专利名称：分离和鉴别在含有核酸的生物样品中可能存在的各种功能的方法
技术领域：
本发明的目的在于提供一种方法，所述方法使得能够分离含有核酸的生物样品中可能存在的各种功能，并且在对DNA片段进行转录和翻译后，通过体外蛋白质表达而鉴定所述功能。按照本发明方法，对功能的鉴定可通过生物化学分析的方法来确定，以及任选地也可通过克隆的方法或通过对多核苷酸序列进行测序的方法来确定。
因此，本发明的方法尤其可对具有确定的或可以确定的功能的基因或其编码蛋白质进行鉴定和分离。
对新基因和/或其编码的蛋白质的研究是众多分子生物学实验室的主要目标。事实上，基因疗法和细胞疗法或通过转基因的方法来创建新的动物和植物，对于人类和动物的健康、诊断和饲养而言，这些方法已经燃起了新的希望，但这些方法特别需要对众多的基因和/或蛋白质的活性进行逐一辩认。因此，存在有众多的通过克隆和蛋白质表达而分离和筛选基因的技术。
在这些技术中，其中有一项技术称之为“基因组”(genomics)技术，这项技术的关键在于对某一生物体的基因组组进行部分或全部测序，然后搜索与潜在编码序列的数据库中的已鉴别序列的同源性。这些序列一旦得到确认，它们就可以进行亚克隆并表达，以便检查这些序列是否编码所研究的性质。除了实施过程需要时间外，这项技术还表现出某些缺陷，它只能分辨出一些与数据库中已知的和参考的功能同源的功能。
对于研究感兴趣的各种性质，蛋白质组(proteomics)技术是第二种可以采取的方法。这项技术的关键在于从微生物中提取表达的蛋白质，然后对这些蛋白质进行提纯。此时，提纯的每个部分都要进行试验以便检测哪一部分含有需要的性质。这一技术的主要缺陷在于如下的事实它无法获得所检测性质和表达这一性质的基因之间的直接联系。这一技术的第二个缺陷是，它不可能检测到在起始微生物中尚未被诱导出的性质。
检测某一微生物表达的功能的第三项技术的关键在于使用表达克隆方法。这一方法的原理就是从起始微生物中提取DNA，将DNA片段化，并且把它插入到体内表达载体中，这个表达载体转化进宿主。选择宿主的表达起始微生物的基因的能力。用同样的方法，选择的载体总是与宿主相容的。表达克隆这一技术可以用在搜索对某一微生物的某一功能，这种微生物与现有宿主中一个具有相近的遗传性质(相同的密码子利用，相同的GC百分比)。从大量的遗传来源各异的微生物着手对某一功能进行搜索的情况下，表达克隆方式不适用，因为宿主已不再能够表达被提供给它们的那些异源基因。
此外，与其他分离和筛选基因的现有技术方法一样，表达克隆方法也有许多的缺陷--转录和翻译产物的细胞毒性，为暂时对付这些毒性的问题，它们可能会引起基因重组；--所使用的数据库的代表性较差；--实施的时间；--在克隆的基因序列和使用的表达载体之间相容性较差；--表达水平变化巨大；--密码子的使用问题；--重折叠以及翻译后修饰的问题；--当直接在原始的细胞提取物中寻找蛋白质的活性时，由于细胞的生理状况对蛋白质表达水平会产生影响，因而这将会带来一些问题；--自动化难度大。
本发明的目的旨在准确无误地克服这些缺陷，同时提供一种快速和有效地鉴别与含有核酸的生物样品中所含的多核苷酸序列相关的功能的方法，本发明同样也可分离出上面所说的这种序列。
这一目的通过分离和鉴定一含有核酸的生物样品中可能存在的各种功能的方法而实现，所述方法特征在于包含如下的步骤(a)从所说的生物样品开始制备核酸片段；(b)将每个所说的片段与载体分子进行结合；(c)分离步骤(b)的与载体分子相结合的每个片段，或由片段与载体分子的结合组成的每一结构的一部分；(d)对步骤(c)中与载体分子相结合的每个片段，或由片段与载体分子的结合组成的每一结构的一部分在体外进行处理，以获得转录物；(e)测试在步骤(d)获得的转录物的功能，或在转录物的翻译后测试所编码的蛋白质的功能。
本发明的方法可提供如下的益处--当步骤(d)的转录物具有tRNA，核酶类型的有益的性质时，可对步骤(d)转录物的各种性质进行测试。
--对由所述转录物编码的蛋白质的性质进行测试。
当测试步骤(d)获得的转录物所编码的蛋白质的功能时，本发明的方法包括在步骤(d)利用一细胞提取物对所述转录物进行体外处理，将其翻译成蛋白质，然后利用任何适宜的方法对所述蛋白质的功能进行检测。
本发明中所述的功能更具体地是可被多核苷酸序列编码的性质。例如，如果所述序列编码蛋白质，则这种性质可以是酶活性或者亲和性，或者如果所述序列编码催化mRNA，则例如是内切核酸酶的活性。
因此，本发明的方法不仅可以检测功能，而且还可以从生物化学方面鉴定这一功能。例如，如果这种功能是酶活性，那么就可以对有功能的最佳条件(PH值、温度、盐的浓度)，动力学的参数(Vm、Rm)以及抑制参数(Ki)进行分析。如果功能是亲和性，那么可以确定Kd，或确定对这种蛋白质最有亲和力的分子。还可以确定翻译的蛋白质的大小或经mRNA转录物的大小，以及任选地测序相应基因。
生物样品是指任何可能含有核酸的样品，如土壤样品，植物样品，血液样品(人类的血液或动物的血液)，水样品，微生物、细胞或病毒培养物样品，生物活检样品等，但这些样品也包括扩增产物(PCR、NASBA等)、基因组的DNA、合成的DNA、mRNA，或得自本领域技术人员常用处理的任何核酸产物。
载体分子是指一个或多个多核苷酸序列，其包含用于步骤(d)至少的转录启动子，以及也有可能包含一种促进步骤(c)的片段分离的物质。任选地，这种物质可以是一个或多个分子的链亲和素或生物素，或者polypyrol基团，或者抗体；这种物质也可以是单链或双链多核苷酸序列，优选地不含使相连片段体内表达的DNA质粒载体，或使步骤(c)的片段得以分离的任何其他化合物。
本发明方法的步骤(c)的分离是指在步骤(b)获得的片段混合物可以再分为亚集合，每个亚集合可由一个或几个核酸片段组成。
如果从生物样品中无法直接获得核酸的话，例如，核酸包含在细胞、病毒、血液、有机组织等中，那么本发明方法中核酸片段的制备步骤(a)可以包含一个提取步骤。这一提取步骤此时应包含在步骤(a)对核酸片段的制备过程中。同样，当生物样品的组成为mRNA时，那么对于制备步骤(a)的核酸片段来说，RT-PCR这一步骤是必不可少的。
根据本发明的特别优选的实施方案，载体分子由两个多核苷酸序列组成，这两个多核苷酸序列中的每个序列包含至少一个转录的启动子。这些序列中的每个序列均与步骤(a)获得的片段的末端相连。根据本发明的特别优选的实施方案，由载体分子携带的转录启动子可以是强型的启动子，如T7RNA聚合酶、SP6,Qβ或λ噬菌体的转录启动子。
因此，本发明方法的一特定用途使得能够从含有核酸的样品中鉴别具有某一功能的多核苷酸序列和/或相应的蛋白质。这一目标通过如下的方法达到，所述方法包含以下的各个步骤(a)从所说的生物样品开始制备核酸片段；(b)将每个所说的片段插入载体中以产生重组载体；(c)通过任何合适的方式分离每个重组载体，或这一重组载体的一部分；(d)对步骤c)中分离的载体或重组载体的一部分在体外进行处理，以获得转录物；(e)测试在步骤(d)获得的转录物的功能，或在转录物的翻译后用任何合适的方式测试所编码的蛋白质的功能。
在本发明方法中，重组载体是指一种其中已导入一片段的载体，如质粒载体。这种载体的一部分是指重组载体的包含步骤(a)获得的片段以及实施步骤(d)和任选地步骤(e)时所需的成分的部分。
本发明方法的各个步骤可由同一个操作人员连续不间断地优选在一个自动化的装置上很方便地完成，这个自动化的装置涵盖上述步骤中的每一步骤；或者，也可采取间断的方式来进行操作，如需要的话也可由不同的人员进行操作。
片段的转录步骤(d)和步骤(e)的翻译步骤同样也可在称为体外蛋白质表达反应或EPIV反应中联合进行。EPIV反应可以同时进行，这意味着步骤(e)的翻译步骤可与步骤(d)的转录过程同时进行，或分成两个不同的步骤，一个是转录步骤，另一个是翻译步骤。
步骤(d)和步骤(e)的非偶联可使得每个步骤的产率最佳化，由此生成较多数量的蛋白质，在低比活酶的情况下，这一点将显著有用。
同样，这样的非偶联可使得校正步骤(e)所生成的产物，以及可使得在以后对表达出的不同的功能进行比较。
如果是经PCR制备的话，那么转录步骤(d)和翻译步骤(e)的分开进行也同样可避免DNA模板被核酸酶降解的问题。事实上，转录反应的所有成分较少受到核酸酶的污染，这正好与翻译提取物相反。
此外，根据目标DNA的不同来源，转录步骤(d)和翻译步骤(e)的分开进行也使得能够利用不同的翻译提取物。事实上，有利的是利用与本发明方法所用的生物样品同一来源或接近来源的翻译提取物进行步骤(d)获得的转录物的步骤(e)的翻译。因此，转录物翻译信号的来源和细胞提取物的来源之间的相关性被优化以得到最佳翻译效率。例如，可以引述的是使用嗜极菌的翻译提取物筛选同一生物体或另一嗜极菌(嗜热菌、嗜盐菌、嗜酸菌等等)的DNA文库；或者使用真核细胞翻译提取物对真核细胞的DNA文库进行筛选。这些相应的提取物分别可以改善这种方法的效率。选择这些提取物是因为其在步骤(e)翻译转录物的能力。
本发明方法引人注意的地方就在于在步骤(d)转录物的表达的断点和使用的翻译提取物之间，人们可以获得一种最佳的适应。同样，这些提取物的特征还在于，要么它们不含有人们需求和研究的性质；要么它们含有这一性质，但在检测所需求和研究的功能的测试条件下，这一性质无法得到检测。例如，使用含有中温菌β-半乳糖苷酶活性的翻译提取物可允许嗜热菌β-半乳糖苷酶mRNA的翻译并在高温条件下检测后者的活性，这样就可去除中温菌β-半乳糖苷酶的活性。
步骤(a)获得的片段，根据它们不同的基因来源(即革兰氏阳性或革兰氏阴性微生物的DNA，真核DNA、病毒DNA等)，以及所检测的功能，可使用不同的翻译提取物。
本发明方法的一种特定的实施方案中，其关键就在于在步骤(e)使用一种翻译提取物，这种提取物实际上是许多翻译提取物的混合物。例如，可将过表达侣伴蛋白A的大肠杆菌的翻译提取物与过量表达侣伴蛋白B的大肠杆菌的翻译提取物进行混和。所有的混和类型均包括在内，只要它与上面描述的性质相一致。用同样的方法，也可以使用如下这种翻译提取物这个提取物加有一个或多个密码子的一个或多个特异tRNAs。这样获得的翻译提取物此时就可以翻译含有特异密码子的mRNA，例如，翻译一个含有琥珀密码子的mRNA时，在翻译提取物中添加一个或多个tRNA抑制物。
用翻译提取物对步骤(e)的处理也可用通用的某一翻译提取物来实现，而不管生物样品的来源，例如，它可以是大肠杆菌和/或任何其它细胞提取物，其中补加或未补加感兴趣的分子，例如，上面提到的一些分子(tRNA，侣伴蛋白等等)。
同样，在步骤(e)的翻译提取物中也可添加一种或多种物质，这样有利于表达的蛋白质更为有效重折叠或有利于这些蛋白质更为有效的成熟，这样的物质如侣伴蛋白、去污剂、硫代甜菜碱、膜提取物等。
可利用各种各样适宜的方法对步骤(e)合成的蛋白质的功能进行测试，这种测试例如可以检测所研究的酶的一种或几种活性。当从来自一种或多种嗜极菌的DNA的样品开始搜索具有原始性质的酶时，这一实施方案更特别适用，例如在高温下、在酸性的环境中以及在盐度很浓的环境中有活性的热稳定的酶。嗜极菌酶经常在接近产生它们的菌株的生理条件(温度、盐浓度、PH值等等)的条件下才有活性，这样的嗜极菌酶对于众多的工业生产过程(农商业、动物营养业、造纸业、洗涤业、纺织业等)来说都是一些十分有用的工具，在这些众多的生产过程中，这些酶可替代它们的中温同系物。
本发明的方法可提供如下的益处--当步骤(d)的转录物具有tRNA，核酶类型的有益的性质时，可对步骤(d)转录物的各种性质进行测试，或--对由所述转录物编码的蛋白质的性质进行测试。
举例来说，在具有核酸内切酶活性的核酶情况下，可使用具有一端有荧光团和另一端有“猝灭”基团的核苷酸基质检测这一活性。在这一基质被核酶切割时，荧光团将会与“猝灭”基团分开，这样就会首次释放出荧光。
在tRNA情况下，可以使用例如可能含有这种tRNA的反应部分，并将这部分放置在一个体外翻译反应中，这一翻译反应含有一报道基因的mRNA，这些报道基因密码子中的一个密码子只有通过所寻找的tRNA才能阅读。如果检测到报道基因的活性，这就说明，在初始的部分里含有该tRNA，以及可以对报道基因的mRNA在体外进行翻译。
在证实了某种酶活性的情况下，专业人员可以考虑使用各种类型的特异底物以在步骤(e)证实所寻找的功能是否存在。所寻找的一或几种功能对底物的所有转化可利用熟知的方式(荧光测定法、比色测定法、吸收值、粘度等)检测。
在证实了亲和性的情况下，根据所寻找的亲和性抗体-抗原，双链DNA结合蛋白，受体-配体等，可例如应用如下测试如放射标记配体的固定，包含固定化抗原的免疫学检测，其用寻找的抗体特异检测，这一寻找的抗体的揭示是通过与可揭示的报道活性偶联的抗抗体的抗体，或者使用山羊抗体的抗原检测，山羊抗体固定在一个能够识别抗原的支持物上，利用兔第二抗体(形成夹心结构)便可检测到这一抗原，而兔抗体间接地或根本不与报道活性(碱性磷酸酶型或过氧化物酶型)联结在一起。
本发明的一特定实施方案步骤(e)由平行测试或者同时或不同时测试单个功能或多个功能的不同性质组成。
因此，本发明方法的引人注意之处就在于它不仅可以检测可能包含在一生物样品中的那些功能，而且--当这些性质作为例如酶活性或亲和性的性质时，可对它们进行定量分析，--可鉴定尤其是生物化学鉴定如发挥功能的最佳条件温度、PH值、盐的浓度等，分子量，蛋白质测序，和任选地测序相应的多核苷酸序列。
本发明方法引人注意之处还在于，它完全独立于体内蛋白质的表达。细胞宿主，如微生物，如果使用这些宿主，那么只有对异源片段进行分离和扩增时，它们才成为宿主。因此，本发明的方法可以避免现有技术的表达克隆方法所提及的各种问题。本发明方法尤其令人感兴趣的是鉴定表达细胞毒素蛋白的基因。从这一意义上说，与步骤(b)的每个片段相联的载体分子可以是一个质粒载体，它优选地不能在体内表达所说片段。这种载体的例子为pBR322或pACYC184。
有利地，本发明的方法在步骤(a)制备的片段可通过一个或多个核酸内切酶作用在生物样品的核酸上或所说核酸的PCR产物上而获得。同样，也可通过机械作用这些核酸获得这些片段，例如，通过注射器针头，在压力下的破碎，超声波处理等。
在本发明方法的一特定实施方案中，其中生物样品中的核酸不需片段化如基因组文库，步骤(a)的制备用于步骤(b)的片段包括利用如提取和/或纯化和/或末端的制备以便与载体分子相联，比如说插入到质粒载体中。
在本发明方法的一特定实施方案中，当生物样品来自某一原核生物体时，步骤(a)制备的那些片段，其大小为1至几十kb，优选的是1～40kb，有利的是这些片段的大小在1～10kb之间。优选地，步骤(a)制备的那些片段的大小为5kb。事实上，原核生物基因的平均大小约为1000个碱基对。通过使用5000个碱基对的片段，可以获得一些克隆，这些克隆携带具有合适核糖体结合位点的完整的基因。当DNA来源于某一真核细胞时，步骤(a)制备的那些片段的大小更重要，较为有益的是，这些大小最好在几十至几百个kb之间。
要注意的是，步骤(a)制备的那些片段可带有部分或完整的操纵子。
制备步骤(a)的片段的生物样品可以来自一个或多个相同或不同的原核生物或真核细胞，甚至病毒。例如，它可以是一个微生物或微生物混合物的核酸样品，或者是真核组织细胞核酸样品，或相同的或不同生物体的核酸样品。但是，核酸的样品同样也可由一核酸序列或由核酸文库组成。生物样品的组成也可是生物体和/或已知或未知的或核酸。从理想的角度而言，这一样品的组成最好是合成核酸。
在使用真核细胞DNA文库的情形下，转录反应可应用例如核提取物(3)由mRNA在体外剪接和成熟的反应来完成。
本发明的方法确保在步骤(e)证实的功能和相应的多核苷酸效率之间有直接的联系。因而，这一方法尤其适用于从基因组的DNA开始检测功能和鉴别相应的基因。基因是指具有生物学功能的DNA片段或序列。
正如上面所指出的那样，根据本发明方法的一特定实施方案，在步骤(b)与制备的核酸片段结合在一起的载体分子是一个质粒载体。在这种情形下，在本发明方法的步骤(b)中，每个片段都在克隆位点或限制盒水平插入到一个载体中。质粒载体的特点是，其在克隆位点的一侧包含RNA聚合酶启动子，并任选地在另一侧包含RNA聚合酶终止子。同样，也可设计这样的一个载体，它含有一个克隆位点，这个位点周围环绕的是两个相同或相异的RNA聚合酶启动子并且可在两侧具有相应的一个或多个RNA聚合酶终止子。这些启动子，和可能的终止子优选在可用于在步骤(c)分离重组载体的微生物中不能发挥功能。
在载体中没有RNA聚合酶启动子和/或任选的终止子的情况下，或者在RNA聚合酶启动子和可能的终止子不适合实现步骤(d)的情况下，这些启动子和可能的终止子可采取任何相应的措施在本发明方法的步骤(c)插入。本发明方法的一有利的实施方案，是用携带启动子和终止子序列的一套引物进行PCR。
根据本发明方法的一特定实施方案，启动子和可能的终止子都是强型的，如T7RNA聚合酶的启动子和终止子。
在载体分子是一个质粒载体的情况下，步骤(c)中重组载体的分离可通过用在步骤(b)获得的所有重组载体转化宿主细胞来完成，从而建立一个克隆文库，然后采用任何适宜的方法提取文库的每个克隆包含的重组载体或载体的一部分。
重组载体的提取或两侧是相应的一个或多个RNA聚合酶启动子和可能的终止子的重组载体的一部分的提取，可采用本领域熟知的方法来完成，例如，用质粒微量制备和可能的消化，或用PCR来实现。一种有利的方法是用经硫代磷酸酯基团保护免受5′核酸酶攻击尤其是包含在翻译介质中的核酸酶的攻击的寡核苷酸来进行这一PCR。
正如上述所指出的那样，步骤(c)的分离可通过任何物理的、机械的或化学的方法实现，如对在步骤(b)与载体分子相联的所有片段的简单极限稀释。但是，可以采取其它的方法进行更为有效的分离，即利用包含在载体分子中的特殊物质的性质进行分离，如抗体分子，如此可使用抗体-抗原的亲和性来对片段进行分离，或生物素，如此可利用生物素-链亲和素来实现分离，等等。
按照本发明方法的一特定实施方案，可实现对在步骤(c)获得的与载体分子相结合的片段或其一部分的挑选。为此，对于在步骤(c)获得的与载体分子相联结合的每个片段或其一部分可进行EPIV反应，即在步骤(e)翻译过程的反应混和物中掺入蛋白质合成的标记(生物素化tRNA、修饰的氨基酸等)。然后例如用ELISA分析每-EPIV反应的产物是否存在已得到表达的蛋白质。确定EPIV反应呈阴性的与载体分子结合的那些片段或其一部分。这些片段在它们插入物中不具有ORF。在完成预先筛选这一工作程序后，去除这些片段，随后进行与蛋白质相关的活性鉴定筛选。这样的一个预筛选的方法，在多次重复筛选以及同一个文库不进行同时筛选的情形下，可以节省时间和试剂。
按照一特定实施方案，本发明方法完全能在一个固相芯片型支持物、膜或纳滴定板上实现。芯片型支持物可以是一块玻璃板，一张硝酸纤维素膜或本领域已知的任何其它支持物。在这种芯片型或纳滴定板支持物上，与载体分子相结合的片段将得到分离，同时，可以实施本发明方法的试剂被沉积在这一支持物上。对所寻找的一个或多个功能的测试可直接在支持物上进行，如果需要的话，应该先对这个支持物进行清洗。当载体分子为质粒载体和/或本发明的方法在一个支持物上实现时，由重组载体转化的菌落被单独转移至同一支持物上，然后原位(3)裂解，以便使每个菌落都能在支持物上释放其含有的重组载体的拷贝。另一实施方案是将每个重组载体或其一部分单独置于同一支持物上，此时，按照上面所述技术的任何一种，可将用于EPIV反应的试剂沉积在含有沉积的DNA的支持物上。对功能的测试可直接在支持物上进行，如果需要的话，应该对这个支持物先进行清洗。
此外，本发明的其它目的为--通过本发明方法进行鉴定和筛选的至今尚未了解的核酸序列；--与一个载体分子相联的含有这个核酸序列的片段；--含有这一序列的质粒载体，用这个核酸序列或这一载体转化的细胞宿主，或--这个序列编码的蛋白质。
同样，该发明还涉及任何文库，这些文库由以下部分组成--通过本发明方法分离的核酸序列；--与含有这些序列的片段相联的载体分子；--含有所说序列的载体；--用这些序列的一个(或一些)序列或这些载体之一转化的细胞宿主；--所说的序列编码的蛋白质。
本发明方法相对于现有技术提供了可以自动化操作的优点。当载体分子是质粒载体时，这种自动化形式例如可由如下的方式进行--利用Colony Picker类型的机械装置，可将步骤(b)形成的文库中的每一个重组载体在一个支持物上、一个微板孔中进行培养。
--这个培养物可用作用Biorobot 9600(QIAGEN)型机器人进行质粒提取步骤，或用作经Multiprobe型装置(PACKARD)在型号为PTC200或PTC225(自动盖-M J RESEACH)的自动热循环仪上进行的PCR扩增。
--任选的PCR产物的纯化可用Biorobot 9600自动化装置来进行。
--步骤(d)和(e)的EPIV反应可以完全由Multiprobe机器人来管理。可利用机器人的吸移管来对在步骤(d)获得的转录物的功能进行测试，可在一个相应的读数器上读取所得的结果。如果转录反应与翻译反应分开进行，那么，mRNA的任选纯化可由Biorobot9600来进行。
--在步骤(e)合成的蛋白质的活性的试验可由机器人的吸移管来完成，可在一个微板读数器(根据所做的试验可分别采用光度测定法、荧光测定法、比色测定法等)上或通过其它适宜的方法读取所得的结果。
因此，本发明同样也涉及用于实施前述方法的自动化装置，所述装置包括一个或多个支持物、机器人、自动装置和读数器的配置，这些配置任选地使得能在步骤(a)制备样品，任选地在步骤(b)中将片段与载体分子相结合，任选地在步骤(c)中分离与载体分子相结合的片段，以及实施步骤(d)和步骤(e)。这一设备在确保本发明方法或本发明的部分方法(步骤(d)和(e))重复使用时有较高的效率外，它还可以从不同的核酸生物样品开始迅速找寻某些功能。
任何具有前面已确定性质的质粒载体均可在发明的方法中使用。例如图2的载体，它以如下的方式构建--质粒复制起点；--克隆位点，这个位点周围是两个相同的启动子，如T7RNA聚合酶启动子，或其它强型RNA聚合酶启动子，如Qβ、T3、SP6等，任选地在两侧是相同RNA聚合酶的终止子。这些启动子和终止子(如果存在)优选在用于分离重组载体的微生物中不发挥功能。这样的结构可以允许转录插入到克隆位点中的DNA的片段，而不管其插入方向如何。因此找到一个好的克隆的可能性就会增加一倍。原核生物基因的平均大小约为1000个碱基对。通过使用约5000个碱基对的原核生物DNA片段生成文库，很可能获得一些克隆，这些克隆含有完整的基因以及它们合适的核糖体结合位点(或称RBS)。利用这一双启动子系统，基因最差也位于距mRNA起始的2000个碱基处，这样就可以通过本发明方法对相应的蛋白质进行有效的表达(见后面实验部分的报告的有关β-内酰胺酶的活性)。
--任选地，在终止子两侧的特异序列可用作杂交位点以进行载体携带的核酸片段的PCR扩增。
--一个由tRNA基因构成的选择基因(4)。任选地，一个抗生素抗性基因(或其它类型的选择基因)同时插入到克隆位点中。这种抗生素的选择只是运用在克隆载体的制备扩增方面。事实上，在插入步骤(b)的每一个片段时，一个DNA片段将取代这一抗性基因。这一系统呈现出这样的一种益处它不依赖于抗生素的选择，因为抗生素选择将会带来抗生素污染和降解的问题。这一系统还可以获得一个不含其它ORF只含由异源片段引入的ORF的重组载体。另一方面，它使得通过在极限培养基和含有选择抗生素的培养基上平行涂布文库的一部分可以很快地评估阴性克隆的比例。
本发明方法引人注意之处还在于，它可以在粗样品中研究核酸的功能，并鉴定它们以及识别相应核酸序列。事实上，本发明方法避免了对存在在这一样品中的每个微生物的分离。众所周知，对包含在样品中微生物的分离只能给出一些极为有限的结果，因为对存在的各种各样微生物，只有百分之几的微生物得到回收。本发明方法将会提供十分可观的时间方面的益处。因为在5～10天时间期限内筛选的生物多样性约为100％，因而本发明的方法能够获得较好的结果。而现有技术方法对存在在一个样品中的生物多样性，在几个星期，乃至几个月的时间内只能分离约5％左右。因为需更多时间来筛选这些菌株以检测蛋白质活性。本发明的方法对于研究给定种系或细胞中蛋白质活性也将大有裨益。按照本发明方法，可很容易制备和筛选基因组或cDNA文库。如果是cDNA文库，载体分子包含相应于步骤(e)使用的翻译提取物的翻译的起始序列。本发明方法除了速度快以外，还能摆脱细胞生理学方面的问题。因而，可以检测蛋白质的活性，无需解决培养和生理状况的问题。本发明方法可从生物体的功能检测开始直接达到检测某一基因。同样，还可以在一个可能含有所说功能的生物体中来寻找该功能。由于这项技术具有快速性和有效性，它可以从来自一收集物的大量生物体中筛选出其中一个或多个功能，因而这就提高了微生物的生物多样性。本发明方法从分离的嗜极菌，或从嗜极菌的粗样开始，可用于鉴别工业感兴趣的蛋白质活性。
最后，本发明方法在基因组范围内也有益处。根据它的构想，这种方法可以鉴别出一些新的基因，而无需经过第一步的测序，因为它可以直接从检测一功能而得出相应核酸的序列。本发明方法应用到某一生物体的全部基因组DNA时，可以鉴定这个生物体的所有表型，这就引出了一个“表型组(phenomics)”的概念。本发明还涉及实施所述的本发明方法的试剂盒，该试剂盒包括-制备核酸片段所必需的手段；-至少一个载体分子；-至少一个聚合因子；-任选地，至少一个细胞翻译提取物；-测试一种或多种功能所必需的手段；-进行不同的步骤所必需的缓冲液。
这一试剂盒可包装在一个或多个不同的容器里。
本发明的其它益处及特征通过参照以下实施例和附图而明了。这些附图为
图1说明的是本发明方法的一个实施方案的例子。
图2说明的是用于根据本发明构建文库的一个克隆载体的示意图。
图3说明的是实施本发明方法的例子中所用的质粒pADH,pTEM,pET26-Tfu2,pLIP和pGFP的示意图。
图4说明的是由表达克隆法体内获得的Tfu2(Thermococcusfumicolans,Tfu)DNA聚合酶的intein2的活性，泳道1分子量标记1Kb；泳道2在没有酶情形下的反应；泳道3带有intein2的反应。
图5说明的是用中温菌翻译提取物经EPIV反应(在约400nm曝光后的荧光发射)产生的GFP的活性。试管A用水(对照)的EPIV反应；试管B用pGFP载体的EPIV反应。
图6说明的是用中温菌翻译提取物经EPIV反应产生的Tfu DNA聚合酶的intein2的活性，泳道1分子量标记1Kb；泳道2:T-(没有酶参与的反应)；泳道3空白(用EPIV提取物而无DNA的反应)；泳道4:T+(与体内产生的intein2的反应)；泳道5测试(与由EPIV(pET26-Tfu2)产生的intein2的反应)。
图7说明的是使用含有所述活性的中温菌翻译提取物对嗜热酶的活性的检测。试管A与水(对照)在37℃保温进行的EPIV反应；试管B在37℃保温的EPIV反应；试管C在离心分离后，与水(对照)在70℃保温进行的EPIV反应；试管D在离心分离后，在70℃保温的EPIV反应。Ⅰ-材料1)菌株和质粒载体pET26b+属于载体pET家族，这个家族由Studier和Moffatt(8)开发，并且由NOVAGEN公司将这一载体商业化。这一载体可在T7噬菌体启动子的控制下对一些基因进行表达。载体PINPOINTTM(PROMEGA)携带在T7噬菌体RNA聚合酶启动子控制下的cat基因(编码氯霉素乙酰基转移酶)。pHS2-22-21载体通过经逆转录PCR将由Tfu DNA聚合酶的intein2识别的切割位点引入质粒pUC19的多克隆位点而构建。pHS2-22-21载体与pUC19相应，含有intein的homing位点(43个碱基对)或插入intein基因的位点。
菌株XL1-BLUE[Tn10 proA+B+lacIqΔ(lacZ)M15/recAlendAl gyrA96(NaIr)thi hsdR17(rk-MK+)supE44 relAa 1 lac]用于质粒DNA的扩增。
2)试剂按照供应商的建议，使用下面表Ⅰ中引用的限制酶和修饰酶。
表Ⅰ
使用的缓冲液见如下表Ⅱ的说明。
表Ⅱ
Ⅱ质粒的制备和测试1)构建Tfu DNA聚合酶的intein2的基因(itfu2)(在基因库中的进入编号为Z69882)插入在载体pET26b+的NdeⅠ和SalⅠ限制位点之间，以建立图3中说明的pET26-Tfu2质粒。用同样的方式，将Thermococcus hydrothermalis的醇脱氢酶基因(adh)插入到载体pET26B+的NdeⅠ和Bam HⅠ限制位点之间，以建立pADH载体。大肠杆菌的β-内酰胺酶TEM-1基因(bla)(9),Aequorea Victoria的绿色荧光蛋白基因(gfp)(6)，以及Candida Antarctica的脂肪酶B的基因(lipB)(在基因库中的进入编号为Y14015)，分别被插入到载体pET26b+的NdeⅠ和Eco RⅠ限制位点之间，以建立图3中说明的pADH质粒、pTEM质粒、pGFP质粒和pLIP质粒。对于这四个基因中的每个基因，NdeⅠ的限制位点都与翻译起始密码子ATG相重叠。
通过几种限制分布分析验证每一构建。利用10ng每种质粒，通过热休克(2)，转化200μl XLl-BLUE chimiocompetent细胞(1)，转化的细胞涂布在含有60μg/ml的卡那霉素以及12.5μg/ml的四环素的LB固体培养基上。从这些转化的每个转化的克隆开始，利用TIP100型柱(QIAGEN)实现质粒DNA的大量制备。在异丙醇中沉淀后，每个质粒DNA样品都重悬于100μl的缓冲液T中。这些质粒DNA的浓度通过260nm分光光度测量进行评估。在TBE1％的琼脂糖凝胶沉积0.2μl这些载体检验每个质粒DNA的纯度。
2)体内表达测试--活性试验--pTEM利用10ng的pTEM质粒通过热休克方法转化200μl的BL21 DE3(pLysS)chimiocompetent细胞，转化的细胞涂布在含有60μg/ml的卡那霉素、20μg/ml的氯霉素、32μg/ml的IPTG以及100μg/ml的氨苄青霉素的LB固体培养基上。37℃保温过夜后，可在陪氏培养皿上观察到众多的菌落，这些菌落表明pTEM质粒的TEM-1基因已经表达且有功能，其赋予氨苄青霉素抗性。
--pGFP利用10ng的pGFP质粒通过热休克方法转化200μl的BL21 DE3(plysS)chimiocompetent细胞，转化的细胞涂布在含有60μg/ml的卡那霉素、20μg/ml的氯霉素以及32μg/ml的IPTG的LB固体培养基上。37℃保温过夜后，可在陪氏培养皿上观察到众多的菌落。所有的这些菌落都对紫外光激发(约为400nm)产生反应，同时发出绿色的荧光，这使得可验证pGFP质粒的gfp基因是否表达，以及是否有功能。
--pET26-Tfu2利用10ng的pET26-Tfu2质粒，通过热休克方法转化200μl的BL21 DE3(pLysS)chimiocompetent细胞，转化的细胞涂布在含有60μg/ml的卡那霉素和20μg/ml的氯霉素的LB固体培养基上。从这一转化的克隆开始的培养物用0.5mM的IPTG在OD600nm=0.5时在37℃诱导两个小时。离心分离后，细菌的沉淀物在20mM,pH值为7.5的磷酸钠缓冲液中重悬。多次利用冻融循环这一方法就可获得细胞的溶解。接着，在QFast-Flow柱上，利用NaCl梯度纯化intein2。根据如下方案对这一酶的活性进行试验将1μl具有最高纯酶浓度的洗脱组分稀释100倍。取这个稀释液1μl，与3μl的IT2缓冲液和220ng的ScaⅠ限制酶线性化的pHS2-22-21质粒一起在70℃的条件下保持15分钟，终体积为30μl。取这一消化混合物15μl，沉积在TBE 1％琼脂糖凝胶上。在迁移和用溴化乙锭染色后，将凝胶放置在紫外线下。正如图4所指明的那样，通过对凝胶的分析表明存在两个条带，它们分别有934个碱基对和1752个碱基对，这与通过intein2对载体pHS2-22-21(ScaⅠ线性化的)的切割相符。pET26-Tfu2R质粒的itfu2基因因而得到表达，它的产物，intein2具有活性。
--pADH利用10ng的pADH质粒，通过热休克方法转化200μl的BL21 DE3(pLysS)chimiocompetent细胞，转化的细胞涂布在含有60μg/ml的卡那霉素和20μg/ml的氯霉素的LB固体培养基上。从这一转化的克隆开始的培养物用1mM的IPTG在OD600nm=0.6时在37℃诱导三个小时。离心分离后，细菌的沉淀物在磷酸钠缓冲液50mM-MgCl210mM pH值8.0中重悬，细胞裂解物在1mg/ml的溶菌酶、10μg/ml的RNAse A和100μg/ml的DNAseⅠ的存在下在冰上保温30分钟而获得。提取步骤的离心上清在50℃保温30分钟，再次离心。这一最后步骤的上清用作测量活性的酶提取物。在不包含质粒的BL21 DE3(pLysS)细胞的培养物上进行相似提取，作为阴性对照。用分光光度计根据340nm处NADP还原为NADPH的反应动力学可测试出醇脱氢酶基因的活性。为此，10μl的酶提取物或对照与500μl的TADH缓冲液和490μl的水一起在50℃的条件下保持5分钟。在这些条件下，可检测到酶提取物的活性为15.6UDO/min/ml，而对照的活性为0UDO/min/ml。pADH质粒的adh基因因而是表达的，且其产物醇脱氢酶具有活性。Ⅲ-利用自中温菌株(37℃)制备的翻译提取物进行体处蛋白质表达试验(EPIV)在十分之一体积的醋酸钠3M pH6.0和两体积的无水醇存在下沉淀4μg每个载体，沉淀物用70％的乙醇进行漂洗以除掉任何痕量盐。每种沉淀的DNA重悬浮在4μl的缓冲液T中。
在终体积50μl的含有各0.1mM的20种氨基酸、20μl的“S30PREMIX”提取物以及15μl的“T7 S30 extract”(PROMEGA)的体外蛋白质表达混合物中，将这一DNA在37℃保持二个小时。“S30PREMIX”提取物和“T7 S30 extract”含有所有的在体外进行转录反应和翻译反应必需的成分，尤其是T7RNA聚合酶、CTP、UTP、GTP、ATP、tRNAs、EDTA、叶酸以及相应的盐。按照Zubay(10)所描述的方法，从内切蛋白酶ompT和离子蛋白酶缺陷的大肠杆菌B的菌株产生翻译提取物，这样可以更好地稳定体外所表达的蛋白质。
在转录-翻译的混合物中用超纯无菌水代替DNA而保温制备阴性的对照。保温2μg的PINPOINTTM质粒形成阳性对照。
EPIV反应一直保持在冰上，直到每个样品的酶活性能够得到评估为止。Ⅳ-活性测定1)中温酶a)GFP的活性图5表示的暴露在强度约为400nm的紫外线下的含有用pGFP载体进行的EPIV反应的产物的试管，以及含有对照反应的试管。只有包含pGFP质粒的EPIV反应的试管才发出一道绿色的荧光。因而，EPIV反应可以产生一种GFP蛋白质，它具有荧光活性。
B)β-内酰胺酶的活性通过用分光光度法在486nm跟踪一种生色头孢菌素nitrocephine的降解动力学评估β-内酰胺酶的活性。为此，将5μl、10μl或20μl用pTEM载体进行的EPIV反应在终体积1ml的BETA缓冲液中在37℃的条件下保持2分钟。在这些条件下，可评估出用pTEM载体进行的EPIV反应的平均活性为8.9UDO/min/ml提取物，而对照EPIV反应的活性为0.6UDO/min/ml提取物。因而，体外蛋白质表达反应可合成具有活性的β-内酰胺酶，它能够在体外降解nitrocephine。
对照载体PINPOINTTM携带在其本身启动子控制下的bla基因。然而，用这一载体进行的EPIV反应的β-内酰胺酶活性被检测为6UDO/min/ml提取物。应指出的是，加入1ng/μl的大肠杆菌RNA聚合酶的抑制剂利福平时，不会显著改变载体PINPOINTTM的β-内酰胺酶体外表达。载体PINPOINTTM的bla基因位于T7启动子下游的2133个碱基对处，这一个基因因而被有效转录和翻译。这就说明，在EPIV反应期间，位于T7启动子下游的2000个碱基对处的基因可以有效转录和翻译。
2)嗜热酶a)Intein2的活性对用载体pET26-Tfu2进行的EPIV反应进行试验，以便了解活性Intein2是否能够产生。为此，5μl EPIV反应与220ng的ScaⅠ限制酶线性化的pHS2-22-21质粒以及3μl的IT2缓冲液一起在70℃的条件下保持20分钟，终体积为30μl。对于阴性对照物的组成，用水来替代5μl的EPIV反应。阳性的对照包括1μl稀释至1/100的体外产生的纯化Intein2组分。最后，通过保温不含任何DNA的5μl EPIV反应制成特异性对照。
保温结束后，在苯酚-氯仿中进行4次提取试验，在乙醇中进行沉淀，然后用70％的乙醇进行漂洗，以便除掉盐。在10μl的缓冲液T中重溶每种沉淀，其中8μl加至TBE 1％的琼脂糖凝胶。在迁移和用溴化乙锭染色后，将凝胶放置在紫外线下以便分析限制性分布。在图6的泳道5上，出现934个碱基对和1752个碱基的条带，这与泳道4(阳性对照)的条带相同。出现这样的情况表明，通过EPIV反应确实产生了intein2，并且这个酶具有活性。此外，EPIV反应是特异的，因为在泳道3的对照上观察不到其他消化条带。
b)醇脱氢酶的活性用分光光度法，通过在340nm跟踪NADP还原成NADPH的动力学，测试醇脱氢酶活性。为此，5μl、10μl或15μl的用pADH载体或者无DNA进行的EPIV反应，与500μl的TADH缓冲液一起在终体积1ml中在50℃保温5分钟。在这些条件下，评估出用pADH载体进行的EPIV反应的平均活性为2.3UDO/min/ml提取物，用水进行的EPIV反应的对照活性为0.32UDO/min/ml提取物。因而，在EPIV反应期间产生了活性形式的Thermococcus hydrothermalis的ADH(在基因文库中的进入编号为Y14015)。
3)嗜冷酶用分光光度法，通过在572nm跟踪生色脂类(1,2-O-二月桂基-rac-甘油-3-戊二酸-9-羟基-3-异吩恶唑酮酯)的降解反应动力学，便可测试出脂肪酶的活性。为此，5μl的用pLIP载体或者无DNA进行的EPIV反应，在100μg底物存在下在反应缓冲液中在70℃保温15分钟。在这些条件下，可评估出用pLIP载体进行的EPIV反应的活性约为0.50UDO/min/ml提取物，而对照的活性为0.04UDO/min/ml提取物。因而，Candida antarctica(真核生物)脂肪酶B的活性在EPIV反应期间，以活性形式产生。Ⅴ-用含有中温活性的翻译提取物检测嗜热性质Themotoga neapolitana的β-半乳糖苷酶基因被插入一个含有T7RNA聚合酶转录启动子的载体中。可以使用这样获得的载体与含有β-半乳糖苷酶活性的大肠杆菌菌株的翻译提取物进行EPIV反应。同时，也进行一项没有DNA的EPIV反应试验。将每个EPIV反应的一部分在磷酸钠(50mM,PH值为7)的缓冲液中在Xgal存在下于37℃保温，这两个试管在几分钟之内都会变成蓝色(参见图7上的试管A和试管B)。在有Xgal存在的情形下，将每个EPIV反应组分在同样的条件下但温度为70℃下进行保温，只有对应于用编码β-半乳糖苷酶的质粒进行的EPIV反应的试管才会变成蓝色(参见图7中的试管C和试管D这两个试管都已经过离心分离以便沉积中温菌翻译提取物的蛋白质，这些蛋白质在70℃的条件下进行活性试验期间热变性沉淀)。在这一温度(中温菌β-半乳糖苷酶热变性)下，无法测试到中温β-半乳糖苷酶的活性。因此，如果这一性质在所寻找性质的检测条件下无法检测的话，此时就可以使用含有类似于所寻找性质的该性质的翻译提取物。Ⅵ-从嗜极菌制备翻译提取物根据Zubay(1973)(10)或按照Pratt(1984)(7)所描述的方法，其它生物体的，尤其是嗜极菌的翻译提取物可从细胞开始进行制备。离心分离的速度，细胞破碎的条件以及不同反应或制备缓冲液，通过系统性试验而针对每个类型的翻译提取物进行适当地调整。因而，这样在实现一系列翻译提取物时，无论基因的来源如何，都可以翻译基因，本发明的方法因而允许在翻译系统和编码所寻找的性质的基因表达之间有一相关性。
参考文献1)Hanahan D(1985)，大肠杆菌的转化技术，见《DNA克隆实用方法》，GLOWER,D.M(编辑)，牛津IRL出版社，第一卷109-135。2)Maniatis T.等(1982)分子克隆实验手册，冷泉港实验室出版社，纽约冷泉港。3)Masson J.M等(1987)在酿酒酵母中表达一套合成抑制tRNAphe基因，美国科学院院报84,6815-6819。4)Normanly J.等，1986，两个大肠杆菌琥珀抑制基因tRNApheCUA和tRNAcysCUA的构建，美国科学院院报83,6548-6552。5)O′Callaghan等，1972，通过使用生色头孢菌素底物检测β-内酰胺酶的新方法，Antimicrob.Agents Chemother.1,283-288。6)Prasher等，1992:Aequorea Victoria绿色荧光蛋白的一级结构，基因111,229-333。7)Pratt J.M 1984，在原核生物无细胞系统中的偶联的转录-翻译，转录-翻译实用方法，Hames B.D和HigginsS.J.编辑，JRL出版社。8)Studier F.W和Moffatt B.A,1986:T7噬菌体RNA聚合酶在指导克隆基因的选择性高表达中的应用，分子生物学杂志189,113-130。9)Sutcliff G,1978大肠杆菌质粒pBR 322的氨苄青霉素抗性基因的核苷酸序列，美国科学院院报75,3737-3741。10)Zubay G,1973在微生物系统中蛋白质的体外合成，遗传学年度综述7,267-287。
权利要求
1.分离和鉴定一含有核酸的生物样品中可能存在的各种功能的方法，其特征在于包含如下的步骤(a)从所说的生物样品开始制备核酸片段；(b)将每个所说的片段与载体分子进行结合；(c)分离步骤b)的与载体分子相结合的每个片段，或由片段与载体分子的结合组成的每一结构的一部分；(d)对步骤c)中与载体分子相结合的每个片段，或由片段与载体分子的结合组成的每一结构的一部分在体外进行处理，以获得转录物(e)测试在步骤(d)获得的转录物的功能，或在转录物的翻译后测试所编码的蛋白质的功能。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于步骤(e)包括对步骤(d)获得的转录物在体外利用一细胞提取物进行处理，使得其翻译成蛋白质，然后用任何合适的方式测试所述蛋白质的功能。
3.根据权利要求1或2的方法，其特征在于载体分子由一个或多个多核苷酸序列组成，这种多核苷酸序列包括用于步骤(d)的至少一个转录启动子，以及任选地有利于步骤(c)的片段的分离的物质。
4.根据权利要求3的方法，其特征在于载体分子由二个多核苷酸序列组成，每个多核苷酸序列含有至少一个转录启动子，这两个序列的每一个都与在步骤(a)中获得的任一个片段的一个末端结合。
5.根据权利要求3或4的方法，其特征在于载体分子带有的转录启动子是强启动子类型。
6.根据前述任一项权利要求的方法，其特征在于转录步骤(d)可与步骤(e)的翻译同时进行，或不同时进行。
7.根据前述任一项权利要求的方法，其特征在于步骤(e)转录物的翻译由与生物样品同一来源或接近来源的翻译提取物进行。
8.根据权利要求1-7任一项的方法，其特征在于翻译提取物要么不具备步骤(e)中测试的功能，要么具有这一功能，但在所说的步骤(e)的测试条件下不可检测到。
9.根据权利要求1-8任一项的方法，其特征在于翻译提取物是多种翻译提取物的混合物。
10.根据权利要求1-9任一项的方法，其特征在于翻译提取物包含特异于一个或多个密码子的一或多个tRNA，和/或有利于所表达的蛋白质的重折叠或更有效的成熟的一种或多种物质。
11.根据权利要求1-6和8-10任一项的方法，其特征在于无论生物样品的来源如何，翻译提取物是一种通用翻译提取物。
12.根据前述任一项权利要求的方法，其特征在于步骤(e)有测试转录物的功能如核酶或tRNA组成。
13.根据权利要求1-11任一项的方法，其特征在于步骤(e)由测试从所述转录物翻译的蛋白质的酶活性或亲和性功能组成。
14.根据前述任一项权利要求的方法，其特征在于步骤(e)由平行测试或同时测试单个功能或多个功能的不同性质组成。
15.根据前述任一项权利要求的方法，其特征在于步骤(b)中与每个片段结合的载体分子是一种质粒载体，这一质粒载体优选地不能在体内表达所述片段。
16.根据前述任一项权利要求的方法，其特征在于当生物样品来自原核生物时，在步骤(a)中制备的片段的大小为1至几十个kb，优选是1至40kb，以及有利的大小是1到10kb。
17.根据前述任一项权利要求的方法，其特征在于在真核生物情况下，在步骤(a)中制备的片段有利的是大小为几十至几百个kb。
18.根据权利要求1-15任一项的方法，其特征在于在步骤(a)中制备的片段可以带有部分的或完整的操纵子。
19.根据前述任一项权利要求的方法，其特征在于用于制备步骤(a)的片段的生物样品来自一个或多个原核生物或真核细胞，或来自相同的或不同的病毒。
20.根据上述权利要求1-18任一项的方法，其特征在于用于制备步骤(a)的片段的生物样品由合成核酸的序列或文库组成。
21.根据前述任一项权利要求的方法，其特征在于用于制备步骤(a)的片段的生物样品由未知的生物体和/或核酸组成。
22.根据权利要求1-15和17-21任一项的方法，其特征在于生物样品是真核DNA文库，并且步骤(d)的转录反应通过使用核提取物进行mRNA的体外剪接和成熟反应来完成。
23.根据前述任一项权利要求的方法，其特征在于在步骤(b)与核酸片段相结合的载体分子是一种质粒载体，并且在步骤(b)中每个片段在克隆位点或限制盒位置插入一载体，所说的质粒载体包括-在克隆位点的一侧的一个RNA聚合酶启动子，任选地，在另一侧的一个RNA聚合酶终止子；-一克隆的位置，其周围为两个相同的或不同的RNA聚合酶启动子，以及任选地两侧都有一个或多个相应的RNA聚合酶终止子。
24.根据权利要求23的方法，其特征在于启动子以及任选的终止子在步骤(c)分离重组载体所用的微生物中无功能。
25.根据权利要求23或24的方法，其特征在于步骤(c)中重组载体的分离如下进行用步骤(b)中获得的重组载体的集合转化宿主细胞，从而建立一个克隆文库，随后用任何合适的方式提取重组载体或文库中每个克隆所含的载体的一部分。
26.根据前述任一项权利要求的方法，其特征在于它可以全部在固相支持物如芯片、膜、纳滴定(nanotitration)板上实现。
27.根据前述任一项权利要求的方法鉴别和选择的一个未知核酸序列。
28.含有权利要求27的核酸序列的质粒载体。
29.用权利要求27的核酸序列和权利要求28的载体转化的宿主细胞。
30.由权利要求27的核酸序列编码的蛋白质。
31.由权利要求27的核酸序列或权利要求28的载体或权利要求30的蛋白质组成的文库。
32.适用于权利要求1-26任一项的方法步骤(b)的质粒载体，其特征在于所述质粒载体包括-质粒复制起点；-克隆位点，它的周围是两个相同的启动子，如T7RNA聚合酶的启动子或其它强RNA聚合酶启动子，任选地，两侧有相同RNA聚合酶的终止子；-任选地在终止子两侧的特异序列，其作为PCR扩增载体携带的坏死片段的杂交位点；-由tRNA基因组成的一个选择基因，以及任选地，平行地插入克隆位点的另一个选择基因。
33.用于实施根据前述任一项权利要求的方法的试剂盒，其特征在于其包括-制备核酸片段所必需的手段；-至少一个载体分子；-至少一个聚合因子；-任选地，至少一个细胞翻译提取物；-测试一种或多种功能所必需的手段；-进行不同的步骤所必需的缓冲液。
34.用于实施根据权利要求1-26任一项的方法的自动化装置，其特征在于所述装置包括一个或多个支持物、机器人、自动装置和读数器的配置，这些配置任选地使得能在步骤(a)制备样品，任选地在步骤(b)中将片段与载体分子相结合，任选地在步骤(c)中分离与载体分子相结合的片段，以及实施步骤(d)和步骤(e)。
全文摘要
本发明涉及分离和鉴定一含有核酸的生物样品中可能存在的各种功能的方法,其特征在于包含如下的步骤:(a)从所说的生物样品开始制备核酸片段;(b)将每个所说的片段与载体分子进行结合;(c)分离步骤(b)的与载体分子相结合的每个片段,或由片段与载体分子的结合组成的每一结构的一部分;(d)对步骤(c)中与载体分子相结合的每个片段,或由片段与载体分子的结合组成的每一结构的一部分在体外进行处理,以获得转录物;(e)测试在步骤(d)获得的转录物的功能,或在转录物的翻译后测试所编码的蛋白质的功能。
文档编号C12N1/21GK1323356SQ9981203
公开日2001年11月21日 申请日期1999年8月11日 优先权日1998年8月12日
发明者达尼埃尔·迪普雷, 让-米歇尔·马松, 法布里斯·勒菲弗 申请人:普罗蒂厄斯股份公司