一种植酸酶突变体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种植酸酶突变体及其应用。
【背景技术】
[0002] 植酸广泛存在于玉米、米糠、各种饼柏等饲料原料中，一方面它具有很强的抗营养 作用，与饲料中金属离子和蛋白质结合，影响这些营养物质的消化与吸收;另一方面植酸分 子含有大量有机磷，动物胃肠道由于缺少相应的酶，因而不能利用，这些有机磷随粪便排放 到环境中，造成环境污染。植酸酶可使植酸发生水解反应，生成肌醇衍生物和正磷酸，作为 单胃动物的饲料添加剂，可以促进动物对磷元素的利用，有助于畜禽生长，提高畜牧业效 益，同时它还能降低植酸磷对环境的污染，并且可以提高饲料中能量与蛋白质的消化率。现 在已成为饲料行业公认的有效饲料添加剂。植酸酶作为饲料添加剂在实际应用过程中需要 耐受饲料高温制粒过程，因此饲用植酸酶必须耐热，而目前大多数植酸酶耐热性能较差。
[0003] 无花果植酸酶（黑曲霉植酸酶)虽然酶比活相对高，也具有一定的耐热作用，但在 实际应用上还不理想，如果能够将其耐热性增高，无花果植酸酶将具有更大的应用价值。相 比之下，烟曲霉植酸酶有着更好的耐热性，但比活相对较低。因此，本发明根据烟曲霉植酸 酶的序列中与其耐热性相关的氨基酸序列来改造无花果曲霉植酸酶，使其成为耐热性高的 植酸酶。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种植酸酶突变体及其应用，旨在解决无花果植酸酶的耐 热性较差，在实际应用上不理想的问题。
[0005] 本发明是这样实现的，通过定点突变的方法将编码无花果曲霉(黑曲霉)植酸酶氨 基酸序列SEQ ID N0:3中的氨基酸发生如下改变A39E，N40D，S42L，V43S，I44V，P46S，R167G， Q169T，P170N，G171R，Q172A，T252R，S253T，T254S，V255D，D256A，T257S，K258Q 获得一种新的 植酸酶突变体，所述植酸酶突变体的氨基酸序列SEQ ID NO: 1;所述植酸酶突变体的核苷酸 序列SEQ ID N0:2。
[0006] 本发明的另一目的在于提供一种所述植酸酶突变体在饲料添加剂中的应用。
[0007] 本发明的另一目的在于提供一种如所述植酸酶突变体的获得方法，所述植酸酶突 变体的获得方法包括：
[0008]原来无花果植酸酶基因连接到ppic9k载体上的重组质粒为模板，进行突变PCR扩 增;PCR体系按照试剂盒说明书配制50yL;
[0009] 取10μ1 PCR产物，1 %琼脂糖凝胶电泳检测。条带正确后加 ΙμL DM!1酶于PCR产物 中，混匀，37°C孵育lh;
[0010] 然后转化，加入2-5μ1 DMT酶消化产物于50μ1 DMT感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴 30分钟；42 °C准确热激45秒，立即置于冰上lOmin;加500ylLB培养基，200转，37 °C培养1小 时；7000rpm离心3min，弃掉部分上清，保留100-150μ1，轻弹悬浮菌体，取全部菌液涂板，培 养过夜；
[0011] 验证阳性克隆子，每个位点的阳性克隆送出测序，测序结果与原序列比对，找出突 变正确的重组质粒，再以突变一次质粒作为模板，进行第二位点突变至止突变位点全部突 变掉，突变后的质粒转入毕赤酵母GS115或(X33、SMD1168、PICHIAPINK)中进行表达，发酵测 酶活，研究酶学及应用特性。
[0012] 进一步，所述PCR反应参数为:94 °C预变性5min; 94 °C变性30S，66 °C退火30S，72 °C 延伸3min30S，共28个循环；94°C变性30S，52°C退火30S，72°C延伸3min30S，共7个循环；72°C 扩增后延伸1 Omin;其中从66°C到52°C每个循环温度下降0.5°C。
[0013]进一步，所述植酸酶突变体的酶促反应最适pH值为6.0;最适温度为50°C ;在pH2、 37°C条件下，pH耐受1小时，残活还在60%左右，在pH5、37°C条件下，pH耐受1小时，残活还在 90%以上。植酸酶在70°(：耐受51^11、80°(：时耐受31^11、高温90°(：时耐受11^11，残活都在80% 以上。
[0014] 本发明提供的植酸酶突变体及其应用，通过分析具有更好的耐热性烟曲霉植酸酶 分子结构特征，使用烟曲霉植酸酶的部分序列来替代无花果曲霉植酸酶氨基酸序列，无花 果曲霉（黑曲霉）植酸酶氨基酸序列SEQ ID N0:3中的氨基酸发生如下改变A39E，N40D， S42L，V43S，I44V，P46S，R167G，Q169T，P170N，G171R，Q172A，T252R，S253T，T254S，V255D， D256A，T257S，K258Q。具体方案为以无花果植酸酶(黑曲霉植酸酶)作为模版，使无花果植酸 酶(黑曲霉植酸酶)基因发生突变，获得了新的植酸酶基因的突变体SEQ ID N0:2,该突变后 的基因除与PPIC9K构建重组质粒外，还可以与PPIC9、PPICZaA\B\C、PPICZA\B\C、PGAPZaA\ B\C等表达载体构建重组质粒，转化相应宿主菌（毕赤酵母GS115或（X33、SMD1168、 PICHIAPINK)，通过在平板上加入植酸钙或在平板中加入G418、Ze〇cin等抗生素，筛选获得 植酸酶突变体基因工程菌，然后通过发酵获得新的植酸酶突变体。使其成为耐热性高的植 酸酶，该植酸酶突变体在高温下，植酸酶的温度耐受情况如图5-图7所示，无论在任何温度 和时间下，突变后的相对酶活都高于突变前的，在70°C耐受1小时突变植酸酶相对酶活大约 还有50%，而突变之前无花果植酸酶仅仅剩余30%。在80°C时突变后相对酶活剩余一半时 的时间大约为30min，而突变前耐受15min就达到半衰期了。高温90°C时耐受20min突变后相 对酶活还剩余接近40%，而突变前植酸酶仅仅剩余25%，总之突变后与突变前相比耐受相 对酶活提高了15%左右；同时植酸酶突变体较原无花果曲霉植酸酶具有更宽的作用pH，相 对突变前无花果植酸酶，突变后的酶的最适pH提高了0.5个单位，并且在中性环境下pH7.0 相对酶活剩余接近50%左右，与突变之前有改进。该突变体能在中性环境中很好发生作用， 并且具有较理想耐热特性，适合耐高温制粒，因此特别适合于作为水产饲料添加剂。
【附图说明】
[0015] 图1是本发明实施例提供的植酸酶突变体的获得方法流程图。
[0016] 图2是本发明实施例提供的最适pH的测定曲线图。
[0017] 图3是本发明实施例提供的最适温度曲线图。
[0018] 图4是本发明实施例提供的pH耐受曲线图。
[0019] 图5是本发明实施例提供的70°C耐受曲线图。
[0020]图6是本发明实施例提供的80 °C耐受曲线图。
[0021]图7是本发明实施例提供的90°C耐受曲线图。
【具体实施方式】
[0022]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明 进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于 限定本发明。
[0023]本发明通过计算机辅助手段比对耐热性高的烟曲霉植酸酶与无花果曲霉植酸酶 的序列以及结构，根据影响烟曲霉植酸酶耐热性的氨基酸序列来替代无花果植酸酶（黑曲 霉植酸酶)相应位置的氨基酸序列。无花果曲霉（黑曲霉)植酸酶氨基酸序列SEQ ID N0:3中 的氨基酸发生如下改变 A39E，N40D，S42L，V43S，I44V，P46S，R167G，Q169T，P170N，G171R, Q172A,T252R，S253T，T254S，V255D，D256A,T257S，K258Q。具体实施方案为以无花果植酸酶 (黑曲霉植酸酶)基因为模板，通过基因的定点突变方法，使无花果植酸酶(黑曲霉植酸酶） 基因发生突变，获得了新的植酸酶基因的突变体SEQ ID N0:2,将该突变基因与PPIC9K或 PPIC9、PPICZaA\B\C、PPICZA\B\C、PGAPZaA\B\C、PPINK Hc\Lc相连构建重组质粒，转入毕赤 酵母GS115或(X33、SMD1168、PICHIAPINK)中进行表达，发酵可以获得该植酸酶突变体。该突 变体能在中性环境中很好发生作用，并且具有较理想耐热特性，适合耐高温制粒，因此特别 适合于水产饲料添加剂。
[0024] 本发明实施例的植酸酶突变后的突变体的氨基酸序列SEQ ID NO: 1;突变后无花 果曲霉植酸酶核苷酸序列SEQ ID N0:2。
[0025]如图1所示，本发明实施例的植酸酶突变体的获得方法包括以下步骤：
[0026] S101:无花果植酸酶基因连接到ppic9k载体上的重组质粒为模板，进行突变PCR扩 增;PCR体系按照试剂盒说明书配制50yL;
[0027] S102:取10μ1 PCR产物，1%琼脂糖凝胶电泳检测。条带正确后加 ΙμL DMT酶于PCR 产物中，混匀，37°C孵育lh;
[0028] S103:然后转化，加入2-5μ1 DMT酶消化产物于50μ1 DMT感受态细胞中（在感受态 细胞刚刚解冻时加入产物），轻弹混匀，冰浴30分钟；42°C准确热激45秒，立即置于冰上 lOmin;加500ylLB培养基，200转，37 °C培养1小时；7000rpm离心3min，弃掉部分上清，保留 100-150μ1，轻弹悬浮菌体，取全部菌液涂板，培养过夜；
[0029] S104:验证阳性克隆子，每个位点的阳性克隆送出测序(华大基因公司），测序结果 与原序列比对，找出突变正确的重组质粒，再以突变一次质粒作为模板，进行第二位点突变 至止突变位点全部突变掉，突变后的质粒转入酵母表达，发酵测酶活。
[0030] PCR 反应参数为：94°C 预变性 5min;94°C 变性 30S，66°C 退火 30S，72°C 延伸 3min30S， 共28个循环；94°C变性30S，52°C退火30S，72°C延伸3min30S，共7个循环；72°C扩增后延伸 1 Omin;其中从66°C到52°C每个循环温度下降0.5°C。
[0031] 下面结合试验对本发明的应用原理作详细的描述。
[0032]酶活定义:样品在温度为37°C、pH5.50条件下，每分钟从浓度为5. Ommol/L植酸钠 溶液中释放lymo