专利名称：抗制瘤素m单克隆抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及到抗制瘤素M的单克隆抗体。本发明的抗体特征在于能够结合到制瘤素M上，抑制制瘤素M受体结合，和/或抑制制瘤素M的生物活性。本发明的单克隆抗体可以用来在体内或体外检测制瘤素M的存在和/或调节制瘤素M的生物活性。
目前公认，体细胞杂种(“杂种”)是不能从短期原始培养中得到的特定细胞产物的一个重要来源。关于这方面的最佳实例是由Milstein和其他人建立的产生杂交骨髓瘤的系统，用这种杂交骨髓瘤可以制备一种抗选择性抗原的单克隆抗体(Kohler和Milstein，1985，自然杂志(伦敦)256∶495;Galfre et al。，1977，自然杂志(伦敦)266∶550)。这种杂交产物可以不断地提供特异性抗原的单克隆抗体。且这些抗体可以作为药剂用于任何已经预先运用过抗体的方法中，但是它还赋予了高认别力、低背景和能够不断提供抗体来源的优选性。
一般情况单克隆抗体的制备首先包括免疫接种、免疫应答细胞的分离，这些细胞在例如聚乙二醇中，与所选择的不断地分裂的不能够分泌免疫球蛋白的肿瘤细胞(“未灭活的”)进行融合。将所产生的细胞(杂交瘤)在，例如，HAT(6-羟基嘌呤，氨基喋呤，胸苷)培养基中生长被识别。每个杂交瘤都是一种单一的抗体形成细胞和肿瘤细胞的融合产物。这种杂交瘤具有前者的分泌一种单一特异性抗体的能力和后者的永久成活能力，使之能连续地繁殖，从而提供一种可以永久产生单一特异性抗体的细胞后代。
本发明涉及到对制瘤素M具有特异性的单克隆抗体的制备和运用，制瘤素M是一种对多种正常和转化细胞具有多效性效应的新型细胞分裂素(Cytokine)。具有本文所描述的单克隆抗体特征的任何单克隆抗体都属于本发明的范围之内。例如，能够竞争性抑制本文所述单克隆抗体与其制瘤素M抗原决定簇的免疫特异性结合和/或能调节制瘤素生物活性的一种单克隆或嵌合性抗体均属于本发明的范围之内。
用于描述本发明的实施例中使用了杂交瘤技术以产生本发明的抗制瘤素M抗体，但是本发明的范围并不局限于这些细胞杂交技术的运用。根据是否能够与天然制瘤素M，变性制瘤素M，或者两者都可以形成免疫沉淀物对这些典型的抗体进行了分类。每一类还据其对制瘤素M调节的生长抑制的阻断能力和/或制瘤素M与其细胞表面受体结合的能力而进一步特征化。这种抗体可以用于绘制新型制瘤素M蛋白质的表面决定簇及功能位点结构图。
下列所用术语具有如下所述的含义DDEIA-双决定性酶联免疫测定GIA-生长抑制测定HRP-辣根过氧化物酶micro-EIA-微量酶联免疫测定MAb-单克隆抗体OM-制瘤素MRRA-放射性受体测定OM1-1R10F11单克隆抗体OM2-11R2F8单克隆抗体OM3-12R13D7单克隆抗体
OM4-4R12C7单克隆抗体OM5-3R9D9单克隆抗体OM6-3R13F4单克隆抗体OM7-12R13B5单克隆抗体OM8-12R19E3单克隆抗体
图1表示从cDNA编码制瘤素M稳定转染的CHO细胞系的上清液中得到的35S-蛋氨酸和35S-半胱氨酸标记的制瘤素M的免疫沉淀试验。图1A表示抗制瘤素M单克隆抗体与“天然”代谢标记的制瘤素M(从代谢性标记的CHO转染物中收集的上清液)的一系列反应。图1B表示这些相同抗体与从代谢性标记的CHO细胞中收集的上清液的反应，这些上清液通过用SDS，2-巯基乙醇处理以及在与单克隆抗体一起培养前煮沸而使之变性。谱带1阴性对照抗体;谱带2OM1;谱带3OM5;谱带4OM6;谱带5OM4;谱带6OM2;谱带7OM7;谱带8OM3;谱带9OM8。
图2提供了两种不同抗制瘤素M单克隆抗体在GIA测定中对A375黑色瘤细胞系的中和活性测定数据。图2A表示不同浓度的OM2的活性而图2B表示不同浓度OM1的活性。
图3表示在放射性受体测定中各种抗制瘤素M单克隆抗体对125I-制瘤素M与H2981肺癌细胞系结合的影响。
图4表示通过EIA所测定的两种不同抗制瘤素M单克隆抗体与用含有氨基酸缺失或改变的一系列突变制瘤素M结构转染的COS细胞所分泌的上清液之间的结合。所提供的数据是表示oD460时的总吸收单位。没有减去背景结合。在此图中，“del”表示从C-末端去掉的最后一个氨基酸，而英文字母表示所进行的氨基酸变化。
图5表示不同的抗制瘤素M单克隆抗体对由亲代结构，“SPOM”，或缺失突变体△44-47分泌的制瘤素M的免疫沉淀能力比较。谱带1阴性对照抗体;谱带2OM1;谱带3OM2;谱带4OM3。
图6表示由两种不同抗-制瘤素M单克隆抗体OM3和OM4测定的表面决定簇的定位图。将以吸收单位表示的OM3和OM4的相对结合与阴性对照抗体和从质粒△188-227，△188-227/L108S，和GAG104转染的COS细胞的无血清条件培养基中得到的OM的结合进行比较。结合水平与COS细胞(“SPOM”)分泌的OM的结合水平进行比较(Linsley，et al.，1990，Mol.Cell.Biol.101882-1890)。
图7是可以影响一系列抗制瘤素M单克隆抗体结合的制瘤素M突变图解。OM引导顺序位于残基-25到-1。从COS细胞中分泌的未加工分子为227个氨基酸长，被切割成一种成熟的196个氨基酸的蛋白质。(Linsley，et al.，1990，Mol.Cell.Biol.101882-1890)。在184(△)以内和包括184的C-末端氨基酸缺失可以破坏OM1和OM2的结合。另外，通过残基22-36或44-47的缺失可以取消OM2结合。抗体OM3的表面决定簇位于含有残基108(箭头所指)的位点，因为在这个残基处把亮氨酸换成丝氨酸可以破坏这种mAb的结合。在残基104( )处插入甘氨酸-丙氨酸-甘氨酸三肽可以取消OM4结合。
本发明涉及到对制瘤素M(一种对多种不同的正常和转化细胞具有多效性作用的新型细胞分裂素(Cytokine))具有特异性的单克隆抗体。并对结合制瘤素M，抑制制瘤素M受体结合，和/或抑制制瘤素M生物活性的单克隆抗体进行了描述。
所描述的单克隆抗体可以用来绘制制瘤素M的表面决定簇图并且定义其领域的结构-功能关系。这种抗体可以用于诊断测定，例如，检测制瘤素M，或制瘤素M突变形式的存在。也可以使用这种单克隆抗体在体内或体外调节制瘤素M的生物活性。通过下面的章节对本发明进行详细的描述。
由对制瘤素M的特异性所定义的单克隆抗体的特性对定义天然或变性形式的制瘤素M的各种表面决定簇的单克隆抗体进行了描述。并且根据他们对制瘤素M生物活性抑制能力和/或结合细胞表面受体的能力对单克隆抗体进一步分类。能够竞争性抑制所述单克隆抗体与他们的制瘤素M表面决定簇免疫特异性结合的任何单克隆抗体，包括嵌合抗体，都属于本发明的范围之内。
制瘤素M抗原的识别制瘤素M起初以其对人体癌细胞系的抑制性作用而被鉴别，它首先是从佛波醇12-十四酸盐13-乙酸盐“PMA”)-诱导的人体组织细胞淋巴瘤细胞(Zarling et al.，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)839739-9743)和从激活的T淋巴细胞(Brown et al.，1987，J.Immunol.1392977-2983)中分离出来。该分子是一种含有Mr＝28，000的单一多肽链的热和酸稳定性蛋白质。象其他自然形成的生长调节因子一样，制瘤素M具有各种生物活性。发现它对某些，但不是全部的，人体癌细胞系具有生长制抑作用。相反，制瘤素M可以刺激某些正常成纤维细胞，如人体包皮成纤维细胞或WI-38细胞的生长(Zarling et al.，1986，Proc.Natl.Acad.Sci(USA)839739-9743)。已经克隆和定序出制瘤素M的基因，并且最近在哺乳动物细胞中已经表达出一种活性的重组制瘤素M(见于1988年1月15号申请的美国申请流水日.144，574，相同的欧洲专利申请
发明者苏珊·F·拉德卡, 彼得·S·林斯雷, 莫罕默德·肖亚伯 申请人:布里斯托尔-米尔斯·斯奎布公司