粘质沙雷氏菌ll-413菌株及其制备舍雷肽酶的应用
【专利摘要】本发明公开了一种粘质沙雷氏菌LL?413菌株及其制备舍雷肽酶的应用，将粘质沙雷氏菌LL?413菌株接种入产酶培养基，于28～32℃、200～250r/min发酵20～42h，获得含有舍雷肽酶的发酵液，发酵液经过离心后去除菌体，上清液再经过盐析、透析和冷冻干燥后，即可得到舍雷肽酶；本发明LL?413菌株生长快、容易培养，发酵周期短；产舍雷肽酶活性高，在优选的条件下，摇瓶发酵的酶活可达1126U/mL，10L发酵罐发酵酶活可达1505U/mL；分离纯化工艺简单，经盐析和透析脱盐后，舍雷肽酶的冻干粉酶活达2843U/mg，舍雷肽酶分子量为50kDa，纤溶活性达112357U/g。CCTCC No：M 201578020151225
【专利说明】
粘质沙雷氏菌LL-413菌株及其制备舍雷肽酶的应用 (一)
技术领域
[0001 ] 本发明涉及一株舍雷肽酶产生菌一粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)LL_413 菌株，及其在制备舍雷肽酶中的应用。 (二)
【背景技术】
[0002] 舍雷肽酶（861^&1：；[0口6口1：1(1&86或861'抑口6口七&86)，又名沙雷肽酶、沙雷蛋白酶等， 是来源于微生物的一种蛋白酶，因其最初发现于粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens)而 得名。该酶的发现者Dr Hans称该酶为"奇迹之酶"，它具有良好的抗炎、抗肿胀、促进痰液、 脓液溶解与排泄以及镇痛作用，临床用于手术后及外伤的消炎;副鼻窦炎、乳汁潴留性乳腺 炎、膀胱炎、附睾炎、智齿周围炎及牙槽脓肿时的消炎；以及治疗支气管炎、肺结核、支气管 哮喘时痰液不易咳出等。研究也表明，舍雷肽酶具有出色的纤溶活性，使其在治疗动脉粥样 硬化方面也有潜在的应用。目前市场上已有舍雷肽酶相关药品，如国内市场上的"达先"、 "释瑞达"和"曲坦"等肠溶片，国外市场上的"Dasen"和"Seradase"等;舍雷肽酶也可作为非 处方药使用，具有对抗炎症、解除疼痛和肿胀，还具有加速复原与激发免疫系统等功效，产 品如市场上的 "Serretia"、"Natto-Serra" 和 "SerraGold"胶囊等。
[0003]舍雷肽酶的分子量在40_60kDa之间，是一种含有锌离子的金属蛋白酶。从基因序 列推导出的氨基酸序列可知，该酶是由470个氨基酸组成。该酶最大的特点是其氨基酸序列 中不包含硫氨基酸，水解蛋白的主要位点是甘氨酸和疏水性氨基酸（如亮氨酸、苯丙氨酸 等）的肽键部位。目前舍雷肽酶主要生产菌种是粘质沙雷氏菌E15菌株，该菌株是从日本蚕 蛹内脏中筛选得到，蚕蛹就是利用该酶破坏茧壳，从而化蛹成蛾。粘质沙雷氏菌又名灵杆 菌，是革兰氏阴性兼性厌氧杆菌，属于肠杆菌科^11〖61'(^3(^6143〇636)沙雷氏菌属 (Serrtia)。该菌的最大特征在28~30°C下培养产生鲜红的色素一灵菌红素(prodigiosin， 又称灵杆菌素）；37 °C下培养不产生红色色素，灵菌红素具有抗菌、抑癌、提高免疫力等生理 活性，具有一定的开发潜质。
[0004] 近些年来，舍雷肽酶在作为药物在临床的使用量逐年增长，国内外市场需求量非 常大，而且售价较高，国内舍雷肽酶类药物的原料多从国外进口，生产的企业屈指可数，也 未见相关发酵工艺研究的报道。目前，日本和印度工业化生产规模较大，国际市场多向这两 个国家采购，所以国内迫切需要开发具自主知识产权的舍雷肽酶生产工艺。本发明筛选出 舍雷肽酶高产菌株，优化了舍雷肽酶发酵工艺，建立了酶的分离纯化方法，开发出一条完整 的舍雷肽酶生产工艺，从而可以扩大国内舍雷肽酶的生产能力，满足国内外市场需求。 (三)
【发明内容】
[0005] 本发明提供一株新的舍雷肽酶产生菌一粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens) LL-413菌株，及其在制备舍雷肽酶中的应用，具有舍雷肽酶发酵活力单位高，发酵周期短， 分离纯化成本低等优点。
[0006] 本发明采用的技术方案为：
[0007]本发明提供一株新的舍雷肽酶产生菌--粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens) LL-413菌株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号:CCTCC No:M2015780，保藏日期为 2015年12月25日，地址：中国武汉，武汉大学，邮编:430072。
[0008] 所述的粘质沙雷氏菌LL-413菌株的培养特征如下，将LL-413菌株接种在营养琼脂 平板上培养，30°C下培养24h后，正面可见鲜红色菌落，菌落边缘整齐，表面光滑有光泽；背 面也呈鲜红色;在37 °C下培养24h后可见浅粉色菌落，菌落表面光滑，边缘整齐，背面呈浅黄 色;有轻微的臭味。将所述LL-413菌株接种在脱脂牛奶平板培养基上，30°C培养24h后可以 看到鲜红色的菌落以及菌落四周明显的透明圈。
[0009] 所述粘质沙雷氏菌LL-413菌株的菌体特征如下:革兰氏阴性，短杆状，长约2.0~ 2.5以111，宽约0.8~1.(^111，无鞭毛和荚膜。
[0010]所述粘质沙雷氏菌LL-413菌株的16S rDNA的部分核苷酸序列如SEQ ID N0.1所 不。
[0011] 本发明还涉及所述的粘质沙雷氏菌LL-413菌株在发酵制备舍雷肽酶中的应用。所 述的应用是将粘质沙雷氏菌LL-413菌株接种入产酶培养基，于28~32°C、200~250r/min发 酵20~42h，得干菌体浓度为2 · 67~9 · 40g/L，舍雷肽酶活力为360 · 0~1505U/mL的发酵液， 发酵液经过离心后去除菌体，上清液再经过盐析、透析和冷冻干燥后，即可得到舍雷肽酶； 所述产酶培养基终浓度组成为:酵母浸出粉5~1 lg/L，牛肉膏3.0~6.6g/L，麦芽浸粉10.0 ~12.28/1，1%3〇4 18/1，似(：158/1，溶剂为水，初始?!1为7.5~8.5。
[0012] 所述粘质沙雷氏菌LL-413菌株在产酶培养前，通常需要先经斜面活化培养，然后 经种子培养、获得种子液再接入产酶培养基进行培养，具体步骤如下：
[0013] (1)将粘质沙雷氏菌LL-413菌株接种于斜面培养基，于30°C培养24~36h，得到活 化后的斜面菌体;所述的斜面培养基终浓度组成为:蛋白胨l〇g/L，牛肉膏3g/L，NaCl 5g/L， 琼脂20g/L，溶剂为水，初始pH为7.0;
[0014] (2)将步骤（1)活化后的斜面菌体接种至种子培养基中，于30°C、200~250r/min振 荡条件下培养18~24h，得到种子液;所述种子培养基终浓度组成为:蛋白胨10g/L，牛肉膏 3g/L，NaCl 5g/L，溶剂为水，初始pH为7 · 0;
[0015] (3)将步骤(2)种子液以体积浓度1 %~2 %的接种量，移种到产酶培养基中，于30 °C、200~250r/min振荡条件下培养24~42h，得到含舍雷肽酶的发酵液;所述产酶培养基终 浓度组成为:酵母浸出粉5~11 g/L，牛肉膏3 · 0~6 · 6g/L，麦芽浸粉10 · 0~12 · 2g/L，MgS〇4 lg/L，NaCl 5g/L，溶剂为水，培养基初始pH为7 · 5~8 · 5。
[0016] 本发明所述发酵液于4°C条件下5000g离心10min，分离除去菌体，得澄清的舍雷肽 酶粗酶液。
[0017] 本发明还涉及利用10L机械搅拌发酵罐对粘质沙雷氏菌LL-413菌株进行发酵制备 舍雷肽酶的应用。所述应用为:将粘质沙雷氏菌LL-413菌株经斜面培养基进行活化后，接种 入种子培养基培养18~24h后，将种子液以体积浓度1-2 %的接种量接入5.0~6.5L的产酶 培养基中，控制温度为30 ± 2 °C，pH为8.0 ± 0.5，调节通气量0.6~1. Ov/v · min，搅拌转速 300~500r/min，使溶氧饱和度50%~100%，发酵运行20~24h后，得到含有舍雷肽酶的发 酵液，将发酵液进行离心去除菌体后，即得到舍雷肽酶粗酶液。
[0018] 本发明所述粘质沙雷氏菌LL-413菌株发酵所产的含舍雷肽酶粗酶液进行分离纯 化的方法为:将粘质沙雷氏菌LL-413菌株发酵所得的舍雷肽酶粗酶液，经过硫酸铵(NH4S04) 沉淀、透析除盐和冷冻干燥后获得舍雷肽酶。具体的，所述分离纯化方法如下：
[0019] (1)往舍雷肽酶粗酶液中加入硫酸铵，使其饱和度达到30~45 %，4 °C沉淀12~ 24h，之后将粗酶液于4°C、8000g条件下离心10min，去除沉淀，保留上清液；
[0020] (2)往步骤(1)中经硫酸铵沉淀后所得的上清液中再次加入硫酸铵，使其饱和度达 到70~80 %，4°C沉淀12~24h，之后将粗酶液于4°C、8000g条件下离心10min，弃去上清液， 沉淀物用pH值8.0的Tris-HCl缓冲液溶解，此时得到舍雷肽酶粗品的浓缩液；
[0021] (3)将步骤(2)所得浓缩液装入截留分子量为14kDa的透析袋中，以去离子水为透 析液透析除盐后，于-40°C冷冻干燥，即得到舍雷肽酶冻干酶粉。
[0022] 本发明中，所述的舍雷肽酶活力定义为：在37°C反应条件下，lmin水解浓度为 20mg/mL的酪蛋白产生lyg酪氨酸所需的酶量(mL)作为一个酶活力单位(U)。
[0023] 本发明提供了产舍雷肽酶的LL-413菌株，以及发酵制备舍雷肽酶的应用，其有益 效果主要体现在：（1)粘质沙雷氏菌LL-413菌株生长快、容易培养，发酵周期短；（2)粘质沙 雷氏菌LL-413菌株产舍雷肽酶活性高，在优选的条件下，摇瓶发酵的酶活可达1126U/mL， 10L发酵罐发酵酶活可达1505U/mL;(3)舍雷肽酶的分离纯化工艺简单，经盐析和透析脱盐 后，舍雷肽酶的冻干粉酶活达到2843U/m g<3(4)本发明制备的舍雷肽酶分子量为50kDa，纤溶 活性达 112357U/g。 (四）
【附图说明】
[0024]图1 A66Q-酪氨酸浓度标准曲线；
[0025]图2平板培养基上LL-413菌株的菌落形态照片；
[0026]图3光学显微镜下LL-413菌株的菌体形态照片；
[0027]图4由LL-413菌株发酵制备的舍雷肽酶的电泳图，泳道1:标准蛋白Marker;泳道2: 舍雷肽酶样品(实施例7制备）。 (五)
【具体实施方式】
[0028] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
[0029] 实施例1:产舍雷肽酶菌株的分离与筛选
[0030] 所述的LL-413菌株的分离和筛选方法如下：
[0031 ] (1)平板初筛:取蚕茧1只（3 . lg)，剥去茧壳，取出蚕蛹（1.6g)，于体积浓度75 %的 乙醇水溶液中浸泡15s后取出，用镊子和剪刀小心剪去头部，剖开腹腔取出内脏;将内脏放 入无菌研钵，加入lmL无菌去离子水研磨至匀浆;将匀浆液用无菌水梯度稀释至Π ^-ΠΓ6 倍。吸取0.2mL各稀释度溶液，涂布到脱脂牛奶平板培养基上，30°C恒温箱培养至菌落数不 再增加。挑取红色且在平板上形成透明圈的菌落，划线接种于新鲜的营养琼脂平板培养基 上。30°C恒温箱培养至长出单菌落。纯化后的单菌落接种于斜面培养基，每个菌株给以编 号，共获得7个具上述特征的菌株，分别编号(见表1)，4°C保存备用；
[0032] (2)摇瓶复筛:从斜面培养基挑取上述分离纯化后获得的菌株菌体，接入营养琼脂 平板培养基于30°C培养36h，活化培养后挑取菌体接入50mL初始产酶培养基中，于30°C、 200r/min摇床中发酵培养24h，将发酵液5000g离心10min，上清液即为粗酶液。测定粗酶液 的沙雷肽酶活力，不同菌株产舍雷肽酶的活力及干菌体浓度见表1，可见活力最高的菌株为 LL-413菌株，舍雷肽酶的活力为113 · 4U/mL。
[0033]表1不同菌株产舍雷肽酶的活力比较
[0034]
[0035]所述的蚕茧采集自浙江省杭州临安市，采集时间为2015年3月。
[0036]所述脱脂牛奶平板培养基终浓度组成及配制方法为:NaCl 1 Og/L，琼脂40g/L，pH 7.0，121°C高压蒸汽灭菌20min。灭菌结束后加入等体积的60°C保存的无菌脱脂牛奶，混合 均匀倒平板。
[0037]所述斜面培养基和营养琼脂平板培养基组成相同，终浓度组成及配制方法为：蛋 白胨10g/L，牛肉膏3g/L，NaCl 5g/L，琼脂20g/L，pH 7.0。培养基加热至琼脂溶化后分装试 管或三角瓶中，经高压蒸汽121°C灭菌15min后搁置斜面或倒入无菌培养皿。
[0038]所述初始产酶培养基终浓度组成及配制方法为：蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，NaCl 5g/L，pH 7.0,250mL三角瓶装50mL，8层纱布扎口，121°C高压蒸汽灭菌20min。
[0039]所述的舍雷肽酶活力测定方法为：
[0040] 取4支试管分别编号1、2、3、4;先在4支试管中分别加入用pH 8.0的Tris-HCl缓冲 液稀释20~50倍的酶液lmL;然后，1号试管中加入TCA终止液2mL，2、3、4加入20mg/mL酪蛋白 溶液lmL;将4支试管一起放入37°C的恒温水浴中反应lOmin后，1号试管加入lmL酪蛋白溶 液，作为空白对照。2、3、4号试管立刻加入TCA终止液2mL终止反应。将4支试管中的反应液 8000g离心5min，分别取出lmL上清液，加入5mL Na2C〇3溶液，再加入lmL福林酸试剂快速混 勾；于37°C保温显色30min后，在660nm波长处测定吸光值A66〇。
[0041] 测出的2、3、4号试管样品A_平均值代入以下公式计算被测舍雷肽酶的活力。
[0043] 式中：A = 660nm处吸光度值;K =吸光常数，由酪氨酸浓度-A66Q标准曲线算得;n = 酶液稀释倍数;10为反应时间lOmin; 4为反应体系4mL。
[0044] 所述的酪氨酸浓度-A66Q标准曲线绘制方法为：取浓度为0、10、20、30、40、50yg/mL 的酪氨酸水溶液各1 mL于6支试管中，各加入0.4mo 1 /L的Na 2 CO3水溶液5mL，福林酸试剂1 mL， 于漩涡振荡器上混匀30s后，静置于37°C的恒温水浴锅内显色30min。显色结束后，在660nm 波长处测定吸光值A_。以测得的吸光值为横坐标，酪氨酸浓度为纵坐标，绘制标准曲线，标 准曲线见附图1，由线性拟合公式计算得K值为105.2。
[0045]本发明中，所述的舍雷肽酶活力定义为：在37°C反应条件下，lmin水解浓度为 20mg/mL的酪蛋白产生lyg酪氨酸所需的酶量(mL)作为一个酶活力单位(U)。
[0046] 所述的TCA(三氯乙酸)终止液的配制方法:精确称取三氯乙酸18g，无水乙酸钠30g 以及冰醋酸30mL用去离子水定容至1L。
[0047] 所述的20mg/mL酪蛋白溶液配制方法为:称取酪蛋白2g，用pH 8.0的Tris-HCl缓冲 液溶解并且定容至1 〇〇mL，4 °C冰箱保存48h之内使用。
[0048] 所述的Tris-HCl缓冲液配制方法为：先称取Tris (三羟甲基氨基甲烷）19g，用 900mL去离子水溶解后，用1M的盐酸将pH调至8.0，再定容至1L。
[0049] 所述的福林酚试剂为成品试剂，购自国药集团化学试剂有限公司。
[0050] 实施例2:LL-413菌株的分类鉴定
[0051]将LL-413菌株接种在营养琼脂平板上培养，30°C下培养24h后，正面可见鲜红色菌 落，菌落边缘整齐，表面光滑有光泽；背面也呈鲜红色；在37 °C下培养24h后可见浅粉色菌 落，菌落表面光滑，边缘整齐，背面呈浅黄色;有轻微的臭味。将所述LL-413菌株接种在脱脂 牛奶平板培养基上，30°C培养24h后可以看到鲜红色的菌落以及菌落四周明显的透明圈，菌 落照片见附图2。
[0052] 所述LL-413菌株的菌体特征如下:革兰氏阴性，短杆状，长约2.0~2.5μπι，宽约0.8 ~1 · Own，无鞭毛和荚膜，菌体照片见附图3。
[0053] 提取LL-413菌株的总DNA，利用细菌通用16S rDNA引物进行PCR扩增，获得该菌株 的16S rDNA片段，经测序，其16S rDNA的序列大小为1430bp，具体序列（SEQ ID N0.1)如下：
[0055] 将上述序列与美国国立生物信息中心（National Center for Biotechnology Information USA，NCBI)的基因库中的微生物16sRNA序列比对，结果表明该菌株与35株粘 质沙雷氏菌同源性达到99%及以上。依据16S rDNA序列，绘制的该菌株与沙雷氏菌属不同 种的系统发育树显示，该菌株与粘质沙雷氏菌亲缘关系较近，与沙雷氏菌属其他种的亲缘 关系相对较远，所以可以判断该菌株是1株粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens)，定名为 粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens)LL_413菌株。该菌株已递交中国典型培养物保藏中 心，保藏编号(〇^0：吣.）：]\12015780，保藏日期为2015年12月25日。
[0056] 实施例3:初始条件下LL-413菌株摇瓶发酵制备舍雷肽酶的方法
[0057] 以LL-413菌株为产酶菌种，在50mL摇瓶发酵规模下，增加了种子扩大培养步骤，摇 瓶发酵制备舍雷肽酶的方法如下：
[0058] (1)将LL-413菌株接种于斜面培养基，于30°C培养36h，得到LL-413菌株的活化斜 面;所述的斜面培养基终浓度组成为:蛋白胨l〇g/L，牛肉膏3g/L，NaCl 5g/L，琼脂20g/L，溶 剂为水，初始pH为7.0。培养基加热至琼脂溶化后分装于试管中，经高压蒸汽121°C灭菌 15min后搁置斜面；
[0059] (2)将步骤（1)活化培养后LL-413菌株的菌体接种至50mL种子培养基中，于30°C、 200r/min振荡条件下培养24h，得到种子液;所述种子培养基组成为：蛋白胨10g/L，牛肉膏 3g/L，NaCl 5g/L，溶剂为水，初始pH为7.0，250mL的三角瓶装50mL种子培养基，8层纱布扎 口，高压蒸汽121°C灭菌20min;
[0060] (3)将步骤（2)种子液以体积浓度1 %的接种量，移种到产酶培养基中，于30 °C、 200r/min振荡条件下培养24h，得干菌体浓度为1.79g/L的发酵液;所述初始产酶培养基组 成为：蛋白胨l〇g/L，牛肉膏3g/L，NaCl 5g/L，溶剂为水，初始pH为7 · 0，250mL的三角瓶装 50mL产酶培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121°C灭菌20min;
[0061] (4)将步骤(3)含舍雷肽酶的发酵液于4°C条件下5000g离心10min，分离除去菌体， 得澄清的舍雷肽酶粗酶液。
[0062]按实施例3方法，所得上清液的舍雷肽酶活力为229.3U/mL，实施例3方法重复实验 3批次，3批次实验结果无显著性差异，表明LL-413菌株发酵制备舍雷肽酶性能稳定。
[0063] 实施例4: LL-413菌株摇瓶发酵制备舍雷肽酶的方法
[0064] 以LL-413菌株为菌种，改变了产酶培养基组成，摇瓶发酵制备舍雷肽酶的活力单 位较实施例3有所提高，具体步骤如下：
[0065] (1)将LL-413菌株接种于斜面培养基，于30°C培养36h，得到活化后的LL-413菌株 的活化斜面;所述的斜面培养基组成和制备方法同实施例3;
[0066] (2)将步骤（1)活化培养后LL-413菌株的菌体接种至50mL种子培养基中，于30°C、 200r/min振荡条件下培养24h，得到种子液;所述种子培养基组成和制备方法同实施例3; [0067] (3)将步骤（2)种子液以体积浓度1 %的接种量，移种到产酶培养基中，于30 °C、 200r/min振荡条件下培养24h，得干菌体浓度为2.67g/L的发酵液;所述产酶培养基组成为： 酵母浸出粉5g/L，牛肉膏3g/L，麦芽浸粉10g/L，MgS〇4 lg/L，NaCl 5g/L，溶剂为水，初始pH 为7.0，250mL的三角瓶装50mL产酶培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121°C灭菌20min;
[0068] (4)将步骤(3)含舍雷肽酶的发酵液于4°C条件下5000g离心10min，分离除去菌体， 得澄清的舍雷肽酶粗酶液。
[0069]按实施例4方法，所得上清液的舍雷肽酶活力为360.0 U/mL，是实施例3的1.57倍。
[0070] 实施例5:优选条件下LL-413菌株摇瓶发酵制备舍雷肽酶的方法
[0071] 以LL-413菌株为菌种，经过产酶培养基组成及初始pH和发酵时间优化后，摇瓶发 酵制备舍雷肽酶的活力单位显著提高，具体步骤如下：
[0072] (1)将LL-413菌株接种于斜面培养基，于30°C培养24h，得到活化后的LL-413菌株 的活化斜面;所述的斜面培养基组成和制备方法同实施例3;
[0073] (2)将步骤（1)活化培养后LL-413菌株的菌体接种至种子培养基中，于30°C、250r/ min振荡条件下培养18h，得到种子液;所述种子培养基组成和制备方法同实施例3;
[0074] (3)将步骤（2)种子液以体积浓度1 %的接种量，移种到产酶培养基中，于30 °C、 250r/min振荡条件下培养42h，得干菌体浓度为5.51g/L的发酵液;所述产酶培养基组成为： 酵母浸出粉1 lg/L，牛肉膏6 · 6g/L，麦芽浸粉12 · 2g/L，MgS〇4 lg/L，NaCl 5g/L，溶剂为水，初 始pH为8.0，250mL的三角瓶装50mL产酶培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121°C灭菌20min;
[0075] (4)将步骤(3)含舍雷肽酶的发酵液于4°C条件下5000g离心10min，分离除去菌体， 得澄清的舍雷肽酶粗酶液。
[0076] 按实施例5方法，所得上清液的舍雷肽酶活力为1126U/mL，是实施例4的提高了 3.13 倍。
[0077] 实施例6: LL-413菌株发酵罐中制备舍雷肽酶的方法
[0078] 以LL-413菌株为菌种，利用10L机械搅拌发酵罐发酵制备舍雷肽酶，具体方法如 下：
[0079] (1)将LL-413菌株接种于斜面培养基，于30°C培养24h，得到活化后的LL-413菌株 的活化斜面;所述的斜面培养基组成和制备方法同实施例3;
[0080] (2)将步骤（1)活化培养后LL-413菌株的菌体接种至种子培养基中，于30°C、250r/ min振荡条件下培养18h，得到种子液;所述种子培养基组成和制备方法同实施例3;
[0081 ] (3)将步骤(2)种子液以体积浓度2 %的接种量，即130mL的种子液移种到6.5L产酶 培养基中。温度设定30±2°C，调节通气量0.6~1 .Ov/v · min，搅拌转速300~500r/min(发 酵开始时，通气量〇.6v/v · min，转速300r/min)，使得溶氧饱和度在50%~100%，通过流加 2m〇L/L的NaOH水溶液或2m 〇L/L的HC1水溶液，控制pH=8.0 ± 0.5，流加聚醚消泡剂控制泡沫 的产生。发酵运行20h放罐，得干菌体浓度为9.40g/L的发酵液;所述产酶培养基组成为:酵 母浸出粉llg/L，牛肉膏6.6g/L，麦芽浸粉12.2g/L，MgS〇4 lg/L，NaCl 5g/L，溶剂为水，10L 发酵罐装6.5L，原位高压蒸汽121°C灭菌20min;
[0082] (4)将步骤(3)含舍雷肽酶的发酵液于4°C条件下5000g离心10min，分离除去菌体， 得澄清的舍雷肽酶粗酶液。
[0083]按实施例6方法，所得上清液的舍雷肽酶活力为1505U/mL，是实施例5的1.34倍。 [0084]实施例7:舍雷肽酶的分离纯化
[0085]将实施例6制备的舍雷肽酶粗酶液，经过硫酸铵沉淀、透析除盐和冷冻干燥，得舍 雷肽酶纯化产品。
[0086] (1)往500mL的舍雷肽酶粗酶液中，边搅拌边加入145.5g硫酸铵，使其饱和度至 45 %，4°C沉淀12h，之后将上述溶液于4°C、8000g条件下离心10min，弃去沉淀，得上清液 580mL；
[0087] (2)继续往步骤（1)中所得的上清液中加入110.2g硫酸铵，使其饱和度达到75%，4 °C沉淀12h，之后将上述溶液于4°C、8000g条件下离心10min，弃去上清液，用30mL的pH 8. OTris-HCl缓冲液将沉淀溶解，此时得到舍雷肽酶粗品的浓缩液约35mL;
[0088] (3)将步骤(2)所得浓缩液，装入截留分子量为14kDa的透析袋中，用去离子水作为 透析液，透析12h除盐；
[0089] (4)将步骤（3)透析除盐的舍雷肽酶浓缩液转入洁净培养皿中，于_40°C、真空度 10Pa条件下冷冻干燥，得到215.6mg舍雷肽酶冻干酶粉，此冻干粉的酶活力2843U/mg，舍雷 肽酶的纯化收率为81.5%。
[0090] 实施例8:舍雷肽酶水解纤维蛋白原的应用
[0091] 取在55°C保存的15g/L琼脂糖水溶液40mL，加入在37°C保温的浓度1.5mg/mL牛血 纤维蛋白原溶液40mL，迅速混匀并注意不要产生气泡，再加入20U/mL凝血酶溶液2mL，立即 混匀，快速倒入直径6cm的平皿中，室温下放置lh至凝固。用直径2mm的打孔器打孔，用滤纸 吸干孔里残留的液体，然后吸取10yL活力为28000U/mL舍雷肽酶液(实施例7制备的舍雷肽 酶冻干酶粉用pH 8.0的Tris-HCl缓冲液配制而成）加入到孔里，盖上皿盖，37°C恒温孵育 18h后，用卡尺测量溶解圈两垂直直径，对照纤溶活性与溶解圈两垂直直径的乘积标准曲 线，计算出舍雷肽酶的纤溶活性。此法测得LL-413菌株所产的舍雷肽酶的纤溶活性为 112357U/g〇
[0092] 所述的20U/mL凝血酶溶液配制方法为：100U/支的凝血酶，加入5mL的PBS缓冲液溶 解，既得到20U/mL的凝血酶溶液。
[0093] 所述的1.5mg/mL牛血纤维蛋白原溶液配制方法为:称取60mg牛血纤维蛋白原，加 入40mL的PBS缓冲液溶液溶解。
[0094] 所述的PBS缓冲液的配制方法为：称取Na2HP〇4 · H20 7.16g，用去离子水定容至 100mL(A液）；称取NaH2P〇4 · 2H20 3.12g，用去离子水定容至100mL(B液）；取81mL的A液和 19mL的B液混合，即得到pH 7 · 4的PBS缓冲液。
[0095]所述的纤溶活性与溶解圈两垂直直径的乘积标准曲线回归方程为：Υι?. 0000004839X2+0.02203X-12. 2715 ， 式中， X 为酶的纤溶活性 (U/mL) ， Y 为溶解圈的两垂直 直径乘积(mm2)。该标准曲线回归方程引用自文献:杨祖伟，邓月新.琼脂糖-纤维蛋白平板 法测定纳豆冻干粉中纳豆激酶活性.医学信息，2015，（ 5): 67-72。
【主权项】
1. 粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens)LL-413菌株，保藏于中国典型培养物保藏中 心，保藏编号：CCTCC N〇:M2015780,保藏日期为2015年12月25日，地址：中国武汉，武汉大 学，邮编：430072。2. -种权利要求1所述粘质沙雷氏菌LL-413菌株在制备舍雷肽酶中的应用。3. 如权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用方法为:将粘质沙雷氏菌LL-413菌株 接种入产酶培养基，于28~32°C、200~250r/min发酵20~42h，获得含有舍雷肽酶的发酵 液，发酵液经过离心后去除菌体，上清液再经过盐析、透析和冷冻干燥后，即可得到舍雷肽 酶;所述产酶培养基终浓度组成为:酵母浸出粉5~1 lg/L，牛肉膏3.0~6.6g/L，麦芽浸粉 10.0~12.2g/L，MgS〇4 lg/L，NaCl 5g/L，溶剂为水，初始pH为7.5~8.5。4. 如权利要求3所述的应用，其特征在于所述产酶培养基终浓度组成为：酵母浸出粉 1 lg/L，牛肉膏6 · 6g/L，麦芽浸粉12 · 2g/L，MgS〇4 lg/L，NaCl 5g/L，溶剂为水，初始pH为8 · 0。5. 如权利要求3所述的应用，其特征在于所述发酵液制备方法为： (1) 将粘质沙雷氏菌LL-413菌株接种于斜面培养基，于30°C培养24~36h，得到活化后 的斜面菌体;所述的斜面培养基终浓度组成为:蛋白胨l〇g/L，牛肉膏3g/L，NaCl 5g/L，琼脂 20g/L，溶剂为水，初始pH为7.0; (2) 将步骤（1)活化后的斜面菌体接种至种子培养基中，于30°C、200~250r/min振荡条 件下培养18~24h，得到种子液;所述种子培养基终浓度组成为:蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L， NaCl 5g/L，溶剂为水，初始pH为7.0; (3) 将步骤（2)种子液以体积浓度1%~2%的接种量，移种到产酶培养基中，于30°C、 200~250r/min振荡条件下培养24~42h，得到含舍雷肽酶的发酵液。6. 如权利要求3所述的应用，其特征在于所述应用方法为:将粘质沙雷氏菌LL-413菌株 经斜面培养基进行活化后，接种入种子培养基培养18~24h后，将种子液以体积浓度1-2% 的接种量接入含产酶培养基的发酵罐中，控制温度为30 ± 2°C，pH为8.0 ± 0.5，调节通气量 0.6~1.0￥八.111；[11，揽摔转速300~5001'/111；[11，使溶氧饱和度50%~100%，发酵运彳丁20~ 24h后，得到含有舍雷肽酶的发酵液，发酵液经过离心后去除菌体，上清液再经过盐析、透析 和冷冻干燥后，即可得到舍雷肽酶。7. 如权利要求2所述的应用，其特征在于所述发酵液在4°C条件下5000g离心10min，获 得上清液。8. 如权利要求2所述的应用，其特征在于所述上清液再经过盐析、透析和冷冻干燥方法 为： (1) 往上清液中加入硫酸铵，使其饱和度达到30~45 %，4°C沉淀12~24h，之后于4°C、 8000g条件下离心10min，去除沉淀，收集上清液； (2) 往步骤（1)中经硫酸铵沉淀后所得的上清液中再次加入硫酸铵，使其饱和度达到70 ~80%，4°C沉淀12~24h，之后于4°C、8000g条件下离心10min，弃去上清液，沉淀用pH值8.0 的Tris-HCl缓冲液溶解，获得浓缩液； (3) 将步骤(2)所得浓缩液用截留分子量为14kDa的透析袋，以去离子水为透析液透析 除盐后，于-40°C冷冻干燥，即得到舍雷肽酶冻干酶粉。
【文档编号】C12N1/20GK105969691SQ201610407429
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年6月8日
【发明人】梅建凤, 李靓, 应国清, 易喻, 陈建澍, 张彦璐
【申请人】浙江工业大学