专利名称：治疗性肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及治疗性肽，尤其涉及适用于制备疫苗或者感染的其他治疗物以及筛选在感染的治疗中具有潜在药物活性的化合物的治疗性肽。
本发明的发明者以前发现，与癌胚抗原有关的细胞粘附分子(CEACAM)是粘膜病原体，特别是呼吸道病原体，如脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)、流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)和粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)的受体。CEACAM属于癌胚抗原(CEA)家族，该家族是免疫球蛋白超家族的一个成员。CEA基因家族包括表面表达的亚家族(CEA)和分泌型亚家族(妊娠特异的糖蛋白，PSG)。与膜相关的亚家族被重新界定为CEACAM(与CEA有关的细胞粘附分子)20，该亚家族包括许多有关的糖蛋白，其中CEACAM1在不同的人体组织中表达地最为广泛12。本发明的发明者报导的这些研究中主要使用CEACAM1(以前被命名为CD66a和BGPc)转染了中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，CEACAM1包含四个细胞外结构域、一个TM区和一个短(S)或者长(L)的细胞质尾(其分子的表达式为NA1BA2-TM-S或L)。此外，还使用了包含一个或者多个细胞外结构域的可溶性截短的构建体。以前的研究表明脑膜炎奈瑟氏菌和流感嗜血杆菌主要以一些CEACAM的N端结构域为靶标7，9，10。这种靶向定位可以导致对细胞表面的附着以及对细胞的侵袭9。此外，细菌可以结合吞噬细胞上以及T和B淋巴细胞上的CEACAM。这种相互作用可以导致细菌细胞死亡8、目标细胞死亡或者免疫功能的抑制，例如在奈瑟氏淋病球菌(N.gonorrhoeae)(与脑膜炎奈瑟氏菌非常相关)与T和B淋巴细胞上的CEACAM结合时，导致T和B淋巴细胞的免疫功能的抑制21，22。
由于CEACAM长期被认为与奈瑟氏菌中与外膜不透过性有关的Opa蛋白结合，而流感嗜血杆菌和粘膜炎莫拉氏菌都不产生Opa蛋白，所以在流感嗜血杆菌和粘膜炎莫拉氏菌中发现存在CEACAM结合配体对于本发明的发明者来说是个意外。在以下对本发明的描述中，将特别涉及粘膜的感染，特别是呼吸道膜的感染，或者是耳部的感染(特别是中耳炎)，但是应该理解的是，在涉及CEACAM受体的其他部位感染，例如在生殖器粘膜或者尿道中的感染或其他受体结合过程，或者在可能从粘膜表面散布细菌的人类其他部位的感染中，本发明有同样的效用。
粘膜病原体脑膜炎奈瑟氏菌(Nm)、流感嗜血杆菌(Hi)和粘膜炎莫拉氏菌(Mx)都是人类特异的生物，并且存在于上呼吸道中，从那里它们可以散布，导致严重的感染。至多25％的健康个体的鼻咽中可能携带有不同血清群的脑膜炎球菌菌株1。但是，在许多个体中，该生物侵袭粘膜屏障，导致发展最为迅速并且极为严重的疾病之一。增加宿主对于脑膜炎球菌感染易感性的确切因素还不完全清楚。而且，群体特异的疫苗提供的有限保护以及B组多糖的非免疫原性成为需要进行基础研究，以理解宿主的易感性和鉴别突出的被膜下特征的基础，该被膜下特征可以作为对抗脑膜炎球菌的共同靶。本发明的发明者进行的研究提供了对脑膜炎球菌建群的分子基础、脑膜炎球菌建群与人类屏障细胞(上皮细胞和内皮细胞)以及吞噬细胞相互作用性质的理解。最近一些年来，一直研究共生奈瑟氏菌属的粘膜建群的基础，以理解区别大量无害的群落和偶然出现的但是严重的病原体例如脑膜炎奈瑟氏菌的特征。此外，这些研究测定了共生奈瑟氏菌是否可以被用作脑膜炎奈瑟氏菌可能的疫苗抗原的载体。
至多75％的健康个体可能携带属于流感嗜血杆菌物种的菌株2。尽管作为Hib疫苗的结果，在西方b型疾病的发病率有了显著的降低，但是由未分型的Hi菌株(NTHi)导致的疾病仍然是一个主要问题。NTHi导致局部以及扩散的感染，包括会厌炎、中耳炎、蜂窝组织炎、肺炎、心内膜炎、菌血症和脑膜炎。中耳炎是儿科医学的主要问题之一，而NTHi是儿童在人生第一年中20％以上发病的原因2，3。NTHi还与具有慢性阻塞性肺炎(COPD)和囊性纤维化病人的急性复发性和持久性感染有关。是什么决定了这些病人中由NTHi导致的复发性感染，或者儿童中中耳炎多次发作，这还不清楚。
粘膜炎莫拉氏菌是人类呼吸道中的另一种寄生菌，通常与Hi一起从局部感染病例中分离出。这两种生物都与鼻窦炎和哮喘的恶化有关5，6。Mx是导致儿童中耳炎的第三种最常见病因(据估计为每年300到400万病例)。它还导致成年人中的下呼吸道感染，特别是在患COPD的病人中5。在罕见的情况下，它与扩散性感染有关5。Hi和Mx都导致持续性感染，并且认为它们可以通过组织渗透逃过宿主的免疫机制以及抗生素的作用4。已经研究了Mx的许多外膜蛋白的粘附性质。但是几乎没有发现Mx的细胞受体，而且许多病原性机制的详情有待研究4，5，6。
呼吸道粘膜病原体的一个基本需要是与呼吸道上皮细胞建立稳固的联系。这些人类病原体的靶标是人类特异的分子，研究必须要有体外培养的人体组织和器官培养。粘附通常由细菌相和抗原性可变的结构来介导。此外，已经愈加清楚地知道病原体的粘附是多方面的，而且环境适应对于粘附的方式起重大的作用。尽管许多最近的研究已经开始确定复杂的细胞靶向机制的不同阶段，但是对环境适应的详情或者宿主和微生物之间的交流还有待描述。
本发明的发明者最近进行的研究显示Nm7-9和Hi10，11，具有一些独特的机制和另一些共有的机制，用来靶向某些人类细胞表面受体的CEACAM12。
而且，本发明的发明者最近发现粘膜炎莫拉氏菌的临床分离株也以人类的CEACAM分子为靶向。此外，现在已经发现一种莫拉菌的高分子量外膜蛋白与该受体结合。已经证明CEACAM在不同组织12，包括在呼吸道上皮细胞中的表达24。这些发现提示对CEACAM分子的特异靶向对于呼吸道细菌来说是一个特别的有利条件，它可能是由于趋同进化的结果而出现的。
在脑膜炎奈瑟氏菌的粘附因子中有菌毛(伞毛)13，14，16以及外膜不透过(opacity)蛋白，Opa和Opc15，16。Nm菌毛是长的丝状蛋白结构，由多个伞毛蛋白亚基组成。一般认为它们是有被膜细菌最重要的粘附素13，14，16，原因是被膜部分或者全部掩盖了外膜配体，导致配体的功能效力降低，而在完全被膜细菌中菌毛穿过被膜，仍然具有功能。Opa属于抗原性可变的蛋白家族，在脑膜炎奈瑟氏菌和淋病奈瑟球菌中都存在。在脑膜炎球菌中，有3-4个opa基因座编码相关的、具有4个暴露于表面的环的跨膜蛋白，其中3个环有序列变异16，17。另一个跨膜蛋白Opc基本上没有变异15，16。在过去的12年中，本发明的发明者对Nm菌毛的结构功能关系、Opa和Opc蛋白的毒力进行了研究，发现了奈瑟球菌属不透过蛋白的两个人类受体。而且发明者对表面唾液酸在细菌与人类靶细胞相互作用中的功能以及LPS和其他因子在细胞毒性中的作用进行了研究。
本发明者们鉴定了从莫拉菌外膜蛋白中分离出的结合CEACAM受体的高分子量配体，从而导致本发明。
配体的性质可以通过其在SDS-PAGE中的迁移模式进行描述，其SDS-PAGE迁移模式表明USP家族蛋白的特点，即配体在长时间煮沸后，分裂为分子量在大约60到150kD之间的单体。
在Mx菌株ATCC 25238(MX2)中的配体被鉴定为UspA1，并且测定了其氨基酸序列。该配体的特点被进一步研究，以确定受体结合的区域或者结构域，即结合受体的肽或者与肽相关的性质。
因此，本发明提供从粘膜炎莫拉氏菌外膜蛋白中分离出来的与CEACAM受体结合的配体，其中所述的配体是多肽，该多肽包含受体结合结构域或由受体结合结构域组成，该受体结合结构域包含选自以下的氨基酸序列或由选自以下的氨基酸序列组成图6所示序列的第463到863残基、527到623残基、527到668残基、527到863残基、427到623残基、427到668残基以及427到863残基，或者其片段、同源物、功能等价物、衍生物、简并物(degenerate)或羟基化、磺化或者糖基化产物，或者其他次级加工产物。
在一个优选的实施方案中，配体是一种多肽，该多肽包含选自以下的氨基酸序列或由选自以下的氨基酸序列组成图6所示序列的第527到623残基、527到668残基以及427到623残基，或者其片段、同源物、功能等价物、衍生物、简并物或羟基化、磺化或者糖基化产物，或者其他次级加工产物。
在这里使用配体一词，既是指与受体结合的整个分子，又是指上述分子的包括配体的受体结合结构域的任何部分使其保持受体结合性质。因此“配体”包含了仅仅由受体结合结构域组成的分子，即受体结合所需的一个或者几个肽区域。
在另一个优选的实施方案中，所述多肽包含至少一种图6所示序列的第427到623残基区域内的保守序列，或由至少一种图6所示序列的第427到623残基区域内的保守序列组成，其在图27所示序列对比中可以鉴定。因此，在这个实施方案中，该多肽包含以下氨基酸序列的至少一种或由以下氨基酸序列的至少一种组成QHSSDIKTLK，NVEEGLLDLSGRLIDQKADLTKDIK，NVEEGLLDLSGRLIDQKADIAKNQA，DIAQNQT，DIQDLAAYNELQD，QTEAIDALNKASS，TAELGIAENKKDAQIAKAQANENKDGIAK，NQADIQLHDKKITNLGILHSMVARAVGNNTQGVATNKADIAK，NQADIANNIKNIYELA，NQADIANNI，NIYELA。
将要理解，本发明的多肽配体可以包含这里列举的序列的受体结合结构域，其通过向这里列举的序列中在N末端、C末端、或者同时N末端和C末端添加氨基酸残基或者从这里列举的序列的N末端、C末端、或者同时N末端和C末端中删除氨基酸残基来修饰，这些被修饰的多肽保留结合CEACAM受体的能力。因此，本发明进一步提供包含多肽或由多肽组成的配体，在该多肽中50、40、30、20、10、5、3或者1个氨基酸残基被添加到这里列举的氨基酸序列的N末端、C末端、或者同时N末端和C末端中，或者从这里列举的氨基酸序列的N末端、C末端、或者同时N末端和C末端删除了50、40、30、20、10、5、3或者1个氨基酸残基，在这里所说的被修饰的多肽保留结合CEACAM受体的能力和/或引发针对非修饰肽的免疫反应的能力。优选地，560位置的氨基酸被保留在修饰的肽中。
关于本发明多肽的片段，倘若片段保留结合CEACAM受体的能力，任何大小的片段都可以被用在本发明中。分离只包含那些受体结合所需区域的最小肽可以是合乎需要的。
依照本发明的多肽配体可以通过在N末端、C末端、或者同时在N末端和C末端截短，而从已知的粘膜炎莫拉氏菌UspA1蛋白得到。因此，本发明进一步提供从N末端缺少至少(或者刚好)20、30、40、50、60、70、80、100、120、140、160等到520个氨基酸的野生型UspA1序列，和/或从C末端缺少至少(或者刚好)20、30、40、50、60、70、80、100、120、140、160、180或者200个氨基酸的野生型UspA1序列。优选地，该截短体保留CBACAM结合功能。可能的截短体可以选自下列表中所示的那些，所有这些都在本发明的范围内。
表I.野生型UspA1蛋白N末端和C末端的可能截短组合
可以用这种方法截短的已知野生型UspA1序列是菌株ATCC25238(MX2；GenBank序列号AAD43465)，P44(AAN84895)，O35E(AAB96359)，TTA37 (AAF40122)，O12E(AAF40118)，O46E (AAF 36416)，V1171(AAD43469)，TTA24(AAD43467)的那些(见实施例10，表II)。
理想地，这个实施方案的UspA1截短体包含选自以下的氨基酸序列或由选自以下的氨基酸序列组成图6所示的序列中463到863残基、527到623残基、527到668残基、527到863残基、427到623残基、427到668残基以及427到863残基，或者其片段、同源物、功能等价物、衍生物、简并物或羟基化、磺化或者糖基化产物，或者其他次级加工产物；或者包含至少一种图6所示序列中427到623残基区域内的保守序列，或由至少一种图6所示序列中427到623残基区域内的保守序列组成，这在图27所示序列对比中可以鉴定，例如QHSSDIKTLK，NVEEGLLDLSGRLIDQKADLTKDIK，NVEEGLLDLSGRLIDQKADIAKNQA，DIAQNQT，DIQDLAAYNELQD，QTEAIDALNKASS，TAELGIAENKKDAQIAKAQANENKDGIAK，NQADIQLHDKKITNLGILHSMVARAVGNNTQGVATNKADIAK，NQADIANNIKNIYELA，NQADIANNI，NIYELA。
生产包含如这里公开的多肽配体的融合蛋白可以很方便。因此，在进一步的实施方案中，本发明提供包含根据本发明的多肽配体的融合蛋白。优选的地，根据这个实施方案的融合蛋白的全长序列与任何已知的全长序列在其全部长度上小于50％相同。
同源的多肽可以通过序列比较来鉴别。同源的多肽全长序列与这里公开的多肽序列或者它们的片段在全长序列上优选至少60％相同，更优选至少70％、80％、90％、95％或者99％相同，而且相同的越多越优选。优选地，同源的多肽保留结合CEACAM受体的能力和/或引发针对这里公开的肽序列或者它们的片段的免疫反应的能力。优选地，560位置的或同源位置的氨基酸是赖氨酸。
图20显示不同来源的多肽序列的对比，表明能够被修饰同时保留功能(即CEACAM结合能力)的序列区域。
本发明人已经测定，肽配体的CEACAM结合能力与通过圆二色性(CD)光谱学检测的以α-螺旋为基础的构象有关联，正好与无规卷曲结构相反。因此，在优选的实施方案中，本发明的肽配体或受体结合结构域或它们的片段或同源物或其他衍生物采用α-螺旋结构。可选择地，这种结构是一种卷曲螺旋结构。优选地，CD光谱学检测按照随附的实施例中描写的那样操作。
在进一步的实施方案中，本发明提供在结构上与这里公开的肽或者它们的片段同源的肽。结构上同源的肽是如上面描述的同源肽，它产生表示以α-螺旋为基础的构象的圆二色性(CD)光谱学图谱，正如
图18所示。这里公开的肽或者它们的片段的Mimotopes也被设想出来。Mimotopes可以包含D-氨基酸或者非天然氨基酸替代，但是仍然保留这里公开的肽的功能特征，包括表示以α-螺旋为基础的构象的CD图谱。
本发明人揭示的以α-螺旋为基础的构象显示，这里公开的肽具有球状亚基结构，这种球状亚基结构不依赖相关联的膜来获得与CEACAM结合的适当构象。因此，在更进一步的实施方案中，本发明提供一种包含本发明的肽配体或受体结合结构域的球状亚基分子，它不是全长的UspA1蛋白，它能够结合CEACAM受体而不需要外膜存在。优选这种球状亚基分子包含少于200个氨基酸，更优选少于100个氨基酸。
由于在Mx中存在杂合蛋白，它们可能含有来自UspA1和UspA2两个蛋白的嵌合表位23，所以结构和/或功能上等价的受体结合结构域也可以在其他的Usp A样蛋白中出现。包含这种等价受体结构域的配体也属于本发明的范畴。
肽配体的CEACAM结合特性意思是指它既有作为抗原的效用(即在疫苗中)，也有作为“抗生素”的效用，为此它被用于阻断CEACAM结合，从而防止病原体的结合和进入。
因此，配体或者受体结合结构域优选适合用于感染的预防或者治疗。
本发明还提供编码本发明配体蛋白的核酸序列以及其同源物、片段、多态物(polymorphism)、简并物和剪切变体。
本发明的配体或者其组合，可以被用于疫苗或者感染的其他预防性治疗物。
疫苗或者其他的感染预防性治疗物可以包含任何已知的佐剂、媒介物、赋形剂、粘合剂、载体、防腐剂等，以提供药物上可以接受的配体制剂，用于治疗病人。
本发明还提供了药物上可以接受的用于医疗的配体的制剂。
药物上可以接受的配体制剂可以用于治疗或者预防任何涉及到CEACAM受体的疾病，例如治疗或者预防感染、呼吸道疾病、肿瘤性疾病以及与肿瘤性疾病相关的病症和血管生成。
优选地，在进行感染治疗时，感染是粘膜的感染或者是通过粘膜出现的，特别是呼吸道感染。
最优选地，配体被用作针对脑膜炎奈瑟氏菌、流感嗜血杆菌和粘膜炎莫拉氏菌的疫苗或者用于对这些细菌的其他预防或治疗。理想地，配体被用作针对中耳炎的疫苗或者中耳炎的其他预防或治疗。
在进一步方面，本发明的配体还可以用于鉴别新型阻滞剂，该阻滞剂可用作治疗药剂，以保护易感群体和一般公众免受许多粘膜病原体的侵害。例如配体可以被用于鉴别受体类似物，这些类似物可以用于上面这些目的。
因此本发明还提供一种筛选试验，用于鉴别用作治疗药剂的新型阻滞剂，该试验包含筛选潜在的治疗药剂的步骤，该筛选是根据潜在的治疗药剂模拟本发明中配体的能力或者其与本发明中配体的同源性。本发明进一步提供治疗药剂，它们是通过上述的筛选试验鉴别出来的。
有效的疫苗组分可以通过使用本发明确定的受体靶向机制信息来制备，例如有生物活性的肽模拟物。这些组分能够防止细菌向粘膜上形成菌落或侵袭，并且诱导出具有阻滞、调理和杀菌作用的抗体。
由于CEACAM分子与癌症和发育等过程有关，所以由本发明的配体鉴别的衍生自细菌的生物活性肽序列可以用于研究在癌症和发育中CEACAM的作用。这些肽序列还可以作为潜在的抗癌药剂，用来控制或者治疗血管生成。
本发明人产生的关于本发明肽配体的构象的信息可被用于设计合成的纳米结构例如从塑料中。这样的结构将具有抗生物降解和为非免疫原性的优点。这样它将特别适合用作通过阻滞CEACAM受体起防止病原体的结合和进入的作用的“抗生素”。
在另一个实施方案中，本发明提供了结合CEACAM受体的配体在制备用于治疗或者预防疾病的药物中的用途，所述疾病中CEACAM受体参与了导致这种疾病的病原体的细胞靶向，在这种药物中，配体包含选自以下的氨基酸序列，或由选自以下的氨基酸序列组成图6所示的序列中463到863残基、527到623残基、527到668残基、527到863残基、427到623残基、427到668残基以及427到863残基，或者其片段、同源物、功能等价物、衍生物、简并物或羟基化、磺化或糖基化产物，或者其他次级加工产物。
适合用于本发明这方面的其他配体是多肽，该多肽包含至少一种图6所示序列中427到623残基区域内的保守序列，或由至少一种图6所示序列中427到623残基区域内的保守序列组成，这在图27所示序列对比中可以确定，例如QHSSDIKTLK，NVEEGLLDLSGRLIDQKADLTKDIK，NVEEGLLDLSGRLIDQKADIAKNQA，DIAQNQT，DIQDLAAYNELQD，QTEAIDALNKASS，TAELGIAENKKDAQIAKAQANENKDGIAK，NQADIQLHDKKITNLGILHSMVARAVGNNTQGVATNKADIAK，NQADIANNIKNIYELA，NQADIANNI，
NIYELA。
优选地，疾病选自由以下疾病组成的组感染、呼吸道疾病、肿瘤性疾病以及与肿瘤性疾病相关的病症和血管生成。
当病原体通过粘膜感染，或者侵入时，上面描述的药物具有特别的效用。
本文描述的药物特别适用于治疗或预防由粘膜炎莫拉氏菌引起的感染(疾病)。然而，本文描述的配体适用于制备用于治疗其中涉及CEACAM受体的任意疾病的药物，该疾病例如为由脑膜炎奈瑟氏菌和流感嗜血杆菌引起的疾病。
在特别优选的实施方案中，所述疾病是中耳炎。
本发明的配体还可被用于治疗由其它口腔细菌引起的疾病，例如龋齿。
口腔细菌具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)有龈病有关，而且与中耳炎、死产(still birth)和在罕见情况下与菌血症相联系。本发明人的最近的工作显示，多种具核梭杆菌的分离菌与CEACAMs结合并且CEACAM1与具核梭杆菌的结合可被本文所公开的多肽配体抑制，这提示本发明的配体或受体结合结构域在治疗或预防由这种病原体引起的疾病中具有效用。
D-7(根据本发明的优选多肽配体)阻滞非被膜菌(未显示)和被膜菌与HeLa-CC1H结合的能力(实施例7)、阻滞与多种CEACAM结合的能力和它抗许多粘膜机会致病菌物种的功效(实施例7)，使得它成为一种具有显著潜能的抗微生物剂。另外，它引起阻滞Mx粘附的抗体反应的能力(实施例8)提示它作为预防中耳炎或其中通常涉及Mx的肺感染的疫苗候选物(单独或作为多成分疫苗(与其它Mx抗原例如UspA2、Hag/MID、OMPCD、Mcap一起)的一部分)的潜能5。基于粘附素的疫苗已被成功地用于例如在小鼠膀胱炎模型中通过系统接种来抗尿路病原体大肠杆菌(Escherichia coli)29。
在其中获得特别有毒力的或耐抗生素的菌株的风险高并且可通过直接局部应用或经益生菌递送的多种情况下，可以考虑包括根据本发明的配体作为预防性药物。就通过碳水化合物-凝集素相互作用而粘附靶组织的细菌而言，在体外和动物模型中可溶性碳水化合物已成功地防止了感染30，31，32。局部应用对应于变异链球菌(Streptococcusmutans)蛋白SAI/II的合成肽显示抑制人受试者中突变链球菌的结合。研究每天使用漱口液中1mg.ml-1肽2周，并且这足以防止建群33。乳酸杆菌形状的益生菌已被用于防止许多感染34，35。另外，重组大肠杆菌菌株已被用作益生菌，其中LPS基因被修饰以编码志贺菌毒素受体的结构模拟物。口服该菌株显示可防止用产生志贺菌毒素的大肠杆菌致死攻击引起的小鼠死亡36。局部应用的干扰肽具有进一步的优点，因为当需要时，它们可以通过使用暂时益生菌或表达载体进行递送，该表达载体可根据计时或表达水平进行控制。因此可以控制暴露给抗微生物剂的时间长度37，38。
通过靶向受体的结合结构域的干扰模拟了细菌粘附并且不可能比天然共生细菌配体的结合更具有有害作用。另外，这样的特异性策略确保了对其中很少与CEACAM结合的其它共生微生物区系的耐受7，10，38。此外，占优势形式的肽的单体和单价性质更不可能激发不合乎需要的信号，该信号，对于CEACAMs而言，似乎是在受体群集时被诱导11，39。
对于通过进一步鉴别参与CEACAM相互作用和修饰的关键氨基酸以减少其大小，同时确保结合以及其体内寿命来改进D-7，可能存在余地。这类修饰将包括掺入非天然或D-氨基酸33。不可能发生对这种抗粘附/抗侵袭性治疗的抗性，因为细菌配体的任何变化有可能是它们本身导致功能的丧失和这种情况下的建群/感染。预期由于肽竞争而出现受体特异性完全改变的突变体将不比通常更频繁，因为在天然情形下对于受体的竞争可能是在病原体之间进行。因此，D-7具有用作抵抗多种病原体的抗粘附剂和用作疫苗候选物的潜能。
现在完全通过非限制性的实施例对本发明的实施方案进行描述，这些实施例参考下述附图。
图1显示了只有CEACAM1-Fc(1微克每毫升)可溶性受体构建体(白色、左侧的长棒)存在或者在CEACAM1 N-结构域特异抗体YTH71.3(灰色、中间的长棒)存在时，与三个被固定在硝酸纤维素上的Mx菌株的相对结合水平。在每种情况中CD33-Fc的结合可以忽略(黑色，右侧的长棒)。菌株1、2、3MX2(ATCC25238)，MX3，MX4(临床分离株)。结合的确定使用斑点印迹上层覆盖的方法，反应的强度使用NIH Scion成像程序进行光密度分析来定量。
图2显示在非解离(未加热，泳道1)的条件或者煮沸10分钟后(泳道2)的条件下分离出的菌株MX2蛋白的蛋白质印迹。印迹上面覆盖CEACAM1-Fc(1微克每毫升)孵育，用与辣根过氧化物酶偶联的抗人Fc抗体以及辣根过氧化物酶的底物来检测受体的结合。
图3显示了菌株MX2、MX3、MX4的变性全细胞裂解产物(分别在泳道1-3中)的蛋白质印迹。印迹上面覆盖CEACAM1-Fc(1微克每毫升；a)，抗UspA1肽抗体(10微克每毫升；b)以及抗UspA2肽抗体(10微克每毫升；c)孵育。注意在三个菌株中CEACAM1-Fc结合蛋白和抗UspA1结合蛋白具有相似的迁移模式。残余的未解离的蛋白大小约为250kD(由于使用了碱性磷酸酶测定，具有更高的灵敏度，所以在这里被检测到)，与CEACAM1-Fc结合。这些仅仅被抗肽抗体微弱识别，大概是因为合成的肽中包含的表位在未变性的蛋白中没有完全暴露，而随着复合物的变性而逐渐暴露。抗UspA2抗体与表观分子量大于200kD在煮沸后仍然未解聚的蛋白(这是UspA2蛋白所具有的一个性质)结合。
图4显示MX2的CEACAM1结合蛋白在电洗脱之后用胰蛋白酶消化的肽质谱图谱(4a)。输入到ProFound蛋白质鉴定数据库中的数据汇总于(4b)。鉴定的前10个蛋白以及其概率数值示于4c。排在第一位的候选者，这里是一个Z分值为2.34的UspA1蛋白，其详细情况示于(4d)，其中显示了匹配的肽的数目、它们在蛋白质中的位置，该蛋白质被覆盖的百分比以及这里未匹配的肽的清单。
图5显示了MX2的UspA1经过胰蛋白酶消化之后的片段的蛋白质印迹。A使用二抗(分别在B和C中使用的山羊抗人Fc和山羊抗兔Ig的混合物)的对照印迹。B覆盖CEACAM1-Fc以及山羊抗人Fc的印迹。C覆盖亲和纯化的抗UspA1肽的兔抗体(ETNNHQDQKIDQLGYALKEQGQHFNNR(SEQ ID NO1))(参见图6)，以及抗兔的免疫球蛋白的印迹。*＝具有分子量标记的泳道--在左侧标示出来。用双箭头指明的肽与CEACAM1-Fc发生强烈反应(B)，也和抗UspA1肽的抗体发生强烈反应(C)。由于抗UspA1肽抗体与最低分子量的肽(箭头所指)的结合，所以该CEACAM结合片段被鉴定为MX2的UspA1蛋白的N-199到K-863(参见图6)之间的C末端片段。
图6显示了MX2的UspA1蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。用粗体标示了用于在兔中制备免疫抗血清的UspA1特异的肽。CEACAM结合区域包含在划线的MX2 UspA1蛋白的C末端片段中。
图7显示了与CEACAM发生反应的胰蛋白酶水解肽的分离。使用1毫克每毫升的胰蛋白酶处理粘膜炎莫拉氏菌菌株MX2，在37摄氏度处理10分钟。胰蛋白酶消化的样品进行SDS-PAGE。染色之后，对50kD的区域进行电洗脱过夜。电洗脱出来的蛋白被冻干，用缓冲液重悬后上第二块胶。胶的一部分转移到硝酸纤维素膜上进行蛋白质印迹。在印迹上覆盖CEACAM1-Fc来确定与CEACAM发生反应的肽条带(Blot)。
“*”指的是被送去作N末端序列分析的肽。
图8显示MX2的UspA1蛋白在胰蛋白酶消化之后的一个肽的氨基酸序列(SEQ ID NO3)。所示的50kD胰蛋白酶水解肽(氨基酸463到863)结合CEACAM以及抗UspA1肽(氨基酸753到780，划线的)的抗血清。该分子量大约为50kD的CEACAM结合肽的N末端序列是“ALESNVEEGL”(SEQ ID NO4)，该序列出现在胰蛋白酶切割位点462号氨基酸之后。
图9是一幅示意图，显示了扩增产生uspA1基因片段用于进行重组蛋白表达的引物的位置。由引物P4和P7扩增出的DNA编码CEACAM1结合位点，还设计和使用了该区域的其他引物(字母A至I)。
图10显示了重组片段4-7的序列(SEQ ID NO5)。划线的区域是具有CEACAM1反应性的胰蛋白酶水解肽的N末端区域。片段4-7的预测分子量大约是26kD。加上组氨酸标记的片段的预测分子量约为28kD。截短的肽的位置用“T”标示出来(参见图13)。
图11是一幅示意图，显示了用于重组UspA1肽的一般克隆、表达以及纯化策略，如pQE30系统所表示。
图12是载体pQE30的图。
图13显示了CEACAM1-Fc在印迹覆盖试验中与重组子4-8的结合(泳道3)、与4-T的结合(泳道4)以及与4-7多肽的结合(泳道5)。泳道1含有密螺旋体对照重组肽，泳道2含有未诱导的包含4-8构建体的M15的裂解产物。
图14的蛋白质印迹显示了重组肽与抗组氨酸标记抗体(上)以及与CEACAM-Fc(下)的反应性。泳道2到4包含6-8肽，泳道1包含4-8肽作为对照。预测的肽迁移位置示于右侧。两个肽都与抗组氨酸标记抗体结合。但是尽管4-8与CEACAM1-Fc结合，但是6-8则不然。
图15显示D-8多肽与CEACAM1-Fc结合(泳道1)，但是不与用作对照的CD33-Fc结合(泳道2)。此肽的来源由其与抗组氨酸标记抗体发生反应得到证实(泳道3)。
图16是一幅示意图，显示了重组rUspA1片段的相对大小和位置。使用了重组的4-7用于细菌阻滞试验——参见图17。
图17显示，CHO-CEACAM1转染子在没有肽(A)的条件下孵育，或者与重组的对照肽(密螺旋体肽)一起孵育(B)，或者与UspA1 r4-7肽(序列与MX2菌株的相应，C和D)一起孵育，加入肽的浓度以及细菌如图所示，孵育的时间为2小时。在孵育结束时，漂洗掉未结合的细菌，结合上的细菌使用抗粘膜炎莫拉氏菌的多克隆抗血清以及与四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)偶联的二抗进行检测。重组的粘膜炎莫拉氏菌UspA1肽的浓度为1微克每毫升时，已经对异源的粘膜炎莫拉氏菌株(MX1)有了显著的抑制，且浓度为10微克每毫升时，对于流感嗜血杆菌结合有显著的抑制。
图18是显示重组D-7肽和具有K 560 I突变的D-7的圆二色光谱的图。该光谱显示D-7具有α-螺旋结构，而D-7(K 560 I)采用无规卷曲结构。
图19显示一系列不结合CEACAM1的跨越D-T区域的线性肽。有下划线的是对应于D-7的K560的K残基。
图20是十个菌株MxTTA24、TTA37、p44、O12E、O35E、O46E、MX2、V1171、MX3和MX4的UspA1蛋白质的氨基酸序列的D-7区域的序列对比。上端线显示多数序列。
图21是O35E D-7与MX2D-7的手工序列对比。上端线显示多数序列。
图22是显示按照MegAlignTM(DNASTAR Inc.)测定的Mx分离菌D-7区域的序列同一性的表。
图23显示重组肽D-7(而不是重组6-8即MX2的UspA1的残基E659-K863)抑制同源性和异源性菌株与表达CEACAM1的转染CHO细胞的结合。在无肽(第1栏)、有对照肽(2μg.ml-1；第2栏)或有D-7(2μg.ml-1；第3栏)的情况下预培养细胞后，添加细菌并通过在培养1小时后洗涤来除去非粘附细菌。然后使用抗不同菌株的抗血清和缀合罗丹明的二抗，检测与细胞结合的细菌。Mx粘膜炎莫拉氏菌，Nm.脑膜炎奈瑟氏菌；Hi流感嗜血杆菌。
图24是显示D-7抑制细菌-CC1-Fc相互作用的一系列图。(a)显示在肽浓度范围0.001-0.1μg.ml-1内，与同源性Mx菌株MX2(灰色栏)和与异源性菌株MX1(黑色栏)结合的受体的剂量依赖性抑制。C代表对照肽D-8Δ。显示平均值n＝3，*P＜0.015相对于单独的CC1-Fc。(b)重组D-7(黑色栏)而不是D-8Δ(灰色栏)抑制同源性和异源性物种的多个菌株(如上面每段所示)与CC1-Fc的结合。将来自不同属的不同分离菌的全细胞溶胞产物点样到硝化纤维素上并单独加载CC1-Fc或在所述肽(各2μg.ml-1)存在下。使用NIH Scion Image软件，通过光密度分析获得在所述肽存在下相对于它们不存在时的百分比抑制值。数据表示二至三个独立实验。
图25显示D-7抑制细菌与一系列表达CEACAM的细胞系结合。(a)如所示在无肽或有肽(2μg.ml-1)的情况下预培养细胞后，细菌与表达CEACAM1的转染CHO细胞相互作用的免疫荧光分析。在D-7存在下观察到了通过罗丹明标记显现的细菌粘附的抑制。(b)使用活细胞计数试验定量分析细菌与CHO-CEACAM1细胞结合的抑制。如所示，将靶单层与对照肽(2μg.ml-1；C)或一系列D-7一起预培养。显示了与对照肽相比用D-7的％抑制的平均值(n＝3-6，*P＜0.05)。a和b中使用的菌株是Mx(MX1)、Nm(C751D)、Hi(THi，Rd)和Hi-aeg(A3)，(c)D-7对Nm(C751D)与不同CEACAMs结合的抑制。在无肽、有对照肽(2μg.ml-1；灰色栏)或D-7(2μg.ml-1；黑色栏)的情况下预培养表达CEACAM1(CC1)、CEA或CEACAM6(CC6)的海拉(HeLa)细胞。使用免疫荧光分析并在各种情况下通过直接计数20个细胞，获得每个细胞粘附Nm的平均数量。(d)用表达Opa和Opc粘附素的菌株MC58的被膜和有菌毛的衍生物h18.18感染具有高水平CEACAM1-表达的海拉细胞系(HeLa-CC1H)，该海拉细胞系通过菌毛和Opa蛋白支持粘附。如所示，在先(pre)或同时(sim)添加D-7而不是D-8Δ，减少了细胞粘附。(e)如所示，在无肽，、有对照肽(2μg.ml-1)或D-7(2μg.ml-1)的情况下预培养细胞后，细菌与已知表达CEACAMs的A549肺上皮细胞相互作用的抑制。使用的菌株是Mx(MX1)、Nm(C751D)和Hi(Hi-aeg，A3)。
图26是显示抗D-7的亲和纯化的兔抗体既抑制同源性Mx与CEACaM1-Fc(CC1-Fc)结合，又抑制异源性Mx与CEACaM1-Fc(CC1-Fc)结合的图。在斑点印迹覆盖物实验中，使用NIH Scion Image软件通过光密度分析测定相对于无抗体对照的结合。对于测试的Mx菌株观察到了良好的抑制，但对于测试的其它细菌物种包括Hi(THi Rd &Hi-aeg A3)、Nm(C751A & C751D)和Ng(P9-13)则不是这样。数据表示三个独立的实验。
图27显示脑膜炎奈瑟氏菌与单独的HMEC1细胞(A)或在对照肽(B)或阻滞肽D-7(C)存在下的粘附。注意到在D-7存在下的几乎完全抑制。
图28是对应于MX2序列4-T片段的已知UspA1蛋白序列片段的多重对比。将在所有分析的序列中保守的残基画黑色阴影。将在它们存在的所有序列中保守，但在一个或多个序列中相应的位置有缺失的残基画深灰色阴影。当在所述位置存在的残基存在变异时，将共有残基画浅灰色阴影。
实施例1.粘膜炎莫拉氏菌株通过UspA1蛋白与人CEACAM1-Fc结合在本研究中使用的粘膜炎莫拉氏菌株(Mx)包括临床分离菌(MX3和MX4)以及从美国典型培养物保藏中心购得的参考菌株(ATCC25238，该菌株的一个克隆培养物被命名为MX2)。
受体覆盖试验显示Mx与CEACAM1-Fc受体构建体结合为了评价粘膜炎莫拉氏菌株与CEACAM1的相互作用，将细菌(大约4-8×106个)加到硝酸纤维素膜上，空气干燥后使用3％BSA-PBST封闭非特异结合位点。在硝酸纤维素条上覆盖CEACAM1-Fc(1-2微克每毫升)或者同时加入CEACAM1的N端结构域抗体YTH71.3。CD33-Fc(1-2微克每毫升)用作阴性对照。根据以前所述制备嵌合蛋白构建体11。通过偶联辣根过氧化物酶或者碱性磷酸酶的山羊抗人Fc抗体检测嵌合受体的结合。显色底物分别用二氨基联苯胺和过氧化氢或者硝基蓝四唑和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸。所有的菌株都与CEACAM1-Fc结合，但是都不与CD33-Fc结合(图1)。在单克隆抗体YTH71.3存在时受体的结合受到抑制，这提示该菌株与受体的N末端结构域结合。因此，所有的菌株与只包含N端结构域的CEACAM1的截短的N-Fc构建体都有相等的结合(未显示结果)。
粘膜炎莫拉氏菌中CEACAM1-Fc结合蛋白的鉴定将未经过事先热处理的或者在100摄氏度煮沸10分钟的Mx的全细胞裂解产物(大约3×107个细胞)加入到10％bis-tris聚丙烯酰胺(Invitrogen)凝胶的各泳道中，在180伏电泳45分钟。使用标准的印迹条件将凝胶上的蛋白转移到硝酸纤维素滤膜上。根据上面的描述，将可溶性嵌合构建体覆盖在膜上。在每种情况下都观察到与CEACAM1-Fc特异结合的单个蛋白。蛋白在凝胶上的迁移显示Mx的UspA1蛋白，因为细菌的裂解产物在上样时若没有加热变性则CEACAM1结合蛋白＞200kD的表观分子量迁移，如果裂解产物首先经过加热，则CEACAM1结合蛋白以降低的分子量(大约92kD)迁移(图2)。
抗UspA1的抗体而非抗类似蛋白UspA2的抗体与Mx菌株的CEACAM1-Fc结合蛋白有结合根据公布的粘膜炎莫拉氏菌的UspA蛋白的序列设计肽。即ETNNRQDQKIDQLGYALKEQGQHFNNR(SEQ ID NO1；UspA1肽)以及KDEHDKLITANKTAIDANKAS(SEQ ID NO6；UspA2肽)。肽通过N末端整合的半胱氨酸残基与KLH偶联，偶联的肽用于免疫兔(每只兔200微克肽)，免疫间隔14天。开始使用完全弗氏佐剂，之后使用不完全弗氏佐剂。在第0天和免疫之后每隔14天进行采血。使用与AminoLinkPlus柱(Pierce)偶联的适宜的肽来纯化多克隆抗体。在蛋白质印迹覆盖试验中使用UspA特异的抗体，浓度为1-10微克每毫升，抗体的检测使用偶联碱性磷酸酶的山羊抗兔二抗。印迹的显色如前所述。三个Mx菌株的CEACAM1-Fc结合蛋白在SDS-PAGE上的迁移与UspA1抗体结合蛋白的迁移相同，但是与UspA2抗体结合蛋白的迁移不同(图3)。
与CEACAM1-Fc共沉淀的粘膜炎莫拉氏菌配体被鉴定为UspA1细菌的过夜培养物用含有100mM的辛基βD吡喃葡萄糖苷的PBSB重悬，其中含有蛋白酶抑制剂混合物(pic；1mM PMSF，1mM E-64，1μM胃蛋白酶抑制剂A，6nM苯丁抑制素以及100μM EDTA)。样品在4摄氏度不断混和过夜。同时将100微升与Sepharose CL-4B偶联的蛋白A(Sigma)与20微克的CEACAM1-Fc或者CD33-Fc(做为对照使用)一同孵育，在4摄氏度过夜。然后用PBSB漂洗3次，去掉任何未结合的受体。15000g离心30分钟去除不溶的细菌物质。可溶性的提取物分别与两种受体-蛋白A-Separose复合物之一在4摄氏度孵育2小时(比例为5×108个细菌每微克的受体构建体)。在使用50mM的辛基βD吡喃葡萄糖苷和PBSB反复漂洗之后，在变性条件下用SDS-PAGE电泳和蛋白质印迹分析样品。
在与CEACAM1-Fc的共沉淀试验中，MX4产生了一个强烈染色的蛋白条带(约97kD)，而MX3产生一条相对弱染色的蛋白条带，约92kD。被共沉淀的蛋白的分子量与那些在受体覆盖实验中观察到的蛋白的分子量相符合(在图3中显示)。两个蛋白都不与CD33-Fc共沉淀。由于被共沉淀的蛋白与抗UspA1肽的抗体结合，所以它们被进一步确定为UspA1蛋白。此外，将MX4蛋白从凝胶上切下来之后，用MALDI-TOF质谱对其进行分析(见下面)。
通过MALDI-TOF质谱鉴定CEACAM1配体(a)Western覆盖样品。MX2和MX3的全细胞裂解产物在Trench胶中进行SDS-PAGE。用电洗脱的方法将与CEACAM1-Fc结合配体相对应的蛋白条带洗脱出来。将样品浓缩，加入第二块胶中的一个泳道中，进行电泳，然后对电泳之后适当的蛋白进行胶内胰蛋白酶消化。得到的肽使用基质辅助激光解吸/离子化-飞行时间(MALDI-TOF)质谱进行分析。图4a显示了得到的MX2的CEACAM结合蛋白质谱图谱的一个例子。得到的肽分子量输入ProFound蛋白鉴定位点中，得到的结果如图4b，c所示。在此有10个蛋白的分子量与粘膜炎莫拉氏菌的UspA1蛋白经过胰蛋白酶消化后产生的肽的预测分子量相配，该片段占UspA1蛋白的大约18％(图4d)。估算的Z分值为2.34，有力地提示该蛋白是UspA1(Z分值高于1.65就是高于95％；http//129.85.19.192/profound_bin/webProFound.exe)。此外，经类似分析，MX2的另一个非结合的高分子量条带被确定为UspA2。类似地对于MX3菌株，CEACAM1结合和非结合蛋白被分别确定为UspA1和UspA2。
(b)共沉淀的样品对于MX4，与CEACAM1-Fc共沉淀的蛋白(如上所述)也在一次全分类查询中经MALDI-TOF质谱被确定为UspA1，Z分值为2.27。12个肽被匹配上，覆盖了该蛋白的21％。
因此本研究确定在所述的参考和临床菌株中粘膜炎莫拉氏菌通过高分子量蛋白UspA1靶向人CEACAM1。
对UspA1和重组肽的酶切(a)UspA1经过胰蛋白酶酶切之后的肽与CEACAM1-Fc结合使用0.1-1毫克每毫升的胰蛋白酶(Sigma)处理MX2细菌悬液(1010个细胞每毫升)，在37摄氏度孵育1-4小时。消化后的裂解产物用SDS-PAGE缓冲液解离，煮沸并且上样进行电泳。转移至硝酸纤维素膜上之后，使用受体构建体CEACAM1-Fc或者亲和纯化的抗UspA1肽抗体覆盖印迹。与受体反应的小片段也与抗UspA1的特异抗体结合(图5)。
(b)卡他莫拉MX2菌株UspA1蛋白的CEACAM结合结构域的定位使用1毫克每毫升的胰蛋白酶处理MX2细菌悬液，37摄氏度处理10分钟。
胰蛋白酶消化的样品进行SDS-PAGE凝胶电泳。染色后，对50kD区域进行过夜电洗脱。冻干电洗脱出的蛋白，用缓冲液重悬，上第二块胶。胶的一部分转移到硝酸纤维素膜上，通过使用CEACAM1-Fc的蛋白质印迹覆盖，确定了与CEACAM反应的肽条带(图7)。
对应于分子量大约50kD和大约150kD的肽进行N末端测序。N末端的序列是ALESNVEEGL(SEQ ID NO4)(大约50kD的肽)和ALESNV(SEQ ID NO7)(大约150kD的肽)。150kD的蛋白显然是50kD蛋白的三聚体，因为它们有相同的N末端序列。该MX2 UspA1肽的N末端序列示于图8。
(c)重组肽构建的由图6所示的序列中1-449号氨基酸组成的N末端重组MX2肽与CEACAM不发生结合。这进一步显示大约50kD的胰蛋白酶消化后的肽(由图8所示的序列中的463-863号氨基酸组成)，具有ALESNVEEGL(SEQ ID NO4)的N末端序列，包含CEACAM结合结构域。
实施例2.在粘膜病原体的多重毒力决定簇上确定受体结合结构域脑膜炎奈瑟氏菌和流感嗜血杆菌通过与CEACAM上的重叠位点结合的配体靶向人CEACAM分子。本发明的Mx配体也靶向N结构域。这些观察结果显示了一个令人兴奋的可能性，即受体靶向可能涉及许多粘膜病原体配体上的相似特征。
由于Nm和Hi与CEACAM的相互作用受到在表面表达的可变结构域的结构特征影响，这提示它们可能包含相似的关键氨基酸，这些氨基酸的空间构型使它们能够与受体结合，这些关键氨基酸可能在可变蛋白中是保守的。确实，我们的研究和其他人的研究提示Opa的两个高变环(HV1和HV2)可能参与CEACAM靶向9，18。一项有力的技术可以确定配体和受体之间相互作用的可能决定簇，该技术是噬菌体展示，它可以用于确定模拟表位(模拟结合结构域的随机序列)19以及适体(aptamer)(与抑制配体结合的初始结构更为接近的序列)20。
本发明还使下面的情况变得十分可行，即与CEACAM结合的Mx配体结构域会做为其他结合CEACAM的粘膜病原体的模拟物，并且该配体的结构特征会有助于确定在Nm和Hi的配体靶向CEACAM的N端结构域所需的重要特点。Mx结构域的抗体可能具有确定其他能够靶向受体中相同、相似或者相近位置区域的配体的潜力。
目前正在使用已知的蛋白质工程方法以及重组DNA技术来开展确定MX2 UspA1中最小CEACAM1结合结构域的工作。可以通过以上描述的受体覆盖试验在体外筛选重组肽，以检测与受体结合的MX2结构域。组氨酸标记的肽可以在镍柱上分离，并根据需要切割组氨酸标记，并用于免疫兔和小鼠，以得到抗体，用于进一步的研究。
可以通过检查其免疫刺激性质以及其他功能例如对受体结合的阻滞，来确定对于生物应用具有适宜长度的肽。
实施例3.受体与配体相互作用所需的重要特征由于CEACAM的N端结构域足以使CEACAM与Opa蛋白相互作用，本发明的发明者正在使用噬菌体展示技术，也对CEACAM N端结构域的粘附表位进行研究。本发明的发明者已经使用对受体的丙氨酸扫描诱变9研究了受体上的配体结合区域的信息，此研究对于本研究是有所帮助的。还有对于这种情况，也可用配体覆盖试验对于携带有受体序列的嵌合噬菌体进行生物淘选(亲和浓缩)。
受体类似物具有阻滞多种菌株的潜能，这与产生的Opa蛋白类型无关，因为我们的研究已经显示尽管Opa蛋白具有抗原变异，但是对于初级粘附9，不同的Opa蛋白需要受体上具有相同的性质。另外有趣的是，注意到CEA抗原从肠道粘膜上脱落，并且有可能阻滞大肠杆菌菌株的粘附，而已知大肠杆菌也靶向CEACAM。这已经被提出做为一个先天免疫应对肠内病原体的机制。因此这些受体类似物用作治疗药剂12。
实施例4.与CEACAM结合的重组粘膜炎莫拉氏菌UspA1肽的制备概述沿着UspA1的全长由PCR扩增出许多片段，使用如图9所示的引物。如下描述获得重组肽。在第一轮，发现与CEACAM1结合的重组肽由P4和P8引物扩增得到的DNA编码，而不是由P1和P5之间的DNA区域编码，而且，P4到P7区域重组子与CEACAM1结合，而P6到P8区域则不能。在P4到P7区域内还使用了其他的引物。D-7区域保留了与CEACAM结合的性质。4-7片段的序列示于图10。
对于重组UspA1肽的一般克隆、表达以及纯化策略使用pBAD系统制备UspA1片段1-5。所需的PCR产物以TA克隆到pBAD载体中，并且使用TOP10大肠杆菌菌株进行扩增。剩余的步骤如图11所示，唯一的区别在于使用阿拉伯糖诱导pBAD。使用pBAD和pQE30(图11)两个系统制备片段4-7，得到相似的与CEACAM结合结果。剩余的片段使用图11中的策略进行制备。
载体和pQE30表达系统使用pQE30载体(图12)以及大肠杆菌菌株M15。M15包含质粒pREP4，该质粒编码一个抑制因子，该因子抑制了克隆到pQE30载体中DNA的转录。加入IPTG浓度达到1mM抑制了该抑制因子的编码，则克隆到pQE30中的片段得到转录。
克隆策略首先将PCR扩增产物连接到pCR2.1中。这样产生了一个稳定的宿主，扩增产物可以通过限制性酶切(BamHI/pstI)进行回收，这也保证了基因片段的两端都已被切割。pQE30也进行类似的酶切并且用凝胶纯化回收酶切后的载体，这也保证了两个限制性位点都已被切割。已经酶切的pQE30和UspA1扩增产物使用T4 DNA连接酶在16摄氏度连接过夜，连接产物转化入用氯化钙处理的大肠杆菌M15感受态细胞中。在含有氨苄青霉素(100微克每毫升)和卡那霉素(25微克每毫升)的LB琼脂平板上筛选转化子。挑取4-8个菌落在添加有抗生素的LB液体培养基中培养。3-4毫升的培养物离心得到菌体，用碱裂解的方法小量提取质粒。经过纯化的载体如上所述进行酶切，检查uspA1插入片段。包含具有正确插入片段大小的pQE30载体的细菌在50毫升培养基中生长，培养物用IPTG诱导(见下面)。然后使用蛋白质印迹筛选重组蛋白的表达。此外还对载体进行测序，以确定插入片段是否是正确的DNA区域，并且检查是否有任何的序列错误。
表达和纯化包含pQE30/uspA1构建体的M15生长在含有氨苄青霉素(100微克每毫升)和卡那霉素(25微克每毫升)的LB液体培养基中，振荡培养直至OD600＝0.5，然后加入IPTG至浓度为1mM。培养物进一步培养3-4小时，离心回收菌体。菌体沉淀物在缓冲液B(8M尿素，50mMTris，10％乙醇，2％Tween，5mM咪唑，pH7)中增溶1-3小时，20,000g离心20分钟除去膜物质。上清与镍树脂一起在摇床上孵育1-2小时，然后通过聚丙烯柱。用5-10毫升缓冲液B漂洗剩余的树脂，使用0.5毫升的洗脱缓冲液(缓冲液B中加入100mM咪唑)洗脱结合上的蛋白。洗脱的蛋白用SDS-PAGE检查，然后进行透析去掉尿素和其他的盐类。
重组片段A片段1-5和4-8这些由pBAD系统制备的片段显示1-5不与CEACAM1结合而4-8与CEACAM1结合。
B使用pQE30系统制备的片段4-8，4-8T，4-7以及6-8片段4-8是第一个制备的重组UspA1片段，在印迹覆盖试验中发现它与CEACAM1高度亲和地结合。除了全长的4-8重组UspA1肽以外，还观察到一个较小的、截短的蛋白。该肽(命名为4-T)也与CEACAM1结合，看起来其表达水平比4-8要低(图13)。对pQE30/4-T进行序列分析发现，由于一个错配(CAA到TAA)导致在残基Q624处出现一个终止密码子(参见图10)。
制备肽4-7和6-8以排除在6-8中出现第二个CEACAM结合位点的可能性。正如从肽4-T所预测的那样，4-7显示了与CEACAM的结合(图13)，而6-8没有与CEACAM结合(图14)。
C由pQE30系统制备的片段D-8和D-7发现rUspA1片段D-8(图15)以及D-7(未显示)与CEACAM1都结合。
重组肽4-7的生物活性粘膜炎莫拉氏菌菌株MX1以及流感嗜血杆菌菌株Rd与转染了CEACAM1的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞结合。它们的结合可以被粘膜炎莫拉氏菌的UspA1重组肽4-7抑制，但是不能被对照肽抑制(图17)。
在进一步的实验中显示，重组肽D-7(而不是重组6-8即MX2的UspA1的残基E659-K863)抑制同源性和异源性菌株二者与表达CEACAM1的转染CHO细胞的结合(图23)。在无肽(第1栏)、有对照肽(2μg.ml-1；第2栏)或D-7(2μg.ml-1；第3栏)的情况下预培养细胞后，添加细菌并在培养1小时后通过洗涤除去非粘附的细菌。然后使用抗不同菌株的抗血清和罗丹明缀合的二抗，检测与细胞结合的细菌。Mx粘膜炎莫拉氏菌，Nm.脑膜炎奈瑟氏菌，Hi流感嗜血杆菌。
实施例5.CEACAM1-结合肽的表征发现肽D-7是最强的结合重组肽。因此，MX2的D-7区域(142个氨基酸；参见图16)含有CEACAM1结合信息。
截短的肽4-T(197个氨基酸)保留微弱的结合(图13)。因此D-T区域可能含有具有CEACAM1结合能力的区域。
发现D-7中单一氨基酸取代，K 560 I，几乎废除了CEACAM1结合。
肽D-8中571-632区域的缺失(D-8Δ)导致CEACAM1结合的丧失。
制备了跨越D-T区域的线性重叠肽(图19)并测试了它们结合CEACAM1的能力。未观察到与CEACAM1的结合。
圆二色性光谱学用圆二色性(CD)光谱学分析了肽D-7和突变体D-7(K 560 I)。使用Jobin-Yvon CD6旋光分光计在室温下获得圆二色性光谱。在石英比色杯中测量浓度为0.1mg/ml的重组D-7和D-7(K 560 I)的光谱。所有光谱为8次扫描减去有关不含蛋白质的缓冲剂光谱的平均值并用Excel(Microsoft Inc.)作图。
获得的光谱显示，D-7具有α-螺旋结构，而D-7(K 560 I)采用无规卷曲结构(图18)。不希望受任何特定理论的束缚，提出Mx UspA1的CEACAM1结合需要基于α-螺旋的构象，可能是卷曲螺旋结构。
概述从上述结果，本发明人得出如下结论Mx UspA1的CEACAM1结合，除了基于α-螺旋的构象，可能是卷曲螺旋结构以外，还需要D-7中的区域。
Mx UspA1的CEACAM1结合结构域采用基于α-螺旋的构象(该构象是受体结合所需要的)的发现特别令人感兴趣。Opa蛋白需要小心重构以呈递CEACAM-结合结构域，该结构域发生在不同的表面暴露环状结构上。本发现提示，D-7自发重折叠以提供CEACAM-结合性质。在D-7中卷曲结构提供具有适合于CEACAM1结合的构象的球形亚单位结构。D-7肽的这种有利性质意味着该肽及其衍生物、同源物或片段作为亚单位疫苗或治疗剂将具有特别的效用。具有所需基于α-螺旋的构象的D-7肽的衍生物可用独特的“指纹”圆二色性光谱进行鉴别。
实施例6.序列分析在图20中显示了Mx的10个菌株的UspA1蛋白的氨基酸序列的D-7区域的对比。
10个菌株中的6个在所对比的序列区域是相同的。MX3和MX4菌株在D-7区域的可获得序列上100％相同并且分别具有90.85％和88.03％的总同一性，分别考虑还未测定的MX3和MX4的N-末端13和17个氨基酸残基。
剩余的两个菌株TTA37和O35E具有所示缺失(图20)，其发生在D-T区域中。包括D-7中缺口的总同一性分别是70.4％和50％。当手工对比时，TTA37在剩余100个氨基酸区域是相同的，而O35E在72个氨基酸中的71相同(图21)。已知O35E不与CEACAM1结合。TTA37不适用于测试。
实施例7.D-7的粘附阻滞性质结果首先使用可溶性受体调查了D-7作为有效抗Mx、Nm、Ng和Hi的同源性和异源性菌株的抗粘附剂的潜能。在将两个Mx菌株的全部细胞溶解产物打点涂到硝化纤维素上之前，预培养CEACAM1-Fc(CC1-Fc)和D-7。显示重组D-7以剂量依赖性方式显著抑制CC1-Fc与异源性菌株MX1和与同源性菌株MX2的结合(图24a)。抑制是显著的并且看起来在0.01μg.ml-1以上达到了平台。先前显示不与CEACAM1结合(实施例5)的对照肽(D-8Δ)没有显示这样的抑制。另外，测定了多个菌株的抑制。使用的大多数菌株代表了世界范围的临床分离菌(参见方法)。D-7显示了显著和特异性抑制，但D-8Δ没有(图24b)。然后使用转染有CEACAM1的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(CHO-CEACAM1)，调查了D-7的阻滞作用。当用可溶性受体时，在用D-7但不用对照肽预培养后观察到了Mx、Nm和Hi与CHO-CEACAM1细胞结合的抑制(图25a和b)。细菌与CHO-CEACAM1细胞结合的抑制是剂量依赖性的并且对于Mx和Hi在等于或大于0.1μg.ml-1时以及对于Nm在0.2μg.ml-1时是显著的(图25b)。在大约2μg.ml-1的浓度下获得了细菌与CHO-CEACAM1结合的接近完全废除(图25a和b)。获得的抑制的值假定地提示，在本研究中使用的细菌的CEACAM相互作用的亲和性的次序是Nm＞Mx＞Hi。除了CEACAM1以外，已显示脑膜炎奈瑟氏菌还靶向人CEACAM家族的其它成员，包括上皮CEA和CEACAM6(NCA)9，一些Mx菌株也是如此，Hi菌株趋于靶向作为优选受体的CEACAM1(数据未显示)。用D-7(2μg.ml-1)预培养后，对表达CEACAM1、6和CEA的转染的海拉细胞观察到了Nm结合的抑制(图25c)。
使用HeLa-CC1H(一种用来表达高水平的CEACAM1以部分模拟上皮细胞可能的体内炎症状态的细胞系)，进一步测试了D-7的功效。高受体密度允许表达Opa的细菌依附到靶细胞上，尽管该靶细胞存在被膜7。因此，该模型允许我们还使用可在体内发现的Nm的表型(h18.18)，即有被膜的、有菌毛的和表达外膜蛋白Opa以及Opc的15，25。首先，测试了h18.18的Opa-缺失衍生物与HeLa-CC1H的结合，发现其相对低(每个细胞结合10-20个细菌)并且是因为表达菌毛的原因。如所预期的，h18.18与HeLa-CC1H的粘附被大大增强(每个细胞粘附100-150个细菌)并且尽管有菌毛的贡献，但在先或同时用D-7处理大量减少了h18.18的细胞粘附(图25d)。除了上述性质以外，还在人肺上皮细胞系A549(已知表达CEACAMs26)上测试了D-7。之所以选择该细胞系，因为它还表达其它Mx配体的受体27，因此可以测试D-7在减少细菌负荷中的功效。在存在D-7(2μg.ml-1)而不是D-8Δ的情况下观察到了Nm和Hi与A549细胞相互作用的显著降低(图25e)。对于Mx菌株也观察到了结合的减少，并且尽管比较起来相对较低，但它却是显著的(图25e)。
方法细菌分离物和培养Mx和Nm在含有10％热处理马血的BHI琼脂上生长，而Hi在含有Levinthal基的脑心浸液(BHI)琼脂上生长。Ng菌株在GC琼脂上培养。所有细菌在5％CO2培养箱中37℃培养达到16h。Mx菌株是从中耳炎和COPD病人获得的临床分离菌并代表从几个国家的分离菌。Eagan、c1和f1是分别带有b、c和f型被膜的典型Hi，Rd是d型菌株的一种无被膜衍生物。菌株A930065和NT1是NTHi.菌株A3、F2087、F3035和F1947是Hi生物群埃及属(aegyptius)分泌物。Nm分离株C751A、C751B和C751D是血清组A菌株C751的三种独特的Opa表达分离株。其他分离株是来自以下血清组PMC17(A)、C311和MC58(B)，以及C114(C)PMC2(29E)、PMC4(W135)和PMC10(Y)。Ng分离株P9-13、16和35是菌株P9的菌株内Opa变种，其他临床分离株是世界范围的。本研究使用的多数菌株在以前的研究中已经进一步描述过10，26，28。
抗体抗-聚组氨酸小鼠单克隆抗体购自Qiagen，按0.2μg.ml-1浓度使用。抗Mx、Nm和Hi菌株的多克隆抗血清是根据标准程序用兔制备，用多种菌株的全细胞裂解液作为抗原。本研究使用的抗-UspA1抗体(R38)已在实施例1和26中描述。抗D-7的多克隆抗血清是用肽结合Ni-NTA树脂(Qiagen；每次免疫用100-200μg肽)免疫兔来产生。通过在56℃加热抗血清30min来灭活补体。抗-D-7抗体是用连结AminoLink Plus柱的肽D-7，根据制造商(Pierce)的程序来亲合纯化的。
可溶性受体构建体&细胞系用于本研究的已转染了CEACAM1的可溶性CEACAM1-Fc和CHO细胞在以前的研究中已经描述11，9。表达一系列CEACAM分子的海拉细胞由Wolfgang Zimmerman教授(Munich大学，德国)和ScottGray-Owen博士(Toronto大学，加拿大)赠送，这些HeLa细胞在含有10％胎牛血清(FCS)的RPMI 1640培养基中生长。A549人肺癌细胞(Flow实验室)在含有10％胎牛血清(FCS)的F12 Ham培养基中生长。表达高水平CEACAM分子的海拉细胞通过用Tet-OnTM(Clontech)基因表达系统产生。将ceacaml基因克隆入pTRE-2hyg反应质粒(Ciontech)并用Fugene-6(Roche)转染入带有调节基因(Ciontech)的海拉细胞。转染细胞用400μg.ml-1的潮霉素筛选。那些CEACAM表达阳性的转染细胞用FACS和有限稀释来筛选。在0.25μg.ml-1强力霉素存在时的HeLa-CC1H克隆产生最高水平的受体。
受体覆盖试验这些实验基于先前描述的方法9，下述除外。为进行抑制研究，在室温下将CEACAM1-Fc(0.1μg.ml-1)与D-7或对照肽(0.001-2μg.ml-1)预培养1小时。然后单独用CEACAM1-Fc(0.1μg.ml-1)覆盖斑点或如所述与肽预培养。或者在用受体(0.1μg.ml-1)覆盖前，用兔抗-D-7抗体(10μg.ml-1)覆盖斑点1小时。在任一情况下，使用NIH ScionImage程序，通过光密度分析测定受体结合的水平。
D-7肽抑制细菌与表达CEACAM的细胞的粘附在37℃在添加了2％胎牛血清的199培养基中，将细胞的汇合单层与肽D-7或对照肽(0.1-2μg.ml-1)预培养30-60分钟。与肽预培养后，检查单层以确保对所述细胞没有有害作用发生。随后，在37℃在添加了2％胎牛血清的199培养基中以每个细胞大约100-200个细菌的比率培养单层1小时。通过用199培养基洗涤4次来除去非粘附的细菌，然后处理单层进行免疫荧光检测或用1％皂苷裂解，并将细菌的稀释液铺板用于按照先前描述的方法测定菌落形成单位(cfu)25。为了免疫荧光检测，将细胞固定在无水甲醇中10分钟，用含0.05％吐温的PBS中的1％牛血清白蛋白洗涤和阻滞1小时。使用抗细菌的抗血清和罗丹明缀合的二抗检测依附的细菌。通过使用Olympus IX70显微镜，放大X400直接计数，获得了粘附至表达HeLa-CEACAM的细胞的细菌数目。在对从双份实验中随机选择的20个细胞粘附的细菌进行计数后，获得了结合细菌的平均值。按照上述方法，通过cfu分析测定了与HeLa-CC1H粘附的细菌。
实施例8.抗D-7抗体抑制Mx-CEACAM1相互作用结果产生的抗D-7的兔抗血清含有抗体，在全细胞溶解产物的蛋白质印迹覆盖中，该抗体与来自多个Mx菌株的UspA1交叉反应(数据未显示)。使用亲和纯化的抗体，通过蛋白质印迹没有观察到抗-D-7与NmOpa或Hi P5的结合(数据未显示)。在CC1-Fc覆盖前，一系列Mx菌株的全细胞溶解产物与抗-D-7(10μg.ml-1)的培养导致显著的受体结合的抑制，大多数菌株显示大于80％的抑制(图26)。然而，在相似的实验中对于Hi、Nm和Ng的菌株只观察到低水平的抑制。因此抗D-7的抗体可提供抗Mx感染的保护，而D-7可用作更广谱的抗微生物肽，用于许多不同的CEACAM靶向性细菌。
实施例9.D-7肽抑制细菌与表达CEACAM的人内皮细胞的粘附为了评估D-7对内皮细胞的作用，使用HMEC-1细胞的汇合单层。将人微血管内皮细胞与D-7或重组对照分子(二者都为1μg.ml-1)预培养60分钟。然后以每个细胞100个细菌的感染率添加细菌(脑膜炎奈瑟氏菌菌株C751的表达OpaD的分离株)并在37℃培养1小时。此后，通过洗涤除去非粘附的细菌并在室温下将单层固定在甲醇中10分钟。通过用抗脑膜炎奈瑟氏菌的兔多克隆抗血清，并且随后用抗兔TRITC缀合的二抗检测粘附细菌。
在不存在肽的情况下，大多数的内皮细胞每个细胞有至多30个结合的细菌。在存在对照肽的情况下，没有观察到明显的细菌结合的抑制。然而，在存在D-7的情况下，结合实质上被废除了，偶尔存在依附有l-2个细菌的细胞(图27)。
因此D-7能够抑制Opa-CEACAM介导的脑膜炎奈瑟氏菌与内皮细胞以及上皮细胞的粘附。
实施例10.在已知UspA1蛋白序列中片段“4-T”(MX2 UspA1的第427-623个氨基酸)的序列的保守性表II.使用的菌株和序列
用所有全长蛋白质序列进行多重序列对比，以鉴别在其它菌株序列中的相应片段。
表III.相应片段的定位
图28中显示了这些片段的多重序列对比。下面显示了有关的同一性百分比。
表IV.表III中定义的片段的序列同一性百分比
如在实施例6中关于D-7区域所示，上述结果显示，4-T区域在不同的菌株中是高度保守的，对于所有被测试的菌株(O35E(85％同一性)除外)，序列同一性为95％或大于95％。如前面所述，O35E不与CEACAM结合。因此，包含如图28中显示的序列4-T(427-623)的保守区或由如图28中显示的序列4-T(427-623)的保守区组成的肽是本发明的优选肽，其在治疗或预防疾病，尤其是其中涉及CEACAM受体的疾病中具有效用。
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权利要求
1.分离的多肽，它包含选自如下序列的氨基酸序列，或由选自如下序列的氨基酸序列组成图6所示序列的第527至623残基和图28所示序列对比中鉴别的保守序列。
2.根据权利要求1的分离的多肽，其中所述保守序列选自由以下序列组成的组QHSSDIKTLK，NVEEGLLDLSGRLIDQKADLTKDIK，NVEEGLLDLSGRLIDQKADIAKNQA，DIAQNQT，DIQDLAAYNELQD，QTEAIDALNKASS，TAELGIAENKKDAQIAKAQANENKDGIAK，NQADIQLHDKKITNLGILHSMVARAVGNNTQGVATNKADIAK，NQADIANNIKNIYELA，NQADIANNI，和NIYELA。
3.根据权利要求1或权利要求2的分离的多肽，它是截短的UspA1蛋白质。
4.根据权利要求1至3任一项的分离的多肽，它与CEACAM受体结合。
5.一种药物，它包含根据权利要求1至4任一项的多肽和一种或多种药物上可接受的佐剂、媒介物、赋形剂、粘合剂、载体或防腐剂。
6.根据权利要求5的药物用于治疗或预防感染的用途。
7.根据权利要求5的药物用于治疗或预防疾病的用途，在该疾病中CEACAM受体参与引起该疾病的病原体的细胞靶向。
8.根据权利要求7的用途，用于治疗或预防感染、呼吸疾病、肿瘤性疾病及肿瘤性疾病相关的病症、血管生成、龋牙和龈病。
9.根据权利要求6至8任一项的用途，其中所述感染是粘膜感染，或经粘膜发生。
10.根据权利要求9的用途，其中所述感染由脑膜炎奈瑟氏菌、流感嗜血杆菌或粘膜炎莫拉氏菌引起。
11.根据权利要求9的用途，其中所述感染由具核梭杆菌引起。
12.根据权利要求5的药物的用途，用于预防或治疗中耳炎。
13.根据权利要求1至4任一项的多肽在鉴别用作治疗剂的新阻滞试剂的筛选试验中的用途，包括对潜在的治疗剂筛选它们模拟所述多肽的能力，或它们与所述多肽的同源性。
14.一种疫苗，它包含根据权利要求1至4任一项的多肽和一种或多种药物上可接受的佐剂、媒介物、赋形剂、粘合剂、载体或防腐剂。
15.治疗或预防需要治疗或预防的个体中感染的方法，它包括给予有效量的根据权利要求5的药物。
16.实质上如前面参照附图6所述的和如附图6所说明的多肽。
17.实质上如前面所述的药物，它包含权利要求16的多肽。
18.结合CEACAM受体的配体在制备用于治疗或预防疾病的药物中的用途，在该疾病中CEACAM受体参与引起该疾病的病原体的细胞靶向，其中该配体包含选自如下序列的氨基酸序列，或由选自如下序列的氨基酸序列组成图6所示序列的第527至623残基和图28所示序列对比中鉴别的保守序列，或保留CEACAM结合能力的其片段或功能等效体。
19.根据权利要求18的用途，其中所述保守序列选自如下序列QHSSDIKTLK，NVEEGLLDLSGRLIDQKADLTKDIK，NVEEGLLDLSGRLIDQKADIAKNQA，DIAQNQT，DIQDLAAYNELQD，QTEAIDALNKASS，TAELGIAENKKDAQIAKAQANENKDGIAK，NQADIQLHDKKITNLGILHSMVARAVGNNTQGVATNKADIAK，NQADIANNIKNIYELA，NQADIANNI，以及NIYELA。
20.根据权利要求18或权利要求19的用途，其中所述疾病选自感染、呼吸疾病、肿瘤性疾病及肿瘤性疾病相关的病症、血管生成、龋牙和龈病。
21.根据权利要求18至20的用途，其中所述病原体感染粘膜，或经粘膜进入。
22.根据权利要求18至21任一项的用途，其中引起所述疾病的病原体选自脑膜炎奈瑟氏菌、流感嗜血杆菌和粘膜炎莫拉氏菌。
23.根据权利要求18至21任一项的用途，其中引起所述疾病的病原体是具核梭杆菌。
24.根据权利要求22或23的用途，其中所述疾病是中耳炎。
全文摘要
本发明提供了从粘膜炎莫拉氏菌外膜蛋白中分离出的与CEACAM受体结合的配体，所述的配体包含受体结合结构域，该结构域包含选自所公开组的氨基酸序列，或者上述序列的片段、同源物、功能等价物、衍生物、简并物或羟基化、磺化或糖基化的产物或者其它次级加工产物。本发明还提供了包含所述配体的药物和疫苗，以及它们在治疗或预防感染中的用途。还提供了鉴定新型治疗用化合物的筛选方法。
文档编号A61K38/17GK1957085SQ200580016395
公开日2007年5月2日 申请日期2005年4月15日 优先权日2004年4月15日
发明者M·沃基 申请人:布里斯托尔大学