得到或在cDNA扩增(例4)之后提供的上述基因组片段引入EcoRI位点将0.5-1.0μg EcoRI切割的gt11.0.3-3μl上述确定大小的片段、0.5μl 10×连接缓冲液(如上)、0.5μl连接酶(200单位)、加蒸馏水混合至体积为5μl。将该混合物在14℃下保温过夜，然后按照标准方法(Maniatis，pp.256-268)进行体外包裹。
已包装的噬菌体用于感染大肠杆菌菌株KM392，该菌株得自Dr.Kevin Moore，DNAX(Palo Alto，CA)。另外也可使用从美国典型培养物保藏中心获得的大肠杆菌Y1090菌株(ATCC＃37197)。将感染后的细胞铺板，并用标准X-gal底物噬菌斑分析法(Maniatis)在X-gal存在下，检查所得菌落中丢失β半乳糖苷酶活性(透明的噬菌斑)的情况。大约有50%噬菌斑(重组体)丢失了β半乳糖苷酶活性。
C.筛选ET-NANB重组蛋白质从文献记载的墨西哥、婆罗洲、巴基斯坦、索马里、缅甸发生的ET-NANB流行期间感染的病人中获得ET-NANB恢复期抗血清。该血清与几个其它的ET-NANB肝炎病人粪便样品中的VLPs有免疫反应。
在一个150mm平板上制备大肠杆菌KM392细胞层，这些细胞已用上述得到的104pfu的噬菌体贮备物感染，然后在37℃下颠倒保温5-8小时。用一张硝酸纤维素纸复盖细胞层，使表达的ET-NANB重组蛋白质从噬菌斑转移至纸上。对平板和滤纸做标记，以使对应的平板和滤纸位置相一致。
用TBST缓冲液(10mM Tris，pH8.0，150mM NaCl，0.05%吐温20)洗涤滤纸两次，用AIB(TBST缓冲液加1%明胶)封闭，再用TBST洗涤，加入抗血清(用AIB稀释至150，12-15ml/平板)保温过夜。再用TBST洗涤得到的滤纸两次，然后与酶标记的抗人抗体接触，以在含有被该抗血清识别之抗原的滤纸位点处结合标记的抗体。最后洗涤一次后，在含有33μl NBT(保持于4℃下的50mg/ml贮备溶液)、16μl BCIP(保持于4℃下的50mg/ml贮备溶液)和5ml碱性磷酸酶缓冲液(100mM Tris，pH9.5，100mM NaCl，5mM MgCl2)混合物的底物介质中使该滤纸显色。在产生抗原位点由抗血清识别而显现紫红色。
D.筛选铺板将按前述步骤中测知的抗原产生区以大约100-200pfu的密度重新在一个82mm平板上铺板。重复上述步骤，包括从开始的5-8小时保温，到NBT-BCIP显色，以得到能分泌与ET-NANB抗体反应之抗原的纯化噬菌体之噬菌斑。挑取已鉴定的噬菌斑，且在噬菌体缓冲液中洗脱(Maniatis p.443)。
E.抗原决定基的鉴定用上面描写的相同方法分离由实施例2所述原始pTZKF1(ET1.1)质粒衍生的一系列亚克隆。这五个亚克隆中的每一个都能对C中描述的抗ET抗血清贮备物有免疫反应性。这些亚克隆含有来自前面所述的“反向”序列之较短的序列。这些亚克隆序列的起始和终末端(相对于全长“反向”序列而言)列于下表中。
表1亚克隆 在“反向”序列中的位置5′端 3′端Y1522 643Y2594 667Y3508 665Y4558 752Y5545 665由于表中所鉴定的所有基因序列必定含有表面决定基的编码序列，所以显然抗原决定基的编码序列位于594位(5′端)和643位(3′端)核苷酸之间。因此与该相对较短序列互补且相当的遗传序列及由该编码区产生的肽是本发明特别优选的一个方面。
仅用墨西哥血清分离能鉴定完全不同之抗原决定基的第二组克隆。
表2亚克隆 在“正向”序列中的位置5′端 3′端ET2-2 2 193ET8-3 2 135ET9-1 2 109ET13-1 2 101
该抗原决定基的编码系统位于第2位(5′端)和101位(3′端)核苷酸之间。因此与该短序列相关的遗传序列也是优选的，如用该编码区域生产的肽。
用于制备含有HEV特异性抗原决定基之多肽的特别优选的亚克隆是406.3-2和406.4-2，它们的序列已在上文中描述。这些序列可从得自一个墨西哥病人粪便的扩增的cDNA文库中分离到。利用本节中描述的方法，已试验了由这些克隆表达的多肽对许多不同的人HEV阳性血清(从世界各地得到)的免疫反应性。如下面的表3中所显示，8份血清与406.4-2表达的多肽发生免疫反应，6份血清与406.3-2克隆表达的多肽发生免疫反应。
为了比较，表中也显示了各种人血清与上述表1中列出的Y2克隆的反应性。只有一份血清与该克隆表达的多肽反应。gt11载体的正常表达产物未见有免疫反应。
表3HEV重组蛋白质人血清的免疫反应性血清来源病期＊406.3-2 406.4-2 Y2λgt11FVH-21 缅甸 A - - - -FVH-8 缅甸 A - + + -SOM-19 索马里 A + + - -SOM-20 索马里 A + + - -IM-35 婆罗洲 A + + - -IM-36 婆罗洲 A - - - -PAK-1 巴基斯坦 A + + - -
表3(续)血清来源病期＊406.3-2 406.4-2 Y2λgt11FFI-4 墨西哥 A + + - -FFI-125 墨西哥 A - + - -F387-IC 墨西哥 C + + ND -正常 美国 - - - - -＊ A＝急性期 C＝恢复期参照特殊的实施例描述了本发明的方法，构建和使用。本领域内技术人员很清楚知道对上述内容的各种改变和修改并没有脱离本发明范围。
权利要求
1.一种衍生于肠道传染性非A/非B肝炎病毒因子的蛋白质，其中所说的病毒因子的基因组含有一个与质粒pTZKF1(ET1.1)中存在的1.33Kb DNA EcoRI 插入段的编码区同源的区域，所说的质粒是由保藏登记号为ATCC No.67717的大肠杆菌BB4菌株携带的。
2.根据权利要求1的蛋白质，该蛋白质是由所说的1.33Kb EcoRI插入段内的一个完整编码区域编码的。
3.一种衍生于肠道传染性非A/非B肝炎病毒因子的重组蛋白质，其中所说的病毒因子的基因组含有一个区域，该区域同源于有下示序列之DNA分子的编码区域第一个序列(SEQ ID No.1)
或第五个序列(SEQ ID NO.12)
或与之互补的序列。
4.一种蛋白质，其特征是(a)能与感染肠道传染性非A/非B肝炎之个体的抗体起免疫反应，(b)衍生于一种肝炎病毒因子，所说的病毒因子的基因组含有一个与pTZKF1(ET1.1)中存在的1.33Kb DNA EcoRI插入段同源的区域，其中所说的质粒由保藏登记号为ATCC No.67717的大肠杆菌BB4菌株所携带。
5.根据权利要求4的蛋白质，该蛋白质是由所说的1.33Kb EcoRI插入段内的一个编码区编码的。
6.一种蛋白质，该蛋白质(a)能与感染了肠道传染性非A/非B肝炎之个体中存在的抗体发生免疫反应，(b)由遗传序列406.3-2或406.4-2或其片段编码。
7.一种检测试验个体中肠道传染性非A/非B肝炎病毒因子感染的方法，其包括提供一种(a)与肠道传染性非A/非B肝炎感染个体中存在的抗体发生免疫反应，(b)衍生于一种肝炎病毒因子的肽抗原，所说的病毒因子的基因组含有一个与pTZKF1(ET1.1)中存在的1.33Kb DNA EcoRI插入段同源的区域，且所说的质粒由保藏登记号为ATCC No.67717的大肠杆菌BB4菌株所携带。用该抗原与得自试验个体的血清反应，以及检测抗原中存在的结合抗体。
8.根据权利要求7的方法，其中所说的血清抗体是IgM或IgG抗体，或者是二者的混合物，将提供的抗原附着到一种载体上，所说的反应包括使这种血清与载体接触，且所说检测包括使载体和结合的血清抗体与一种报道物标记的抗人抗体反应。
9.一种用于检测血清抗体存在的药盒，其中所说的抗体是诊断肠道传染性非A/非B肝炎感染的，该药盒包括一种表面结合了重组肽抗原的载体，所说的抗原是(a)与存在于肠道传染性非A/非B肝炎病毒因子感染之个体内的抗体发生免疫反应，(b)衍生于一种肝炎病毒因子，该病毒因子的基因组含有一个与pTZKF1(CT1.1)质粒中存在之1.33Kb DNA EcoRI插入段同源的区域，且所说的质粒由保藏登记号为ATCC No.67717的大肠杆菌BB4携带，以及一种报道物标记的抗人抗体。
10.一个衍生于肠道传染性非A/非B肝炎病毒的DNA片段，其中所说的病毒因子的基因组含有一个与质粒pTZKF1(ET1.1)中存在的1.33Kb DNA EcoRI插入物同源的区域，且所说的质粒由保藏登记号为ATCC No.67717的大肠杆菌BB4所携带。
11.根据权利要求10的片断，该片断衍生于所说的1.33Kb EcoRI插入段。
12.一种含有遗传序列406.3-2或406.4-2或其片断的DNA分子，其中所说的片断至少包含12个相连续的核苷酸。
13.一个衍生于肠道传染性非A/非B肝炎病毒因子的DNA片断，所说的病毒因子的基因组含有一个与下列序列内的DNA片断同源的区域第一个序列(SEQ ID No.1)
第四个序列(SEQ ID NO.10)
或与之互补的序列。
14.根据权利要求13的DNA片断，其中所说的片断含有一个与所说的第一个序列中的第2到101位核苷酸，第二个序列中的第594到643位核苷酸同源的编码序列，或者与所说的编码序列互补的序列。
15.存在于一个容器或分离容器中的药盒，该药盒包括一对衍生于一个双链DNA片断两相对链的非同源区域的单链引物，其中的双链DNA片断来源于肠道传染性肝炎病毒因子，所说的因子的基因组含有一个同源于pTZKF1(ET1.1)质粒中存在之1.33Kb DNA EcoRI插入段的区域，且所说的质粒由保藏登记号为ATCC.No.67717的大肠杆菌BB4菌株所携带。
16.根据权利要求15的药盒，该药盒衍生于所说质粒中EcoRI双链插入段的相对链。
17.一种检测生物学样品中是否存在肠道传染性非A/非B肝炎病毒因子的方法，其包括制备来自样品的双链DNA片断的混合物，使该双链片断变性，在该变性的双链片断中加入一对衍生于一个双链DNA片断之相对链的非同源区域的单链引物，其中的DNA双链片断衍生于肠道传染性肝炎病毒因子，其中所说的病毒因子的基因组含有一个同源于pTZKF1(ET1.1)质粒中存在之1.33Kb EcoRI插入段的区域，且所说的质粒由保藏登记号为ATCC No.67717的大肠杆菌BB4菌株所携带。使所说的引物与所说的双链DNA片断的相对链的同源性序列区域杂交，其中所说的双链DNA片断衍生于肠道传染性非A/非B肝炎病毒因子，使加上引物片断的链在DNA核苷酸存在下与DNA聚合酶反应，生成含有引物序列的新DNA双链，以及重复上面所说的变性、加入、杂交和反应步骤，直至达到所需的序列扩增程度。
18.根据权利要求17的方法，其中所说的引物衍生于所说质粒之EcoRI双链插入段的相对链。
19.根据权利要求17的方法，该分方法用于检测由用该病毒因子感染的培养之细胞样品中病毒因子的存在。
20.一种用于免疫个体使之免受肠道传染性非A/非B肝炎病毒因子感染的疫苗，该疫苗包含一种加在药物学上可接受的佐剂中的衍生于肠道传染性非A/非B肝炎病毒因子的重组蛋白质，该病毒因子的基因组含有一个同源于pTZKF1(ET1.1)中存在之1.33Kb DNA EcoRI插入段的区域，且所说的质粒由保藏登记号为ATCC No.67717的大肠杆菌BB4菌株所携带。
21.根据权利要求20的疫苗，其中所说的蛋白质衍生于所说质粒中的EcoRI插入段。
22.用于免疫个体使之对抗HEV感染的疫苗，该疫苗包含一种药物学上可接受的佐剂和其中的由遗传序列406.3-2或406.4-2或其片断编码的蛋白质。
23.在分离肠道传染性非A/非B肝炎病毒因子或由该病毒因子产生之核苷酸片断的方法中，其改进包括利用得自肠道传染性非A/非B肝炎活性感染之人或cynomolgus猴的胆汁作为所说病毒因子的来源。
24.根据权利要求23的方法，其中胆汁得自于被感染的cynomolgus猴。
25.一种人的多克隆抗血清，该抗血清得自用肠道传染性非A/非B肝炎病毒因子衍生的蛋白质免疫的人，所说的病毒因子基因组含有一个同源于pTZKF1(ET1.1)质粒中存在之1.33Kb DNA EcoRI插入段的区域，且所说的质粒由保藏登记号为ATCC No.67717的大肠杆菌BB4菌株所携带。
全文摘要
本发明公开了一种衍生于肠道传染性非A/非B肝炎病毒因子(HEV)的病毒蛋白质。在一个实例中，该蛋白质与肝炎病毒因子感染之个体中存在的抗体发生免疫反应。该蛋白质可用于检测肠道传染性因子感染的诊断方法中。已鉴定出与不同的HEV病毒株感染之个体血清起反应的特异性抗源决定基。本发明还公开了衍生于该病毒因子之克隆序列的DNA探针。利用对病毒衍生之DNA片断探针特异性扩增反应，可将这些探针用于鉴定整个病毒因子，并对其进行序列分析，以及用于检验被感染样品中病毒因子的存在。
文档编号C12N15/09GK1063507SQ91103058
公开日1992年8月12日 申请日期1991年4月5日 优先权日1990年4月5日
发明者格雷戈里·R·雷耶斯, 帕特里斯·O·亚保, 丹尼尔·W·布雷德利, 克日什托夫·Z·克拉夫津斯基, 艾伯特·谭, 柯克·E·弗赖伊 申请人:基因实验室有限公司, 美国政府