专利名称：Smr1肽的新的治疗用途的制作方法
第一方面，本发明涉及SMR1肽的新的治疗用途。
本发明人此前描述了一种新的大鼠下颌下腺蛋白，即SMR1(submandibular rat 1 protein)，其具有激素原(prohormone)的结构，且其合成受雄激素的调控(Rosinsky-Chupin等，1988，美国科学院院报；85(22)8553-7，和PCT专利申请No.WO 90/03981)。编码SMR1的基因属于一种新的多基因家族，即VCS家族，其定位于大鼠14号染色体p21-p22区带(Courty等，1996，Mol.Biol.Evol.13(6)758-66；Rosinsky-Chupin等，1995，Mamm.Genome 6(2)153-4)，且其对应的人类基因已经被描述(Isemura等，1997，J.Biochem 1211025-1030；Isemura等，1994，J.Biochem 1151101-1106；Isemura等，1979，J.Biochem 8679-86；Dickinson等，1996，Curr Eye Res，15377-386)。该基因具有类似于多种激素前体基因的结构(Rosinsky-Chupin等，1990，DNA Cell.Biol.9(8)553-9)。SMR1的mRNA在雄性大鼠的颌下腺(submaxillary gland，SMG)的腺泡细胞以及前列腺中的表达具有高度的组织、年龄和性别特异性(Rosinsky-Chupin等，1993，Histochem.Cytochem.41(11)1645-9)。
在体内，SMR1以组织和性别特异性的方式经过在成对的碱性氨基酸部位的加工而成为成熟的肽产物，该方式与肽类激素的前体的成熟途径类似(Rougeot等，1994，Eur.J.Biochem 219(3)765-73)。具有相关结构的肽是由SMR1经成对的精氨酸残基的裂解而产生的，如十一氨基酸多肽VRGPRRQHNPR；六肽RQHNPR；以及五肽QHNPR，其在体内通过成对的碱性氨基酸转换酶如Furine转换酶对成对的碱性氨基酸残基进行加工后由前体达到选择性的成熟——以组织、年龄和性别相关的方式不同程度的积聚——并在多因素的神经内分泌调控下释放至局部以及全身(Rougeot等，1994)。
在这种情况下，自SMR1产生的最终的成熟的肽，即SMR1-五肽(SMR1-QHNPR)，主要地作为对雄激素的应答而被合成，并在基础状态下组成性地释放于血液中，同时作为对环境应激的应答可被迅速地释放，这取决于调控SMG的分泌反应性的雄激素受体的激活状态。
继而，循环中的SMR1-五肽在体内被外周的靶组织通过特异性的结合位点摄取，主要是在肾脏、骨骼和牙齿。
该肽的靶位点主要位于离子捕获、转运和调节的主要组织，这一点提示SMR1-五肽在体内调节矿物离子的自稳态过程中可能具有局部以及全身性的作用。此外，由于受雄激素调节的SMR1-五肽在存在环境应激时被迅速释放，这促使本发明人假设这种SMG-特异性的信号肽可能参与介导了动态自稳态应答的整合性重建所述应答针对于雄性大鼠特异性的行为特征如进攻性和/或性行为中的应激条件，以及与雌性特异性的生理特征如妊娠和哺乳相关的应激条件。
WO 98/37100公开了SMR1蛋白的成熟产物，特别是具有结构通式XQHNPR的肽，可识别与矿物离子浓度密切相关的器官中的特异性靶位点。这一发现促使本发明人推测SMR1-肽(特别是SMR1-五肽、六肽或十一肽)在调节体液和组织中的金属离子的浓度方面具有活性作用，并因此推测此类肽在所有与矿物离子失衡相关的代谢异常中具有治疗作用。
也就是说，所公开的具有治疗作用的肽可用于治疗或预防由体液或组织内的矿物离子失衡所引起的骨骼、牙齿、肾脏、小肠、胰腺、胃或唾液腺的疾病，即甲状旁腺功能亢进或低下、骨质疏松、胰腺炎、颌下腺结石、肾结石或骨营养不良。
根据上述假设，采取了一种行为药理学的方法。SMR1-肽，特别是SMR1-五肽，被发现可在成熟雄性大鼠诱导剂量依赖性的性行为的增强，而其进攻性冲动行为则较对照大鼠减少(PCT专利申请WO01/00221)。
为阐明SMR1-肽的作用途径，对肽受体位点的分子特征的研究是不可或缺的步骤之一。放射性标记的SMR1-五肽经由全身性施用可达到的此膜结合位点已经得到分离，特别是在肾脏的外层髓质。对其氨基酸序列的鉴定显示出在体内能结合所述的肽的该细胞表面分子是一种膜金属肽酶(metallopeptidase)，更确切地说是一种哺乳动物的II型整合性膜含锌内肽酶，例如为中性内肽酶24-11或NEP，也称为脑啡肽酶，属于Neprilysin亚家族，其在多种肽能性信号的功能效力中具有关键性的作用。此外，大鼠肾脏的NEP和SMR1-五肽在体内的相互作用已经通过纯化的兔肾NEP得到证实。
此外，体内研究发现，在大鼠的整体水平上，循环中的放射性标记的SMR1-五肽可达到的靶器官的分布与已知的合成的NEP抑制剂(3HHACBO-Gly)的分布之间存在良好的(拓扑学及动力学)相关性(Sales等，1991，Regulatory Peptides.33，209-22)。另外，一些发现支持SMR1-肽是一种由SMG衍生的、NEP活性的天然的调节剂，特别是一种抑制剂1-已经发现SMR1-五肽的组织摄取在体内具有药物动力学和生物化学的稳定性，2-鉴于NEP优选地在X-Phe键对肽进行裂解，SMR1-肽不具有作为NEP的底物所需的残基，以及3-SMR1-五肽具有强效的锌螯合基团，所述的锌螯合基团已经用于设计有效的合成的NEP抑制剂。
鉴于存在众多的生理学NEP底物(即肽激素脑啡肽、P物质、缓激肽、血管紧张素II以及心房钠尿肽(atrial natriuretic peptide))，NEP/SRM1-肽相互作用的生理学结果被认为可以影响对中枢和外周的疼痛感觉、炎症现象、动脉的张力和/或矿物质交换的控制(Roques等，1993，下文)。
中性内肽酶NEP 24-11在哺乳动物的神经和周围组织中均有分布，在外周，其在肾脏和胎盘尤其丰富。在此类组织中，细胞表面的金属肽酶NEP参与了神经肽、系统性免疫调节肽以及肽激素的分泌后处理和代谢。通过对循环的或分泌的调节肽的活性水平进行控制，NEP调控了这些肽的生理学受体介导的作用。因此，膜链NEP参与了对以下激素活性的调节强效血管活性肽如P物质、缓激肽(BK)、心房利尿钠肽(ANP)以及血管紧张素II(AII)；强效的炎症/免疫调节肽如P物质、BK以及fMet-Leu-Phe(fMLP)；强效的阿片神经肽如Met-和Leu-脑啡肽(Enk)和强效的离子交换及体液自稳态调节肽如ANP、C-型利尿钠肽(C-type Natriuretic Peptide，CNP)和B-型利尿钠肽(BNP)。然而，此类肽的水平仅在它们被紧张性释放或是由刺激触发而释放的区域随着NEP诱导的形成/降解而改变。
从整体角度来看，NEP的生物活性是调控的肽能信号(peptidergicsignal)的活性水平，所述的肽能信号参与调节了动脉压、炎症现象和水矿物质内稳态，同时也调控了对痛觉的处理。从临床角度来看，这证实了NEP可作为各种疾病状态的一种药物靶向。例如，通过抑制NEP，从而提高中枢或外周的内源性阿片肽，可由此获得止痛剂或抗腹泻剂，或通过抑制内源性AII的形成以及BK和ANP的灭活，可由此获得抗高血压、利尿钠和利尿剂。通过应用NEP抑制剂而改变内源性肽的浓度的主要优势在于所产生的药理学效应是仅仅通过天然的效应分子刺激其受体而诱导产生的，并且是严格地依赖于在环境、行为和病理生理性应激条件下、由紧张性或刺激诱发的天然效应分子的释放(Roques等，1993，Pharmacological Reviews.45，87-146)。应当着重强调的是，在此类应激条件下，天然的潜在的NEP调节剂SMR1-肽也会迅速而紧张性地释放、分布、并被其全身的靶组织摄取，特别是在肾脏的NEP位点(Rougeot等，1997)。由此，SMR1-肽可以在体内被动力性地生物利用以调节NEP的活性，从而使得针对应激而产生的局部和全身性的炎症性、血管收缩和/或离子内稳态的应答达到最佳。这一整体性的观点与下面的假设一致，即循环的颌下腺(SMG)衍生因子可以参与对生理性或病理性的“应激状态”(损伤、创伤或感染)的内稳态应答的整体重建，而非保持静息的内稳态的稳定状态(Rougeot等，2000，Peptides.21，443-55)。
通常而言，生理学重要性的证据表明存在一个颈交感干(CervicalSympathetic Trunk(CST))-SMG神经内分泌轴，其在生理适应中发挥整合作用，并维持哺乳动物的内稳态，特别是在如发生组织损伤、炎症、以及进攻行为的啮齿动物中所见的“应激条件”下。实验室得来的数据提供了令人信服的证据，支持SMR1-肽是一种新的信号调节剂，适应于性别和种属特异性的环境、行为和生理特征，在紧急情况下被紧张性和动力学性地动员，通过对膜结合的NEP活性的调节使得局部和全身性的疼痛性、炎症性、血管收缩和/或离子内稳态的应答达到最佳。另外，SMR1-肽作为目前发现的首个天然的外周NEP活性的调节剂，由于该金属肽酶的高度保守性，特别是在大鼠、兔和人之间具有≥90％的序列相同性，似乎可以被设计为一种新型的治疗分子。
本发明人提供的证据连同NEP序列的惊人的相同性进一步提示SMR1-肽可以作为膜金属肽酶，特别是锌金属肽酶的天然调节剂/抑制剂(Genbank access number P08473，Malffoy等，FEBS Lett，1988，229(1)，206-210；Genbank access number NP258428，Bonvouloir等，DNA Cell Biol，2001，20(8)，493-498；Genbank access number NP036740，Malfroy等，Biochem Biophys Res.Commun，1987，144，59-66)。
除NEP以外，哺乳动物的膜金属肽酶的例子有内皮素(Endothelin)-转换酶(ECE)、特别是ECE1和ECE2、红细胞表面抗原KELL和X-连锁性低血磷性佝偻病(hypophosphatemic rickets)相关的PEX基因产物，以及血管紧张素转换酶(ACE)和氨基肽酶N(APN)。
抑制ACE和/或ECE在高血压的治疗和动脉硬化的预防和治疗中具有重要的应用。
抑制APN并结合应用NEP在疼痛的治疗中具有重要的应用。
抑制相关的膜金属肽酶在卵巢、结肠直肠、脑、肺、胰腺、胃和恶性黑色素瘤等肿瘤的治疗方面具有治疗作用，并可减少肿瘤转移、动脉硬化和/或高血压的发病率。抑制相关的膜金属肽酶还在控制疼痛方面具有治疗作用。此类对于急性疼痛的抗伤害效应(antinociceptive effect)为镇痛作用(analgesic效应)，但对于慢性炎症性疼痛例如关节炎或炎症性肠病也有效。
此外，抑制细菌或病毒的金属肽酶也预期具有抗感染的作用。
金属肽酶在病原体侵入宿主组织及其免疫和炎症过程中具有重要的作用，所述病原体例如为酿脓链球菌，铜绿假单胞菌，Porphyromonas gingivalis和嗜肺军团菌。
此外，细菌的金属肽酶在由蛋白水解毒素例如炭疽杆菌的毒素以及破伤风杆菌和肉毒杆菌的神经毒素引起的疾病中发挥了重要的作用。
其他金属肽酶在各种感染例如由HIV引起的感染中发挥重要的作用(FR 2707169)。
在J.Potempa和J.Travis中可能发现蛋白酶抑制剂在细菌或病毒性疾病的重要性(蛋白酶作为细菌性疾病的毒性因子和作为蛋白酶抑制剂的治疗作用的潜在靶向，《蛋白酶作为治疗的靶向》99，159-188，K.Helm，B.D.Korant和J.C.Cheronis(编辑)-Spinger HandbookExp.Pharm.140)。
下列出版物记载了金属肽酶的不同作用Turner等，2001，Bioessay，23，261-9；Kenny等，1977，哺乳动物细胞和组织的蛋白酶；Kenny等，1987，哺乳动物的胞外酶；Beaumont等，1996，健康和疾病中的锌金属肽酶。
因此，本发明的第一个主题是SMR1-肽或药用有效量的所述的SMR1-肽在制备用于预防或治疗需要调节哺乳动物、特别是人的膜金属肽酶、特别是膜锌金属肽酶的活性的疾病的治疗组合物中的用途。
本发明的另一个主题是调节内源性SMR1肽与所述的膜金属肽酶之间的相互作用的制剂的治疗用途，所述的制剂例如为SMR1肽的生物活性衍生物。所述的调节是动力学的和/或分子的。
“内源性”是指一种分子(在此为SMR1-肽)，其天然地表达或成熟于待治疗的病人的组织中。
本发明还涉及调节内源性SMR1蛋白或肽与膜金属肽酶之间的相互作用的制剂在制备用于预防或治疗疾病的治疗组合物中的用途，其中试图调节所述的膜金属肽酶的活性。
本发明更特别地涉及SMR1-肽或药用有效量的所述的SMR1-肽在制备用于预防或治疗疾病的药物中的用途，其中试图调节哺乳动物、特别是人的由NEP诱导的NEP敏感性肽的降解。
在本说明书中，SMR1-肽是指SMR1蛋白、由SMR1产生的肽(也称为SMR1蛋白的成熟产物)、或者是所述的蛋白或所述的成熟产物的生物活性衍生物。
在优选的实施方案中，所述的SMR1-肽具有下列通式(1)的化合物X1QHX2X3X4其中X1代表一个氢原子或X1代表选自如下的一个氨基酸链X1＝R或G，X1＝RR，或X1＝PRR，或X1＝GPRR，或X1＝RGPRR，或X1＝VRGPRR，X2提供N，G或D，X3提供P或L，以及X4提供R或T。
优选的肽包含具有如下序列的肽来自褐鼠(Rattus norvegius)的QHNPR、RQHNPR和VRGPRRQHNPR，来自黑鼠(Rattus rattus)的QHNLR和RQHNLR，来自小鼠的GQHGPR和GQHDPT。
在上述的氨基酸序列中Q代表谷氨酰胺，H代表组氨酸，N代表天冬酰胺，G代表甘氨酸，P代表脯氨酸，R代表精氨酸，L代表亮氨酸，T代表苏氨酸，D代表天冬氨酸，以及V代表缬氨酸。
SMR1-肽的“生物活性衍生物”是指功能保守的变体、同源蛋白和peptidemimetic，以及激素、抗体或合成化合物(即肽或非肽分子)，其优选地保留了如下所述的原来的肽的结合特异性和/或生理学活性。其优选地具有结合膜金属肽酶(特别是NEP)的能力，此结合活性可轻易地通过结合分析所测定，例如通过标记SMR1衍生物或通过与典型的NEP底物(任选地进行标记)的竞争分析。
“功能保守的变体”是指蛋白中的特定氨基酸残基被改变而不影响此多肽的总体构象和功能，包括但不限于，一个氨基酸被具有相似特性(如极性、氢键能、酸性、碱性、疏水性、芳香性、诸如此类)的另一个氨基酸取代。具有相似特性的氨基酸为本领域所熟知。例如精氨酸与赖氨酸均为亲水性碱性氨基酸，并可相互取代。类似地，异亮氨酸为疏水性氨基酸，可被亮氨酸或缬氨酸取代。此类改变被认为对该蛋白或多肽的表观分子量或等电点影响很小或没有影响。在蛋白或酶中，除保守的氨基酸以外的那些氨基酸可以是不同的，因此具有相似功能的两个蛋白之间的序列相似性可以不同，例如其可以是自70％到99％，相似性可通过排列图比如Cluster方法所确定，其中相似性基于MEGALIGN排列得出。“功能保守的变体”还包括这样的多肽或酶，即经BLAST或FASTA排列测定，其与天然的或原有的蛋白或酶相比，两者的氨基酸相同性至少为60％，优选地至少为75％，最优选地为至少85％，甚至更为优选地为至少90％，同时其具有相同的或基本类似的特性或功能。
本发明特别包括“等位基因变体”，如下文中详述。
在此，术语“同源性”的所有语法形式及拼写变化均指具有“共同演化起源”的蛋白之间的关系，包括来自超家族的蛋白(如免疫球蛋白超家族)和来自不同物种的同源蛋白(如肌球蛋白轻链等)(Reeck等，Cell，50667，1987)。此类蛋白具有序列同源性，这反映在它们具有的序列相似性，无论是就相似性的百分数而言还是保守位置存在的特定残基或基序。
相应地，术语“序列相似性”的所有语法形式均指蛋白的氨基酸序列之间的相同或相应的程度，所述的蛋白可以属于或不属于共同演化起源(见上述Reeck等)。但在通常的用法和本申请中，属于“同源性”当被副词“高度”修饰时，是指序列的相似性，且可以是或不是具有共同演化起源。
在特定的实施方案中，当两个氨基酸序列的氨基酸超过80％是相同的，或超过大约90％是相似的，并具有相同的功能时，这两个氨基酸序列是“基本同源的”或“基本相似的”。优选地，所述的相似的或同源的序列是通过排列进行鉴定的，例如通过GCG(GeneticsComputer Group，GCG软件包程序手册，第7版，Madison，Wisconsin)的pileup程序，或任何上述程序(BLAST，FASTA等)。
天然的NEP底物主要是肽类激素脑啡肽、P物质、缓激肽、血管紧张素II和心房利尿钠肽，这些激素在对中枢和外周的痛觉感受、炎症现象、矿物质交换和/或动脉紧张度的调控方面具有关键性的作用。
更特别地，本发明的一个目的是上述具有治疗作用的肽作为镇痛剂的用途，其作用是通过在外周、脊髓和/或脊髓上水平抑制NEP，并由此增加中枢或外周的内源性阿片(包括脑啡肽)的水平和作用时间。
本发明的另一个目的是上述的肽作为抗腹泻剂的用途。
本发明的另一个目的是上述的肽作为抗高血压剂、利尿钠肽和利尿剂的用途，其作用是通过抑制内源性AII的产生以及P物质、BK和ANP的失活。
本发明的另一个目的是上述的肽作为预防和治疗动脉硬化的用途。
本发明的另一个目的是上述的肽作为治疗疼痛、包括慢性炎症性疼痛如关节炎或炎性肠病的制剂的用途。
本发明的另一个目的是上述的肽作为控制免疫炎症反应的制剂的用途。
本发明的另一个目的是上述的肽作为预防或治疗恶性细胞增殖和播散的制剂的用途。
本发明的另一个目的是上述的肽作为治疗滥用毒品，特别是滥用吗啡的替代物的用途。
实际上，研究表明，主动吸食毒品和成瘾及药物依赖的发生至少在部分上是预先存在的或诱导产生的内源性阿片系统的改变和/或缺陷的结果。因此，使用SMR1-肽来强化内源性脑啡肽的作用，可以减轻因中断长期施用吗啡或海洛因所产生的各种副作用(戒断的躯体症状)。
本发明的另一个目的是上述的肽在治疗感染如细菌性或病毒性疾病中的用途。
为此，本发明中的术语“哺乳动物”指的是其分类学上的含义并特别地包括人。
在本发明中，“肽”是一种分子，其由通过肽键彼此以线性排列方式相连接的线性排列的氨基酸残基组成。此线性排列可任选地为环形，即该线性肽的两端或肽内的氨基酸侧链可以结合，例如通过化学键。本发明的此类肽可包括自3到500个氨基酸，且可以进一步包括二级、三级或四级结构，以及与其他的肽或其他的非肽类分子的分子间结合。此类分子间结合可以但不限于通过共价键(例如通过二硫键)、或通过螯合作用、静电相互作用、疏水相互作用、氢键、离子-偶极(ion-dipole)相互作用、偶极-偶极(dipole-dipole)相互作用、或上述的任何组合。
本发明的优选的肽包含下列一组的氨基酸序列Glp-His-Asn-Pro-Arg [SEQ ID NO.1]Gln-His-Asn-Pro-Arg [SEQ ID NO.2]Arg-Gln-His-Asn-Pro-Arg [SEQ ID NO.3]Val-Arg-Gly-Pro-Arg-Arg-Gln-His-Asn-Pro-Arg [SEQ ID NO.4]Gln-His-Asn-Leu-Arg [SEQ ID NO.5]Arg-Gln-His-Asn-Leu-Arg [SEQ ID NO.6]Gly-Gln-His-Gly-Pro-Arg [SEQ ID NO.7]Gly-Gln-His-Asp-Pro-Thr [SEQ ID NO.8]其中的序列以N到C的构型示出，其中Glp为焦谷氨酸(pyroglutamate)，Gln为谷氨酰胺，His为组胺酸，Asn为天冬酰胺，Pro为脯氨酸，Arg为精氨酸，Gly为甘氨酸，Val为缬氨酸，Leu为亮氨酸，Thr为苏氨酸。
在这些肽中，通过N端的环化/去环化，Glp和Gln可互相转换。
此外，本发明的特定的优选的肽包含SEQ ID NO.1-8中任一序列所示的肽的等位基因变体、或基本上由SEQ ID NO.1-8中任一序列所示的肽的等位基因变体组成、或由SEQ ID NO.1-8中任一序列所示的肽的等位基因变体组成。在此，“等位基因变体”是原有的肽发生1到2个氨基酸取代后得到的肽，但仍保留了原有的肽的结合特异性和/或生理学活性。在此，“保留了原有的肽的结合特异性”是指能够与结合如SEQ ID NO.1-8所示的肽的单克隆抗体或多克隆抗体相结合，其亲和力至少为所述的如SEQ ID NO.1-8所示的肽的十分之一，优选地为至少一半，最优选地为至少与之相同。对此亲和力的测定优选地在标准的竞争性结合免疫分析条件下进行(Rougeot等，E.J.B.，219(3)，765-773)。“保留了原有的肽的生理学活性”是指保留了如SEQID NO.1-8所示的任何一种肽的结合并调节NEP活性的能力，并因此能够优化针对应激而产生的局部和全身的应答，所述应答为疼痛、炎症、缩血管和/或离子内稳态的应答。测定此活性是否得到了调节将在本说明书的下文中进一步详述。术语“等位基因变体”特别要包括任何来自人类的如SEQ ID NO.1-8所示的肽的功能性同源物，所述的同源物的氨基酸序列与如SEQ ID NO.1-8所示的肽并不完全相同。
本发明的肽可以用本领域已知的技术方便地合成(见例如Merrifield，J.Am.Chem.Soc.852149-2154)。
此外，本发明的一部分为优选的模拟肽(peptidomimetic)，其保留了原有肽的结合特异性和/或生理学活性，如上所述。在此，“模拟肽”是指一种有机分子，其模拟肽的一些特性，优选地，其模拟肽的结合特异性和/或生理学活性。优选的模拟肽是通过对本发明的肽进行结构修饰而获得的，优选地使用非天然氨基酸、D氨基酸替代L氨基酸、构象限制、同配(isosteric)替代、环化、或其他修饰。其他优选的修饰包括但不限于那些其中的一个或多个肽键被非肽键所替代，和/或一个或多个氨基酸侧链被一个不同的化学结构所替代，或一个或多个N-端、C-端或一个或多个侧链被保护基团所保护，和/或在氨基酸链中引入双键和/或环化和/或立体特异性(stereospecificity)以增加强度和/或结合亲和力。
其他进一步优选的修饰包括那些旨在增强对酶性降解的抗性、提高其特别是在神经系统和生殖系统的组织中的生物利用度、以及更一般而言改善其药理动力学特征，并特别包含-保护NH2和COOH亲水基团，其通过使用亲脂性醇进行酯化作用(COOH)、或通过酰胺化(COOH)、和/或通过乙酰化(NH2)、或在NH2端添加羧基烷基或芳香疏水链；-CO-NH肽键的相互转化或还原异构体或酰胺官能团的甲基(或酮亚甲基(ketomethylene)，亚甲氧基(methyleneoxy)，羟基乙烯(hydroxyethylene))化物；-用L氨基酸替代D氨基酸；-氨基酸肽链二聚化。
所有这些变化均为本领域所熟知，因此，假如这些肽序列在此得到公开，可以使得本领域技术人员能够设计并生产出具有与此类肽相似或更佳的结合特征的模拟肽(见例如Horwell等，Bioorg.Med.Chem.41573(1996)；Liskamp等，Recl.Trav.Chim.Pays-Bas 1113(1994)；Gante等，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.331699(1994)；Seebach等，Helv.Chim.Acta 79913(1996))。
本发明所用的肽的制备通过液相或固相肽合成的常规方式进行，将待结合的不同的氨基酸残基顺序连接(在液相为从N-端至C-端，或在固相为从C-端至N-端)，其中的N-端以及反应性侧链被预先用常规基团封闭。
对于固相合成，可以特别地应用如Merrifield所述的技术。或者，也可应用Houbenweyl在1974所述的技术。
更多的细节可参考WO 98/37100。
本发明的治疗方法中所用的肽可通过基因工程方法获得。PCT专利申请No.WO 90/03891(Rougeon等)描述了编码完整的146个氨基酸的SMR1蛋白的cDNA的核酸序列。对于SMR1-肽的具有生物活性的肽的衍生物，例如X1QHX2X3X4的衍生物，本领域技术人员可参考通用文献以确定一种可用于合成所需的肽的适当的密码子。
下面描述的方法可使得本领域技术人员能够选择并纯化这些具有生物活性的衍生物，所述的衍生物所结合的靶向与本发明的SMR1-肽相同，并具有本发明的SMR1-肽的激动剂或拮抗剂的生物活性。
本发明的SMR1-肽的生物活性衍生物可以是蛋白、肽、激素、抗体或合成的化合物，所述的化合物可以是肽或非肽类化合物，其可通过有机化学的常规方法进行合成。
对本发明的SMR1-肽的生物活性衍生物进行筛选不但可通过分析候选配体分子与QHNPR五肽的NEP结合位点的结合，而且可通过检测由该候选分子诱导其靶向发生的代谢改变而实现，所述的代谢改变例如为通过蛋白激酶或腺苷酸环化酶的信号转导所引起的初级或次级信使的合成和/或释放，以及G蛋白家族的蛋白的激活，或NEP的酶活性的变化，特别 是天然的NEP底物的代谢。
候选分子的结合分析通常在4℃-25℃或37℃进行。为便于下文中所述方案的表述，使用QHNPR五肽来替代或与候选分子进行竞争。
因此，本发明的另一个目的是筛选特异性结合QHNPR五肽的NEP结合位点的配体分子的方法，其包含如下步骤a)制备含有QHNPR五肽的NEP结合位点的细胞培养物或靶器官标本或组织样品(冰冻切片或切片或膜制备物或粗匀浆物)；b)加入该待测定的候选分子与半饱和浓度的标记的五肽竞争；c)将步骤a)的所述的细胞培养物、器官标本或组织样品与所述的候选分子在利于特异性结合发生的条件下孵育足够的时间；d)定量分析在存在不同浓度的标记的候选分子的情况下(优选为10-10至10-5M)，特异性结合到所述的细胞培养物、器官标本或组织样品的标记物。
上述方法中的半饱和浓度是指可结合50％的NEP结合位点的标记的QHNPR五肽的浓度。
该方法还可用来定义候选分子相对于QHNPR的相对亲和力。
本发明的另一个目的是一种用于确定配体分子与QHNPR五肽的NEP结合位点发生特异性结合的相对亲和力的方法，其包含对每个候选分子进行上述a)，b)，c)和d)的步骤，并进一步包含步骤e)，该步骤将步骤d)的经定量分析的各个候选分子的亲和力与另一个候选分子进行比较。
本发明的另一个目的是一种用于确定配体分子与QHNPR五肽的NEP结合位点发生特异性结合的亲和力的方法，其包含如下步骤a)制备含有QHNPR五肽的NEP结合位点的细胞培养物或靶器官标本或组织样品(冰冻切片或切片或膜制备物或粗匀浆物)；b)加入预先经过放射性或非放射性标记物标记的候选分子；c)将步骤a)的所述的细胞培养物、器官标本或组织样品与所述的标记的候选分子在利于特异性结合发生的条件下孵育足够的时间；以及d)定量分析在存在不同浓度的标记的候选分子的情况下(优选为10-10至10-5M)，特异性结合到所述的细胞培养物、器官标本或组织样品的标记物。
该候选的配体分子可以是放射性标记的(32P、35S、3H、125I等)或是非放射性标记的(生物素、地高辛、荧光素等)。
因此，本发明还涉及筛选对QHNPR五肽的NEP结合位点具有激动剂生物活性的配体分子的方法，其包含如下步骤
a)制备含有QHNPR五肽的NEP结合位点的细胞培养物或靶器官标本或组织样品(冰冻切片或切片或膜制备物或粗匀浆物)；b)在存在候选分子(优选为10-10至10-5M)、半饱和浓度的QHNPR和NEP底物的情况下，孵育其浓度可满足在初始速率的条件下(例如在实施例1的材料与方法中所定义的那样)对NEP的酶活性进行测定的步骤a)的所述细胞培养物或器官标本或组织样品，孵育的时间足以使得NEP底物在初始速率条件下发生水解；c)分别在有或没有所述的候选配体分子以及有或没有QHNPR的情况下，通过测定NEP底物水解的程度对步骤a)的生物物质中的NEP的活性进行定量分析。
在上述方法中，半饱和浓度是指使NEP底物的降解降低一半的QHNPR五肽的浓度。
本发明的另一个目的包含一种用于筛选对QHNPR五肽的NEP结合位点具有拮抗剂生物活性的配体分子的方法，其包含一些步骤a)制备含有QHNPR五肽的NEP结合位点的细胞培养物或靶器官标本或组织样品(冰冻切片或切片或膜制备物或粗匀浆物)；b)在存在次最大浓度的XQHNPR肽、特别是QHNPR肽以及NEP底物的情况下，在存在候选分子的情况下，孵育其浓度可满足在初始速率的条件下对NEP的酶活性进行测定的步骤a)的所述细胞培养物或器官标本或组织样品，孵育的时间足以使得NEP底物在初始速率条件下发生水解；c)分别在有或没有所述的候选配体分子以及有或没有QHNPR的情况下，通过测定NEP底物水解的程度对步骤a)的生物物质中的NEP的水解活性进行定量分析。
在上述方法的一个优选的实施方案中，次最大浓度是指能够使所述底物的降解降低至少50％且优选地为至少75％的五肽的浓度。
如上所述，另一个代谢分析可以评价候选配体分子的激动剂或拮抗剂活性，其包含将候选配体分子与原代细胞培养物、已有的细胞系、或来自大鼠、小鼠或人的组织样品、以及内源性或外源性的NEP底物进行孵育，对NEP底物的水解进行定量或定性或既定量又定性的测定。
优选地，用于本发明的筛选方法的组织样品是大鼠脊髓的膜制备物或切片，已知该组织适合用于进行NEP活性分析。
这一过程也可应用于来自小鼠或人的组织和/或细胞，或是用人的NEP cDNA转染的细胞系。其他可用于本发明的筛选方法的优选的组织样品为所有外周组织制备物，已知其富含NEP-肽和/或是SMR1-肽的靶向，例如大鼠肾脏外髓、胎盘、睾丸、前列腺和骨。此外，这一过程也可应用于来自小鼠或人的组织和/或细胞，或是用人的NEP cDNA转染的细胞系。
本发明的治疗组合物的SMR1-肽的优选的生物活性衍生物、特别是X1QHX2X3X4的优选的生物活性衍生物，较内源性的天然的或合成的X1QHX2X3X4肽具有更好的药效特性，因此与其天然的对应物相比具有更长的体内半衰期，并在特定的组织和部位具有更好的生物利用度，特别是在神经和性腺组织。
上述的生物活性衍生物也是本发明的一个目的。
因此，本发明还涉及SMR1的成熟产物和可根据上述的筛选方法被筛选出来的SMR1蛋白或其成熟产物的生物活性衍生物，条件是它们不具有上述的通式(1)的结构。实际上，也不包括组成SMR1蛋白本身的146个氨基酸的蛋白(PCT专利申请N DEG WO90/03981)。但是，被排除在外的这些分子的如本发明所述的治疗用途是本发明的一个主要目的。
本发明的另一个目的是SMR1-肽的生物活性衍生物，其特征为能够升高或降低金属肽酶的活性，或阻断SMR1-肽与所述的金属肽酶之间的正常的相互作用。优选地，所述的金属肽酶是膜锌金属肽酶，更优选地，所述的膜锌金属肽酶是NEP。
SMR1-肽的生物活性衍生物的特征为，假如其不具有上述的通式(1)的结构，其还包括SMR1蛋白的成熟产物。
在优选的实施方案中，对用于本发明的治疗组合物的SMR1的成熟产物和SMR1-肽或其成熟产物的生物活性衍生物进行筛选时，首先是根据其与X1QHX2X3X4、特别是QHNPR肽的靶向相结合的能力，其次是通过其在体外或体内对金属肽酶例如NEP的底物的水解的调节能力。
“调节”应理解为所述的SMR1-肽能够升高或降低(抑制)所述的金属肽酶的活性，或阻断SMR1-肽与所述的金属肽酶之间的正常的相互作用。
本发明还涉及包含有效量的SMR1-肽的治疗组合物的用途。
根据本发明的方法，本发明的肽或模拟肽可以多种途径施用。在一些优选的实施方案中，可通过肠外施用，最优选静脉施用。在其他优选的实施方案中，可以通过鼻内、口服、舌下、经粘膜、气道内、或经由惰性的或离子导入贴膜而施用。
所施用的的肽或模拟肽的剂量取决于特定的病人、病情、以及施用途径，并且可以根据经过提高治疗剂量后上述病理性异常情况的减轻或消除的情况，对施用剂量进行经验性判断。优选的剂量为大约0.1μg/kg-大约1mg/kg，更优选地为大约1μg/kg-大约100μg/kg，且最优选地为大约1μg/kg-大约50μg/kg。
在特定的优选的实施方案中，本发明的肽或模拟肽与一种第二药物制剂共同施用，其中所述的第二药物制剂的量不足以减轻或消除所治疗的疾病的症状，而其中本发明的肽或模拟肽与所述的第二药物制剂协同作用可减轻或消除所治疗的疾病的症状。所述的第二药物制剂可以是或不是金属肽酶的调节剂。
“协同”是指所述的肽或模拟肽与所述的第二药物制剂共同作用在减轻或消除疾病的症状方面，较两者中的任何一种在同样浓度单用时更为有效。
本发明还涉及分子复合物，其包含-NEP受体或NEP受体的SMR1的结合位点；-SMR1-肽。
在下面的实施例中，将对本发明进行详细的阐述，但本发明并不仅仅局限于这些特定实施方案的范围。
图1-A在有或没有10μM的合成的NEP抑制剂磷酸阿米酮的情况下，脊髓膜蛋白浓度对P物质水解(25nM)的影响。各点代表的是在终体积为250μl的Tris/HCl缓冲液中，在30℃经脊髓膜孵育15分钟后，发生水解的3H-P物质的百分数。
图1-B在有或没有终浓度为10μM的各种肽酶抑制剂(ACE抑制剂卡托普利、CPB和DPPIV抑制剂、GEMSA和DPPIV抑制剂)的情况下，由大鼠的脊髓膜制备物引起的P物质水解(12.5nM)的时间过程。各点代表的是在终体积为250μl的Tris/HCl缓冲液中，在25℃经250μg膜蛋白孵育后，发生水解的3H-P物质的百分数。
图2在有或没有终浓度为10μM的各种肽酶抑制剂(NEP抑制剂磷酸阿米酮、NEP抑制剂Thiorphan、CPB和DPPIV抑制剂、GEMSA和DPPIV抑制剂、单独SMR1-QHNPR或SMR1-QHNPR与CPB和DPPIV抑制剂组合)的情况下，脊髓切片中的Met-脑啡肽酶(Met-enkephalinase)活性。对照代表在无组织切片时Met-脑啡肽的回收。
图2-A数值代表在终体积为1ml的KRBG缓冲液中，与1mg新鲜组织切片在25℃孵育20分钟后回收，经RIA分析测定得到的完整的和免疫反应性Met-脑啡肽的浓度(μM)(2次测定的平均值)。
图2-B数值代表在终体积为1ml的KRBG缓冲液中，与1mg新鲜组织切片在25℃孵育20分钟后回收，经RP-HPLC分析(峰值在保留时间的18.9分钟)测定得到的完整的Met-脑啡肽的量(2次测定的平均值)。
图3-A在有或没有终浓度为10μM的各种肽酶抑制剂(NEP抑制剂磷酸阿米酮、NEP抑制剂Thiorphan、CPB和DPPIV抑制剂、GEMSA和DPPIV抑制剂、单独SMR1-QHNPR或SMR1-QHNPR与CPB和DPPIV抑制剂组合)的情况下，由大鼠的脊髓切片引起的P物质水解(25nM)。对照代表在无组织切片的情况下3H-P物质的水解。各点代表的是在终体积为1ml的KRBG缓冲液中，在25℃，经1mg新鲜组织切片孵育后，发生水解的3H-P物质的百分数。
图3-BSMR1 QHNPR对由大鼠的脊髓膜制备物引起的P物质(12.5nM)代谢的浓度依赖性抑制作用。与NEP抑制剂磷酸阿米酮，CPB和DPPIV抑制剂，GEMSA+DPPIV抑制剂的比较。QHNPR肽单独所产生的抑制活性或QHNPR肽与CPB和DPPIV抑制剂组合所产生的抑制活性的比较。各点代表的是在终体积为250μl的Tris/HCl缓冲液中，在25℃经250μg膜蛋白孵育10分钟后，完整的3H-P物质的回收百分数(2次测定的平均值)。
图4大鼠的各种外周组织膜的P物质催化活性以及SMR1-QHNPR(sialorphin)对来自肾脏的膜的剂量反应抑制效力。
图4-A用25nM的3H-P物质和10μM的抑氨肽酶素B测定的组织膜制备物的内肽酶活性。在有或没有10μM的sialorphin或NEP抑制剂(10μM的磷酸阿米酮或1μM的thiorphan)的情况下测定酶特异性活性，以pM/分钟/μg膜蛋白表示。
图4-Bsialorphin对大鼠肾脏膜制备物引起的3H-P物质的分解的浓度依赖性抑制作用。各点代表回收的320nM的完整3H-P物质的百分数，百分数的计算方法为(无抑制剂的速率-有抑制剂的速率)/无抑制剂的速率，(*)代表4次测定的平均值±SD。Sialorphin的浓度以nM表示，如B右侧的对数图。膜酶的蛋白浓度根据初始速率的测定条件限定。
图5Sialorphin对大鼠肾脏的膜引起的P物质的内切蛋白水解活性的抑制活性分析未转化图(图5-A)、双倒数图(图5-B)和Dixon图(图5-C)的代表性图示。
通过用P物质作为底物测定Sialorphin的抑制效力，对于A和B，P物质的浓度如图所示，对于C，其浓度为14-24nM(黑三角)或56-105nM(空白三角)。图5-A和B中的抑制剂的浓度为0(黑圆圈)、1500(空白圆圈)和4500nM(空白方块)。未转化图和双倒数图的各点代表2次独立测定、每次3个测定值的平均值。实验在初始速率测定条件下，在25℃，250μl的Tris/HCl缓冲液(50mM，pH 7.4)中进行。
图6静脉施用Sialorphin后，大鼠对有害刺激的疼痛反应性。
经大鼠静脉施用Sialorphin和其载体后5分钟进行为期3分钟的测验阶段。在施用Sialorphin前15分钟给大鼠皮下注射纳络酮(0.3mg/kg体重)。3分钟的测验中在中央区域(中央区域为无针的空旷区域)的时间(图6-C)和在外周区域(覆盖有针)的活动(图6-A和B)。各值代表每组8只大鼠的平均值±SEM。1＝在外周区域穿行；2＝在外周区域的跳起次数；3＝逃避反应的次数；4＝可听到的发声次数；5＝出现在中央区域的时间。
对照组对应于用载体处理的大鼠的疼痛反应。50μg/kgSialorphin、100μg/kg Sialorphin、100μg/kg Sialorphin+0.3mg/kg纳络酮。
实施例实施例1离体测定肽与NEP相互作用所产生的功能结果在Met-脑啡肽和P物质的细胞外水平，用大鼠的神经组织的膜制备物和新鲜切片分析SMR1-五肽对外源性NEP敏感性肽的保护作用结果。
1.材料与方法1.1.动物和组织制备物使用性成熟的雄性Wistar大鼠(Iffa Credo)(7-9周龄)。直到实验日之前，这些大鼠被置于稳定的环境温度(24℃)和光照周期(8h开/20h关)的条件下，并可随意获得食物和水。实验当日，将实验动物以戊巴比妥(Sanofi，45mg/kg体重，腹腔注射)或氯胺酮(Imalgene 500，Rhone Merieux，150mg/kg体重，腹腔注射)麻醉，或选择二氧化碳窒息，然后以心脏穿刺处死·新鲜组织切片取出脏器，在冰上切开，去除神经纤维和脂肪组织，然后以冷的含有氧化葡萄糖和碳酸氢钠Krebs Ringer(KRBG)溶液洗涤，该溶液的组分如下120mM NaCl，5mM KCl，1.2mM KH2PO4，27.5mMNaHCO3，2.6mM CaCl2，0.67mM MgSO4，5.9mM glucose。组织切片可用手术刀手工制备(厚度1-2mm)，或用″Tissue Chopper″制备(厚度1mm)。将切片分散至反应试管中，并用冰冷的氧化KRBG连续洗涤3次。然后将其作为酶的来源，置于添加了10μM Bestatin(膜氨基肽酶APN的抑制剂，Roche)的KRBG缓冲液中，在4℃、95％O2-5％CO2环境中保存，直至使用前。
·膜制备物将切开并经过冰冷的KRBG洗涤的器官置于10倍体积(体积/重量)的50mM Tris/HCl缓冲液(pH 7.2)中，用Teflon玻璃匀浆器在4℃进行匀浆(3×5秒)。以1000×g，4℃第一次离心5分钟，以去除沉淀中的组织碎片和细胞核。将上清液以100,000×g，5℃进行第二次离心，以便将膜成分浓缩于沉淀中，沉淀以冷的Tris/HCl缓冲液漂洗3次，而后用Kontes匀浆器重悬于新鲜的缓冲液中，分装并保存于-80℃至少3个月，作为酶的来源备用。
1.2蛋白测定使用Bio-Rad DC蛋白分析(Bio-Rad)来测定组织和膜蛋白浓度。如同Lowry分析，Bio-Rad试剂盒也基于样品的蛋白成分与碱性酒石酸铜溶液和Folin试剂间发生的反应。在加入试剂后15分钟至2小时之间于750nm处读取吸光度。以稀释至蛋白浓度为0.2至1.44mg/ml的标准BSA(牛血清白蛋白)溶液来得到标准曲线。
1.3.测定NEP的酶活性1.3.1.NEP来源-底物和抑制剂为进行NEP肽酶活性分析实验，首先建立一个离体模型，其使用的是神经组织的膜和新鲜组织切片制备物的孵育产物，即大鼠脊髓的背区，已知其适合用于分析NEP肽酶的活性。使用参与疼痛反应信号途径的两个底物，即神经肽Met-脑啡肽和P物质，来测定NEP敏感性肽的代谢率。我们使用天然的Met-脑啡肽(Peninsula，10μM)和氚标记的P物质[(3，43H)Pro2-Sar9-Met(O2)11]-P物质，其具有的特定的放射性为40Ci/mmol(NEN，12.5-25nM)。
我们的目的是测定这些底物的NEP特异性内切蛋白酶解(endoproteolysis)。为此，在每次检测中，均要在有或没有特异性的合成的NEP抑制剂的情况下(10μM磷酸阿米酮，Roche和/或1-10μM Thiorphan，Sigma)分析底物的水解情况，同时，在所有的检测中均存在APN的抑制剂，即Bestatin(10μM)。此外，为研究SMR1-QHNPR的功能作用，上述反应是在SMR1-肽单独存在或SMR1-肽与膜肽酶的抑制剂(即羧肽酶B抑制剂(GEMSA，10μM，Sigma)和二肽肽酶IV抑制剂(DPPIV抑制剂，10μM，Roche)，所述的抑制剂可通过裂解QHNPR肽的C-端而使之失活)组合存在的情况下进行的。
1.3.2.酶活性分析·新鲜的组织切片首先，在有或没有NEP抑制剂的情况下，将新鲜组织的切片置于含有10μM bestatin的KRBG介质中，在25℃、30℃或37℃的恒温搅拌水浴箱中，在95％O2-5％CO2的环境下，进行预孵育。预孵育15分钟后，将原有的介质更换为只含有底物或含有底物和NEP抑制剂或SMR1-QHNPR的新鲜的介质，在与预孵育相同的条件下进行孵育。孵育5-30分钟后，将介质转移至含有盐酸的冰冷的试管中，盐酸的终浓度为0.1N。将样品置于-30℃，直至对其完整底物及其代谢成分进行测定。
孵育的温度和时间以及底物和组织酶的浓度可根据结果进行限定，这样使得NEP的水解活性可在初始速率的条件下进行测定。
·膜制备物在有或没有NEP抑制剂的情况下，将膜制备物置于含有10μMbestatin的50mM Tris/HCl(pH7.2)中，在25℃、30℃或37℃的恒温搅拌水浴箱中进行预孵育。预孵育10分钟后，只加入底物或加入底物和NEP抑制剂或SMR1-QHNPR，在与预孵育相同的条件下进行孵育。孵育结束后，将反应体系冷却至4℃以终止反应，并加入盐酸使盐酸的终浓度为0.3N。将样品置于-30℃，直至对其完整底物及其代谢成分进行测定。
孵育的温度和时间以及底物和膜酶的浓度可根据结果进行限定，这样使得NEP的水解活性可在初始速率的条件下进行测定。
1.3.3.底物及其代谢物的检测对完整的底物及其代谢物进行分离、测定和定量采用了不同的技术(这取决于底物是否为放射性标记的)前两种基于选择性分离反应产物的反向层析(C-18 Sep-Pak柱体和RP-HPLC)，第三种基于特异性测定底物的放射免疫分析(RIA)。
·The C-18 Sep-Pak柱体使用C-18 Sep-Pak柱体(Waters)对放射性标记的肽的水解情况进行分析其根据各种化合物的极性的不同来分离化合物。肽的代谢物与完整的肽底物相比，其疏水特征降低甚至消失，因此该固相提取方法可将底物自其代谢物中分离出来。
分两个步骤洗脱放射性标记的P物质的3H-代谢物，第一步骤使用H2O-0.1％TFA，第二步骤使用20％甲醇-0.1％TFA，而完整的3H-P物质通过第三步骤使用70-100％的甲醇-0.1％TFA进行洗脱。通过液态闪烁光谱法(liquid scintillation spectrometry)来测定洗脱下来并被分离的化合物的放射性。
·RP-HPLC(反向高效液相层析法)HPLC具有很高的分辨率，可对浓度最低为1to 10μM的非放射性肽进行分离，并可结合分光光度仪分析对其进行检测。C-18RP-HPLC与C-18 Sep-Pak cartridge基于同样的原理。用层析分析来研究Met-脑啡肽的水解，使用的是填充了5μm直径的珠的C-18LUNA分析柱(150×4.6mm内径，AIT)。
RP-HPLC采用的是一步30分钟的线性梯度，其范围从H2O-0.1％TFA到100％乙腈-0.1％TFA，流速在1ml/min，以使得两种Met-脑啡肽代谢物与完整的底物得到分离。通过在254nm连续监测柱体流出物的UV吸光度对上述分离物进行鉴定并测定其相对量(峰的高度)。
·RIA分析(放射免疫分析)RIA为精确的分析方法，可对化合物进行定量分析，所述的化合物的浓度在1到100nM之间或更低。在此使用了竞争性RIA系统结合于抗体的放射性抗原的量的下降方式与标准溶液或样品中含有的抗原的量呈反比。通过免疫沉淀将游离的放射性抗原自放射性抗原-抗体复合物中分离出去。
通过对最初的Met-脑啡肽底物消失情况的定量分析来监测脑啡肽NEP的活性。第一抗体是针对Met-脑啡肽的C-端的兔抗体(其与代谢物或其他肽的交叉反应性是1％)(Goros等，J.Neurochem.(1978)，31；29-39.大鼠脑内的甲硫氨酸和亮氨酸脑啡肽的放射性免疫分析以及与放射性受体分析估计的内啡肽的比较)。第二抗体是针对兔免疫球蛋白的马抗体。放射性抗原是碘化的Met-脑啡肽(125I-Met-Enk脑啡肽)，估计其特定的放射性为3000Ci/mmol。
简要地，Met-脑啡肽的RIA分析在100mM Tns/HCl(pH8.6，含0.1％BSA和0.1％TritonX100)中进行。将标准(1-100nM)或样品(100μl)，稀释的抗Met-脑啡肽抗体(100μl，1/2000)和125I-Met-Enk(10000cpm，100μl)在4℃孵育过夜。在存在聚乙二醇6000(6％)的情况下，用第二抗兔免疫球蛋白进行免疫沉淀以将结合成分和游离成分分开。经过离心，用gamma分光计对沉淀中结合的放射性进行定量分析。
2.结果为详细说明SMR1-QHNPR对NEP酶活性的抑制作用，有必要先建立一个实验方案，以便能够在初始速率测量的条件下进行P物质或Met-脑啡肽的水解。
2.1.寻找NEP内肽酶活性的初始速率测量的实验条件2.1.1.天然Met-脑啡肽的水解在第一系列的实验中，将脊髓组织的切片和膜制备物分别置于终体积为1ml的KRBG中(在30℃)和终体积为0.25ml的Tris/HCI(50mM，pH7.2)中(在37℃)进行孵育。
·RP-HPLC分析经校准，RP-HPLC层析系统提示标准Met-脑啡肽在保留时间18.8分钟时洗脱出来。对于样品，在存在NEP特异性抑制剂时，其峰的高度显著地升高该峰代表了完整的Met-脑啡肽底物，其保留时间为18.8±0.2分钟。相反，保留时间为5.8±0.2分钟和12.8±0.1分钟的两个峰分别代表代谢物Tyr-Gly-Gly和Phe-Met，其在无NEP抑制剂的情况下出现。该结果说明脊髓组织的酶已经在肽的Gly-Phe肽键处将底物裂解，这代表了脑啡肽酶的活性。
在膜制备物以及新鲜的组织切片水平，外源性Met-脑啡肽的高度NEP特异性的水解出现于37℃孵育后10分钟脊髓脑啡肽酶活性导致Met-脑啡肽峰的消失，而当存在10μM磷酸阿米酮或1μMThiorphan时，情况相反(80-90％被抑制)。此外，在上述情况下，这两种特异性NEP抑制剂在37℃孵育10到30分钟期间均可将脑啡肽酶的活性几乎完全抑制。
由于在37℃孵育10分钟即可明确达到最大的水解，因此在随后的实验中孵育温度随之降低到30℃，继而25℃。这对于在30℃孵育的新鲜组织切片是有效的，Met-脑啡肽水解的程度随时间(0-30分钟)而升高。对于在30℃孵育的膜制备物结果相同，还可以注意到，随着酶浓度的增加(自0到2mg/ml)，水解的程度也随之增高。但是没有明确的线性关系。
实际上，HPLC层析结合分光光度计分析是一种半定量技术，单纯测定峰的高度或面积不足以精确到计算定量的比例关系。因此，接下来使用了特异性定量RIA测定方法来对Met-脑啡肽进行精确定量分析。
2.1.2.修饰的氚标记的P物质的水解建立了用于在初始速率测量条件下研究由含有NEP的神经组织引起的底物(即Met-脑啡肽和P物质)的水解的实验参数。
就此，首先测定的是，在30℃孵育15分钟后，大鼠脊髓的膜蛋白浓度(终浓度自0.03到1mg/ml)对P物质(25nM)水解的影响。如图1-A所示，3H-P物质降解的程度(以初始底物浓度的百分数表示)以与膜蛋白浓度呈线性函数关系的方式成比例地自2升高到25％。在有或没有10μM磷酸阿米酮的情况下均存在密切的相关性(分别为r＝0.99，n＝7和r＝0.98，n＝7)。此外，在相同的实验条件下，加入磷酸阿米酮可使P物质的降解明显减少(对外源性肽产生50-65％的保护作用)。
相似地，在25℃时，P物质水解的程度(12.5nM)作为孵育时间(5-20分钟)的函数也得到了研究。膜蛋白的浓度选择为1mg/ml。脊髓膜引起的P物质的代谢随孵育时间的延长呈线性增加，其相关性为r＝0.97，n＝18(图1-B)。卡托普利(10μM)为一种有效的血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂，其也能够裂解P物质，卡托普利对膜制备物的酶的活性没有影响，对于CPB和DPPIV酶的有效抑制剂(C-端SMR1-QHNPR代谢的保护性化合物)也是一样。
如此看来，含有NEP的脊髓组织引起P物质水解的初始速率测定的条件已经建立了。然而，两种NEP抑制剂(磷酸阿米酮和Thiorphan)的活性作为孵育时间的函数似乎并不成比例地稳定。因此，将针对与孵育时间的相关性，就SMR1-QHNPR肽对NEP活性的影响进行系统的研究。
2.1.3.记录下表给出的实验条件可用于研究在初始速率测定条件下，离体的脊髓组织所引起的Met-脑啡肽和P物质的代谢。
2.2研究SMR1-QHNPR肽与NEP相互作用引起的功能结果2.2.1 NEP脊髓引起的Met-脑啡肽的降解首先测定的是，在如2.1.3中多记载的实验条件下，固定浓度的SMRI-QHNPR(10μM)对脊髓切片的Met-脑啡肽酶活性的影响。
·RP-HPLC分析如图2-B所示，HPLC分析显示在25℃孵育20分钟内，脊髓切片引起的Met-脑啡肽底物的高度NEP特异性水解。磷酸阿米酮在浓度为10μM时可使Met-脑啡肽酶的活性得到完全的抑制，而加入Thiorphan(10μM)可减少Met-脑啡肽的降解达80％。
在同一个实验中，QHNPR肽在10μM的浓度下，其单独或与CPB和DPPIV蛋白酶的抑制剂组合应用，显示出70或80％的抑制活性；因此，当两者的浓度相同时，SMR1-五肽能够与脑啡肽-五肽竞争NEP结合位点。对于脊髓膜制备物引起的P物质降解，单独应用CPB和DDPIV的抑制剂对新鲜的脊髓切片引起的Met-脑啡肽的降解没有任何内在抑制活性。此外，它们显然不需要自新鲜脊髓组织切片中可能存在的肽酶活性中保护SMR1-QHNPR其自身，特别是在其C-端。
为精确地定量分析NEP活性以及抑制，对同一个实验借助于特异性Met-脑啡肽RIA进行分析。
·RIA分析总体上，通过反向HPLC技术所得到的粗略结果得到了RIA分析的支持(图2-A)。在25℃孵育20分钟期间，磷酸阿米酮，Thiorphan，以及SMR1-QHNPR似乎可很有效地保护Met-脑啡肽免于被NEP降解活性所降解。因此，在10μM的浓度下，它们近乎完全地阻断了新鲜的脊髓组织引起的10μM Met-脑啡肽的降解保护作用分别为96％，100％和96％。
总之，所有这些结果均显示，在离体情况下，SMRI-QHNPR肽对大鼠神经组织的Met-脑啡肽酶活性具有负调节作用。
2.2.2 NEP脊髓引起P物质降解·SMR1-QHNPR抑制NEP对P物质的代谢活性如同在针对Met-脑啡肽的实验中所述，首先研究QHNPR肽对P物质水解的影响。为此，使用了脊髓切片，并在如2.1.3.中所述的初始速率测定的条件下，进行30分钟的孵育动力学测定。
如图3-A所示，P物质水解反应在初始速率测定条件下可有效进行发现在物质水解25℃的孵育时间之间存在密切的相关性，r＝0.99。10μM磷酸阿米酮或10μM Thiorphan显示出了相对而言相同的抑制活性(抑制程度60-65％)。发现QHNPR肽(10μM)是抑制有效的抑制剂其单独使用可抑制75％的P物质的降解，当其与GEMBA(10μM)和DPPIV抑制剂(10μM)组合应用时，抑制达90％以上。但后者显示出对新鲜的脊髓组织引起的P物质的降解具有内在的抑制活性。
另外，在该实验中，抑制剂的效果作为孵育时间的函数在30分钟的孵育期间具有稳定的比例(r＝0.99)。
·测定IC50如图3-B右栏所示，SMR1-QHNPR对脊髓膜制备物引起的3H-P物质降解的抑制效应的反应曲线，可以对大约1.10M的IC50值进行计算(3H-P物质降解减少一半时的抑制剂浓度)。在同一个实验中，与磷酸阿米酮的比较显示出SMR1-QHNPR对外源性P物质的保护仍与磷酸阿米酮相当(图3-B左栏)。此外，QHNPR肽与CPB和DPPIV的抑制剂组合使用显示出极高的NEP抑制活性，较磷酸阿米酮更显著(图3-B，左栏)。
2.2.3.记录通过氚标记的底物结合层析分析(P物质)或通过天然底物结合特异性RIA定量分析(Met-脑啡肽)来测定NEP-敏感性肽的代谢率。在NEP酶活性的初始速率测定条件下，加入SMR1-五肽可引起外源性Met-脑啡肽或P物质的代谢几乎被完全抑制经计算，使得由脊髓组织引起的P物质降解减少一半的SMR1-QHNPR的浓度为1.10M，其抑制效力等同于两个已知的NEP-特异性抑制剂，即Thiorphan和磷酸阿米酮。从这些结果似乎发现，在离体情况下，SMR1-五肽可有效地阻断脊髓NEP诱导的两个参与调控脊髓疼痛感觉的神经肽，即P物质和Met-脑啡肽的降解。
实施例2SMR1-QHNPR(sialorphin)，外周组织引起的P物质分解代谢的抑制剂最初的结果显示了sialorphin肽对大鼠神经组织的脑啡肽酶活性的调节作用。同样的方法也应用到外周组织的膜制备物，已知其富含NEP肽酶并且/或者在体内是sialorphin的靶向，所述的组织为肾脏外髓、小肠粘膜、胎盘、前列腺、牙和骨组织，以及颌下腺上皮(Rougeot等，美国病理学杂质，1997，273，R1309-20；Sales等，1991，调节肽，33，209-22；Kenny等综述，1987，哺乳动物胞外酶，169-210)。有证据显示，几乎所有这些组织均含有由外周副交感神经和感觉神经末梢所释放的P物质，其在释放部位附近作用于靶细胞，所述的靶细胞含有调节特定组织功能的神经激肽(neurokinin)受体(McCarson等，1999，神经科学，93，361-70)。因此，该神经肽可被视为外周的生物学相关的NEP底物。但是，P物质可被膜结合肽酶NEP和ACE有效裂解，而这两种酶在肾脏上皮有广泛的分布(Skidgel等，1985，临床和生物学研究进展，192，371-8)。
对肽酶的特异性的分析采用了以下方法通过测定选择性肽酶抑制剂(终浓度在1-10μM以诱导最大抑制反应)对各种组织膜酶引起的3H-P物质的内切蛋白水解作用的抑制效力，以及通过对如前所述的应用脊髓组织的反应中NEP相关的氚标记的产物的生成情况进行分析。此外，在初始速率测定的标准条件下，将抑氨肽酶素B(10μM)加入到孵育培养基中以非选择性地阻断膜氨基肽酶活性。
如图4-A所示，并与先前的结果一致，雄性大鼠的肾脏含有最高的P物质水解特异性活性197pM/分钟/μg膜蛋白，其中NEP活性占61±10％，n＝4；ACE活性占38±12％。Sialorphin抑制肾脏膜活性的效果与磷酸阿米酮NEP抑制剂相同，即最大抑制反应为60±5％(n＝9)。当以P物质为底物，测定纯化的兔肾脏NEP的抑制效力时(Vi＝140pM/分钟/μg酶)，发现该可溶性酶引起的P物质的分解代谢被Sialorphin抑制(5μM时为46％)。
此外，Sialorphin对大鼠肾脏引起的3H-P物质的降解的抑制作用，如图4-B所示，具有严格的剂量依赖性(r＝0.970，n＝20)，因此可以用
微摩尔范围的IC50测定抑制效力。该抑制效力与用纯化的兔肾脏NEP和合成的特异性产生荧光(fluorogenic)底物所得到的结果(即0.6μM)或用大鼠脊髓NEP所得到的结果(即0.4μM)密切相关。
所有这些结果显示，被体内组织摄取证实的肾脏NEP/Sialorphin分子相互作用可引起生理学的作用，例如保护NEP诱导的、该组织的调节肽的代谢，所述的调节肽例如为P物质，一种体液血管舒张性-促炎症性介质和自主性神经递质。肾脏含有最高的NEP活性，其似乎也是ANP代谢的主要部位(Webb等，1988，FEBS Letters，232，1-8)；ANP是血管舒张和利尿钠因子，其介导了对血压、体液循环和矿物质内稳态的生理学调节。
在大鼠胎盘和前列腺组织，另两个富含NEP的外周组织中，P物质内切蛋白水解活性较肾脏低12-14倍，且NEP占74±10％，n＝5，ACE只占8％。此外，Sialorphin使这些组织的P物质的降解下降了70±3％。全身性施用亲水性化合物例如Sialorphin 3H-肽不能到达前列腺组织，但该组织能够合成之，这提示Sialorphin具有潜在的重要的局部作用，例如作为内源性肽能信号(如P物质)失活的抑制剂(Rougeot等，1994，欧洲生物化学杂志，219，765-73；Rougeot等，1997，美国生理学杂志，273，R1309-20)。
最为惊人的结果来自大鼠内牙组织的研究，在体内，其是Sialorphin的主要靶向，其显示出高水平的P物质内切蛋白水解活性，即44pM/分钟/μg膜蛋白(Rougeot等，1997，美国生理学杂志，273，R1309-20)。加入NEP抑制剂使得3H-P物质的分解下降了53±4％，而ACE抑制剂使之下降了21％，Sialorphin为39±14％，n＝4。与此结果一致，Sialorphin对内骨组织引起的胞外酶敏感性P物质降解的抑制效力为75±10％，n＝4。Sialorphin可能在这些组织中参与了NEP的功能，支持这一点的研究发现，该酶在大鼠外周组织中的分布和活性与Sialorphin的组织分布和隔绝(sequestration)部位的密度十分符合；这些组织包括骨骼和牙槽骨以及骨膜(Rougeot等，1997，美国生理学杂志，273，R1309-20；Sales等，1991，调节肽，33，209-22；Llorens等，1981，欧洲药理学杂志，69，113-6)。此外，来自内骨和牙的膜提取物的主要Sialorphin相关分子的pI分别为5.2±0.4(n＝5)和5.7±0.6(n＝3)，与NEP的pI(5.5)相关良好。但是，参与调节骨骼和牙的矿物化和/或重吸收过程的生理学NEP敏感性效应肽还有待于鉴定。
相似的情况也见于其他的此前被证明标记了NEP抑制剂或Sialorphin的结构，如大鼠的SMG(Rougeot等，1997，美国生理学杂志，273，R1309-20；Sales等，1991，调节肽，33，209-22)。实际上，SMG的P物质水解的特异性活性水平为4.2pM/分钟/μg膜蛋白，且NEP活性占55±12％，n＝4，ACE占20％，而加入Sialorphin可产生79％的抑制。该腺体是Sialorphin合成的主要场所，在此其可能通过调节P物质(在大鼠为特别强效的sialolog化合物)的活性而参与调节了局部的蛋白和/或体液分泌(Yu等，1983，实验生物学和医学，173，467-70)。
此外，一些其他的富含区域为肠道，特别是小肠壁，其表达NEP，含有P物质的外在感受器和肠神经元以及Sialorphin摄取部位(Rougeot等，1997，美国生理学杂志，273，R1309-20；Holzer等，197，药理学和治疗学，73，219-63)。大鼠小肠的膜成分引起的P物质的内切蛋白水解为93.5pM/分钟/μg膜蛋白。抑制分析显示，加入NEP抑制剂可使外源性3H-P物质的分解减少51％，而加入Sialorphin可产生明显的抑制反应，其保护可达87±17％，n＝3。
总之，这些结果强烈提示，在体外，Sialorphin有效地阻断内肽酶诱导的神经肽或体液介质如P物质的降解，在局部存在P物质的一些组织中，也存在NEP和Sialorphin的合成和/或摄取。这提示，在体内，循环中的Sialorphin调节了P物质的外周血管扩张和促炎症的作用。可以假设，Sialorphin也调节了其血管松弛、利尿和利尿钠作用，特别是在肾脏、小肠、骨和颌下腺(Kenny等，1988，FEBS Letters，232，1-8；Vargas等，1989，内分泌学，125，2527-31；Gonalez等，2000，肽，21，875-87)。
实施例3Sialorphin具有竞争性抑制剂的动力学行为特征为测定抑制剂模型，所有肾脏酶性反应的初始速率测定值均按若干固定的抑制剂浓度对底物浓度作图或按固定底物浓度对抑制剂浓度作图。
Sialorphin对肾脏膜引起的3H-P物质的分解的抑制作用分析以未转化图(图5-A)、双倒数图(图5-B)和Dixon图(图5-C)表示，这些图的曲线形式具有竞争性抑制的特征。竞争性抑制剂通过结合酶的活性位点起作用，因此可直接与底物竞争活性形式的游离酶。因此，Sialorphin与P物质的竞争的动力学效应使得酶对底物的表观Km升高了2-5倍。
另外，Sialorphin肽的组织摄取涉及了分子复合物，包括一阳离子金属元素，这是由于仅在存在强二价金属离子螯合剂的情况下，肽才能被回收(Rougeot等，1997，美国生理学杂志，273，R1309-20)。此外，螯合HPLC分析显示，Sialorphin具有选择性的强锌螯合基团，似乎与其组胺酸残基有关。研究认为，锌离子作为NEP催化位点的必需成分，是合成强效的NEP抑制剂的通用靶向。实际上，这些抑制剂被设计为以磷酸(磷酸阿米酮)或巯基(thiophan)或hydroxamate基团(kelatorphan)作为锌配位部分，适合金属肽酶的活性位点(见Roques等综述，1993，药理学综述，45，87-146)。
考虑到Sialorphin的动力学行为及其在体内与其膜受体位点的相互作用涉及多价金属离子，可以推测Sialorphin与反应的过度态存在一些结构上的共同性，因此可以优化与酶的活性位点的基团的相互作用，例如作为锌的配位配体。
对NEP与Sialorphin所形成的复合物的晶体结构的测定将更深入的了解该天然竞争抑制剂的独特的结合模式。
实施例4Sialorphin，新型的天然镇痛剂NEP在调控神经肽信号的生物活性方面具有至关重要的作用，神经肽信号参与将各种类型的感受信息自外周组织(皮下、肌肉和内脏)传递至多重中枢和外周的神经系统神经元回路。在这些介质中，P物质(感觉递质)和脑啡肽(镇痛神经调节剂)尤为显著(Dickenson，1995，英国麻醉杂志，75，193-200)。下文将显示，在体内，Sialorphin可以强效地阻断大鼠脊髓组织引起的P物质和脑啡肽的细胞外分解代谢。
脑啡肽在调节伤害信息中的重要性已被前体脑啡肽原(pre-proenkephalin)基因缺失小鼠所证实，该模型表现出伤害域值的明显降低(Konig等，自然，1996，383，535-8)。相反，使用膜结合锌金属肽酶的抑制剂NEP和APN，两者均参与脑啡肽的快速失活，导致强效的镇痛反应(Chen等，1998，美国科学院院报，95，12028-33)。
为深入了解Sialorphin在体内可能具有的、通过抑制脑啡肽降解酶产生的抗伤害特性，使用大鼠疼痛模型，即针刺痛觉测验(Hebert等，1999，生理学和行为，67，99-105)，来评价此效应，其中对各种痛觉反应的行为学参数进行了3分钟的记录。
使用雄性大鼠(350-400g，Charles Rivers)进行针刺痛觉测验来研究Sialorphin在体内的活性。实验设施为一空场(45×45×40cm)，将其分为9块(150×150mm)，其中8个位于外周，1个在中央。外周区域覆盖了不锈钢针(2/cm2，长度8mm，直径0.6mm)。测验包括将大鼠置于该空场的中央区域，并记录其各种行为(截至时间为3分钟)。针刺测验前2天，大鼠在无针的实验设施中适应环境达20分钟，以减少新空间恐怖症引起的应激。使用Statview5统计软件包进行统计分析。
如图6A所示，与载体对照组相比，静脉施用Sialorphin处理的大鼠发出较少的叫声，并在外周针刺区域表现出运动和探索的活动。例如，100μg/kg体重的Sialorphin产生了明显的镇痛反应，如其显著增加了在3分钟内的穿过外周区域的频率11.13±1.43，n＝8，vs对照2.88±0.44，n＝8，p＜0.001(ANOVA和非配对t检验)，以及在外周区域站起3.88±0.83vs 0.75±0.41，p＜0.005。同时，其显著减少了疼痛刺激引起的可听到的叫声(0.25±0.16vs 7.25±3.13，p＜0.05)和逃避(0.13±0.13vs 6.88±2.47，p＜0.05)反应。
因此，Sialorphin处理的大鼠表现出高水平的吗啡样镇痛作用，即在大鼠的针刺测验中，静脉施用100μg/kg，产生74-97％的镇痛作用。
此外，在第二次测验中，Sialorphin对有害反应的行为学参数的影响，如图-6B所示，被预先皮下注射施用0.3mg/kg体重的纳络酮(一种μ-阿片受体拮抗剂)逆转了42-63％(纳络酮逆转的发声参数为20％)。此外，如图-6C所示，Sialorphin处理的大鼠留在无针覆盖的中央区域的时间较对照显著减少(57.75±21.30秒vs 155.13±14.21秒，p＝0.0019)，且此行为可被纳络酮逆转56％(112.38±17.44秒)。这说明Sialorphin诱导的完全的药理学镇痛作用是需要μ-阿片受体的，因此这支持内源性阿片能介导的Sialorphin诱导的镇痛作用(Besse等，1990，Brain Research，521，15-22；Matthes等，1996，自然，383，819-23；Sora等，1997，美国科学院院报，94，1544-9)。因此，Sialorphin可能通过增强内源性μ-阿片依赖的途径而产生其镇痛作用，并引起脊髓和大脑的抗伤害过程。
实施例5研究不悦灯光刺激回避测验中QHNPR肽的作用1.材料和方法1.1.动物使用24只雄性SPF Wistar/AF大鼠，体重在300-320g。到达后，将大鼠称重、标记、分组，每组3只，置于F-型聚碳酸酯笼中。这些大鼠被安置在有空调的动物房中，温度为22-24℃，可随意获得食物和水，光照和黑暗每12小时交替(光照自8am-8pm)。
一周的环境适应期后，称量大鼠的体重并随机分成2个实验组(n＝12)，各组的处理方式和条件均相同。
1.2.材料不悦灯光刺激回避驯化(ALSAT)的设施实验设施包括一个独立的笼子(50×40×37cm)，光照明亮，并包含两个控制杆一个为起作用的，使得当操作该杆时，可产生30秒的黑暗，继而灯光再次点亮，而另一个杆是不起作用的(不主动增强)。在黑暗阶段时按下起作用的杆不会使黑暗阶段更加延长。将大鼠置于笼中20分钟，记录实验过程中每个杆被按下的次数。
实验器具，包括4个驯化设施，均为完全自动化的并由计算机控制。因此，在测验中房间内无实验者。
1.3.实验过程本模型利用大鼠对光照明亮环境的不悦情绪。在环境适应阶段和学习阶段，大鼠通过操控驯化学会控制测验设施的不悦的光照环境动物学会按下起作用的杆以获得黑暗的时间。
学习测验由两个阶段构成-阶段1，适应实验设施(第一天)；-阶段2，学习测验(第二天)。
记录变量-起作用的杆被按下的次数；-不起作用的杆被按下的次数。
1.4.产品产品
1.5.施用产品将QHNPR肽按500μg/5ml 0.01N醋酸的比例配制，以PBS稀释以便按50μg/kg的剂量静脉施用，在测验前1分钟通过大鼠背部尾静脉施用。
产品施用方案
1.6.统计分析使用双侧概率非配对t检验来比较两组大鼠的杆按压活动。
为评价两个杆之间的差别，使用使用双侧概率配对t检验来比较各组内起作用的杆的按下次数和不起作用的杆的按下次数。
结果以平均值±平均值标准误(SEM)表示。
2.结果2.1.在测验阶段中两个杆被按下的总次数在两个测验阶段，经QHNPR肽处理的大鼠在不悦灯光刺激回避测验中明显不及对照组大鼠活跃。
在测验阶段中两个杆被按下的总次数
2.2.杆间差别在两个测验阶段中，对照组的大鼠按下起作用的杆(AL)的次数明显多于按下不起作用的杆(IL)的次数。
但经QHNPR肽处理的大鼠与此不同，两个杆之间没有差别。
在测验阶段中杆之间的差别(平均值±SEM)
AL起作用的杆；IL不起作用的杆。
3.结论在这些实验条件下，在两个实验阶段中，经QHNPR肽处理的大鼠在不悦灯光刺激回避测验中明显不及对照组大鼠活跃。此外，由于它们不能分辨两个杆，因此表现得不会学习。这或是由于它们对有害的光照刺激较不敏感，或是由于它们对实验性光照环境的应激更加敏感。鉴于已经直接观察到这些大鼠在测验中具有令人满意的活动和探索活动，因此对其行为的解释是它们对不悦刺激比较不敏感。而对照组大鼠在第一和第二阶段中，在对杆的操控和在两个杆之间进行辨别方面，显示出令人满意的活动。
序列表<110>巴斯德研究院<120>SMR1肽的新的治疗用途<130>BET 00/1229<140><141><160>8<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>5<212>PRT<213>黑鼠<400>1Xaa His Asn Pro Arg15<210>2<211>5<212>PRT<213>黑鼠<400>2Gln His Asn Pro Arg1 5<210>3<211>6<212>PRT<213>褐鼠<400>3Arg Gln His Asn Pro Arg1 5<210>4<211>11<212>PRT<213>褐鼠<400>4Val Arg Gly Pro Arg Arg Gln His Asn Pro Arg1 5 10<210>5<211>5<212>PRT<213>黑鼠<400>5Gln His Asn Leu Arg1 5<210>6<211>6<212>PRT<213>黑鼠<400>6Arg Gln His Asn Leu Arg1 5<210>7<211>6<212>PRT<213>小鼠<400>7Gly Gln His Gly Pro Arg1 5<210>8<211>6<212>PRT<213>小鼠<400>8Gly Gln His Asp Pro Thr1 权利要求
1.SMR1-肽或药用有效量的所述的SMR1-肽在制备用于预防或治疗需要调节哺乳动物、特别是人的膜金属肽酶、特别是膜锌金属肽酶的活性的疾病的治疗组合物中的治疗用途。
2.权利要求1的用途，其中所述的金属肽酶是膜锌金属肽酶。
3.权利要求2的用途，用于预防或治疗需要调节哺乳动物、特别是人的NEP诱导的NEP敏感性肽的降解的疾病。
4.权利要求3的用途，其中所述的SMR1-肽通过抑制NEP而起作用。
5.权利要求1-4中任一项的用途，其中所述的SMR1-肽通过抑制脑啡肽降解而起作用。
6.权利要求1-5中任一项的用途，其中所述的SMR1-肽作为抗伤害剂而起作用。
7.权利要求1-6中任一项的用途，其中所述的SMR1-肽作为镇痛剂而起作用。
8.权利要求1-6中任一项的用途，其中所述的SMR1-肽作为控制慢性炎症性疼痛的制剂而起作用。
9.权利要求8的用途，其中所述的SMR1-肽作为控制慢性炎症性疼痛的制剂而起作用，所述的慢性炎症例如为关节炎或炎症性肠病。
10.权利要求1-6中任一项的用途，其中所述的SMR1-肽作为抗腹泻剂而起作用。
11.权利要求3的用途，其中所述的SMR1-肽通过抑制内源性AII形成以及P物质、BK和ANP失活而起作用。
12.权利要求1-6或11中任一项的用途，其中所述的SMR1-肽作为抗高血压剂而起作用。
13.权利要求1-6或11中任一项的用途，其中所述的SMR1-肽作为利尿钠剂而起作用。
14.权利要求1-6或11中任一项的用途，其中所述的SMR1-肽作为利尿剂而起作用。
15.权利要求1的用途，用于预防或治疗动脉硬化。
16.权利要求1的用途，用于预防或治疗恶性细胞增殖和/或播散的过程。
17.权利要求1的用途，作为抗感染剂用于治疗感染例如细菌性或病毒性感染。
18.权利要求1的用途，用于控制免疫炎症性反应。
19.权利要求1的用途，其中所述的SMR1-肽作为治疗药物滥用的替代物而起作用。
20.权利要求1-19中任一项的用途，其中所述的治疗组合物包含通式(1)的SMR1-肽(1)X1QHX2X3X4其中X1提供一个氢原子或X1代表选自如下的一个氨基酸链X1＝R或G，X1＝RR，或X1＝PRR，或X1＝GPRR，或X1＝RGPRR，或X1＝VRGPRR，X2提供N，G或D，X3提供P或L，以及X4提供R或T。
21.权利要求1-19中任一项的用途，其中所述的SMR1-肽是SMR1蛋白的生物活性衍生物。
22.权利要求20或21的用途，其中所述的SMR1-肽或其生物活性衍生物包含一或多个D-型氨基酸。
23.权利要求20或21的用途，其中所述的SMR1-肽或其生物活性衍生物肽进一步包含一取代或修饰或添加的基团，所述的基团可提高所述的肽或其生物活性衍生物的生物利用度或提高其对酶性降解的抗性。
24.筛选特异性结合到QHNPR五肽的NEP结合位点的配体分子的方法，其包含下列步骤a)制备含有QHNPR五肽的NEP结合位点的细胞培养物或器官标本或组织样品；b)加入待测定的候选分子与半饱和浓度的标记的五肽竞争；c)将步骤a)的所述的细胞培养物、器官标本或组织样品与所述的标记的候选分子在利于特异性结合发生的条件下孵育足够的时间；d)定量分析在存在不同浓度的所述的候选分子的情况下，特异性结合到所述的细胞培养物、器官标本或组织样品的标记物。
25.测定特异性结合到QHNPR五肽的NEP结合位点的配体分子的相对亲和力的方法，其包含对每个候选分子进行权利要求24的方法的步骤a)、b)、c)和d)，并进一步包含将在步骤d)中定量的每个候选分子的亲和力与其他的候选分子进行比较的步骤e)。
26.测定特异性结合到QHNPR五肽的NEP结合位点的配体分子的亲和力的方法，其包含下列步骤a)制备含有QHNPR五肽的NEP结合位点的细胞培养物或器官标本或组织样品；b)加入预先用放射性或非放射性标记物标记的候选分子；c)将步骤a)的所述的细胞培养物、器官标本或组织样品与所述的标记的候选分子在利于特异性结合发生的条件下孵育足够的时间；d)定量分析在存在不同浓度的标记的候选分子的情况下，特异性结合到所述的细胞培养物、器官标本或组织样品的标记物。
27.筛选对QHNPR五肽的NEP结合位点具有激动剂生物活性的配体分子的方法，其包含下列步骤a)制备含有QHNPR五肽的NEP结合位点的细胞培养物或器官标本或组织样品；b)在存在候选分子、半饱和浓度的QHNPR和NEP底物的情况下，孵育其浓度可满足在初始速率测定的条件下对NEP的酶活性进行测定的步骤a)的所述细胞培养物或器官标本或组织样品，孵育的时间足以使得NEP底物在初始速率条件下发生水解；c)分别在有或没有所述的候选配体分子以及有或没有QHNPR的情况下，通过测定NEP底物水解的程度对步骤a)的生物物质中的NEP的活性进行定量分析。
28.筛选对QHNPR五肽的NEP结合位点具有拮抗剂生物活性的配体分子的方法，其包含下列步骤a)制备含有QHNPR五肽的NEP结合位点的细胞培养物或器官标本或组织样品；b)在存在次最大浓度的XQHNPR肽、特别是QHNPR肽以及NEP底物的情况下，在存在候选分子的情况下，孵育其浓度可满足在初始速率的条件下对NEP的酶活性进行测定的步骤a)的所述细胞培养物或器官标本或组织样品，孵育的时间足以使得NEP底物在初始速率条件下发生水解；c)分别在有或没有所述的候选配体分子以及有或没有QHNPR的情况下，通过测定NEP底物水解的程度对步骤a)的生物物质中的NEP的水解活性进行定量分析。
29.SMR1蛋白的成熟产物和SMR1蛋白或其成熟产物的生物活性衍生物，其可根据权利要求24-28中任一项的方法而得到，条件是所述的生物活性衍生物不具有权利要求20的通式(1)的结构。
30.一种分子复合物，其包含-NEP受体或所述的NEP受体的SMR1的结合位点；-一种SMR1-肽。
31.SMR1-肽的生物活性衍生物，其特征为能够提高或降低金属肽酶的活性或阻断SMR1-肽与所述的金属肽酶之间的正常的相互作用。
32.权利要求31的生物活性衍生物，其特征为所述的金属肽酶是膜锌金属肽酶。
33.权利要求32的生物活性衍生物，其特征为所述的膜锌金属肽酶是NEP。
34.权利要求1-23中任一项的用途，其中所述的SMR1-肽与一种第二药物制剂联合应用，所述的第二药物制剂可与所述的SMR1-肽协同作用。
35.SMR1蛋白的生物活性衍生物在调节内源性SMR1蛋白或肽与膜金属肽酶之间的相互作用中的用途。
36.调节内源性SMR1蛋白或肽与膜金属肽酶之间的相互作用的制剂在制备用于预防或治疗需要调节所述的膜金属肽酶的活性的疾病的治疗组合物中的用途。
全文摘要
本发明涉及SMR1－肽或药用有效量的所述的SMR1－肽在制备用于预防或治疗需要调节哺乳动物、特别是人的膜金属肽酶、特别是膜锌金属肽酶的活性的疾病的治疗组合物中的治疗用途。
文档编号A61P9/10GK1482917SQ01821264
公开日2004年3月17日 申请日期2001年12月24日 优先权日2000年12月22日
发明者卡特林·鲁若, 卡特林 鲁若, 弗朗索瓦·鲁容, 瓦 鲁容 申请人:巴斯德研究院, 国立科学研究中心