专利名称:肽抗生素的制作方法
本发明涉及新的肽抗生素及它们作为抗微生物和抗肿瘤药物的使用。本发明还涉及到这些抗生素及其中间产物的制备方法和通过发酵制备这些物质的新微生物。
从土壤样品中分离到了各种微生物，并在合成培养基中对它们进行了培养，发现它们能合成具有抗生素活性的产物。从在希腊雅典的巴台农神庙附近收集的土壤样品中，我们分离到了一种新的细菌，K481-B101，并发现它能产生一种具有抗生素活性的混合肽类。
本发明的主要目的是提供可特别作为抗真菌和抗肿瘤药物使用的新的肽抗生素。
本发明的另一个目的是提供制备这些抗生素的合适的方法。
本发明进一步的目的是提供含有这些抗生素的药物组合物。
根据上述目的，本发明是一个具有下述结构式的化合物
其中R代表CH3-(CH2)6、CH3-(CH2)4-CH＝CH(CH2)2或CH3-(CH2)8。
另一方面，本发明包括含有一定数量的单一的或组合的这些化合物的药物组合物，这些化合物是抗真菌和/或抗肿瘤的有效药剂，药物组合物中还含有一种可作为药物接受的载体。
在制备方面，本发明是一种制备具有下述结构式的化合物的方法
其中R代表CH3-(CH2)6、CH3-(CH2)4-CH＝CH(CH2)2或CH3-(CH2)8，该方法包括在好氧条件下，在含有可同化碳源和氮源的营养培养基中培养Polyangium brachysporum sp.nov.，分离产生的菌丝体及从营养培养基中回收化合物。
在组合物方面，本发明包括化合物
它们可作为中间产物用于本发明化合物的制备中，还包括制备这些中间产物化合物的方法。
图1、2和3分别为Bu-2867TA、B和C的红外光谱。
图4和5为Bu-2867TA的1H-核磁共振谱和13C-核磁共振谱。
K481-B101的形态、培养及生理特征是通过Mc Curdy，Jr.H.D.粘细菌目(Myxobacterales)的分类学研究Ⅱ，多囊粘菌属(Polang-ium)和堆囊粘菌科(Sorangiaceae)的死亡Intl.J.Syst.Bacteriol.20∶283～296，1970;Reichenbach，H.∶Nannocystis exedens gen.nov.、sp.nov.，堆囊粘细菌科的一种新的粘细菌Arch.Mikrobiol.70∶119～138，1970;Christensen，P.和F.D.CookLysobacter，一种具有高碱基比率的无子实粘滑细菌的新属Intl.J.Syst.Bacteriol.28∶367～393，1978;Christensen，P.Flavobacterium pectinovo-rum Dorey和Cytophage johnsonae Stanier的同物异名性Intl.J.Syst.Bacteriol.27∶122～132，1977等文中所述方法确定的。通过Peterson，J.E.粘细菌的分离、培养和保持，见于《Methods in Microbiology》3B∶185～210，1969，J.R.Norris及D.W.Ribbons主编，Academic Press(London and New York);Reichenbach，H.及M.Dworkin粘细菌目，见于《Prokaryotes》，卷Ⅰ∶328～355，1981，M，P，Starr等人主编，Springer-Verlag(Berlin，Heidelberg and New York)等文中所述的方法进行保持和纯化。分类位置根据《Bergey′s Manual》，第八版，1974及《The Prokarytes》，卷Ⅰ中的描述确定。
形态学利用casitone-Mg
琼脂、几丁质琼脂、酵母细胞琼脂和兔粪颗粒-水琼脂进行形态学研究。K481-B101是一种革兰氏阴性、没有鞭毛的细菌。营养细胞是两端为钝圆头的圆柱体(0.6～0.8×2～10微米)。在琼脂培养基或软琼脂培养基的潮湿表面上，营养细胞表现出柔性的缓慢滑动。粘孢子与营养细胞明显不同，它们是椭圆体或球形的，0.6～0.8×0.6～1.5微米，不可屈折或可屈折，有时成对存在。K481-B101在大多数所述琼脂培养基上形成由无柄孢子囊包裹的粘孢子。孢子囊为椭圆体、球形或枕形，大小差别较大，为12×20至80×120微米不等，通常由一层共同的包膜或粘液层包裹，双波状轮廓，以单个或成串(sori)的形式存在。表1给出了K481-B101的形态学特征。
培养特征K481-B101在casitone-Mg
琼脂(Mc Curdy，1969)和酵母细胞琼脂(Christensen和Cook，1978)上能正常生长，但不能在Bacto-营养琼脂或Bacto-心浸液琼脂上正常生长。在YP-软琼脂上(0.3%酵母提取物、0.1%蛋白胨、0.01%NaCl、0.3%琼脂、pH6.6～6.8)可观察到假根或羽状菌群，但在casitone-Mg
琼脂上不行。casi-tone-Mg
琼脂上的菌落为圆形的，半透明或呈浅绿黄色，在琼脂中蚀刻、侵入和穿透较轻微。表2给出了培养特征。
生理特征K481-B101水解淀粉、几丁质、白明胶、酪蛋白，但不水解纤维素和琼脂。它溶解经过高压杀死的酵母细胞，但不溶解藤黄细球菌(Micrococcus leteus)的活细胞。K481-B101适于常温，并对于2%Na Cl敏感。表3给出了生理特征。
鞭毛细菌的共存及自发变种的产生在最初培养中观察到革兰氏阴性、杆状鞭毛细菌的共存。利用粘孢子或子实体，结合使用常规的稀释及用声处理、热休克处理或抗生素敏感性处理(如用50微克/毫升的pipemidic acid)分离单个细胞的技术，使K481-B101得到了相当好的纯化。未纯化的K481-B101的培养物产生粘液状变种，它们形成带白色的具菌群环的圆丘形菌落。这些粘液状变种的营养细胞比母本菌株略大，为0.8～1.0×2.0～3.5微米。孢子囊串(sorus)主要是由粘液状变种形成。
分类位置
K481-B101是一种具子实的粘滑细菌，从土壤样品中分离得到。该菌株的主要鉴别性状如下营养细胞1)直径一致的圆柱体状2)顶端不逐渐变细3)可透入琼脂基质4)不吸附刚果红粘孢子1)从营养细胞分化而来2)椭圆体或球形3)不可屈折或可屈折孢子囊1)无柄2)椭圆体、球形或不规则的3)通常由一层共同包膜或粘液层包裹4)双波状轮廓5)浅黄色(缺乏清晰可辨的颜色)6)以单个或成串(sori)的形式存在培养及生理性状1)金黄色至苍白色的菌落2)菌落在琼脂中蚀刻、侵入及穿透较轻微3)水解几丁质，但不水解纤维素4)溶解酵母细胞，但不溶解藤黄细球菌K481-B101的上述形态、培养和生理性状表明，K481-B101应分入粘细菌目。根据营养细胞端头逐渐变尖和子实体形态的性状来看，粘细菌目中的粘球菌属(Myxococcus)、原囊粘菌属(Archangium)和孢囊杆菌属(Cystobacter)与K481-B101有区别。蜂窝囊菌属(Melittangium)、标记菌属(stigmatella)和软骨霉状菌属(Chondromyces)由于孢子囊有柄而不同于K481-B101。
K481-B101与多囊粘菌属和侏囊菌属(Nannocystis)相似。在椭圆体和球形粘孢子、椭圆体或球形单孢子囊的形成方面，K481-B101与侏囊菌属相似，K481-B101与囊菌属的区别在于，直径一致的圆柱体营养细胞和缺乏在琼脂中蚀刻、侵入和穿透的能力。在具有钝圆头的圆柱体营养细胞、不可屈折的粘孢子和椭圆体或球形、双波轮廓孢子囊的显著形成方面，K481-B101与多囊粘菌属相似。在对粘细菌目各属进行比较研究所得结果的基础上，认为K481-B101应作为一个种分入多囊粘菌属。在多囊粘菌属的种中，P.leteum在营养细胞的大小、孢子囊的颜色和形状以及营养菌落的颜色等方面与K481-B101相似。然而，K481-B101在非常紧缩的椭圆体或球形粘孢子以及不能溶解活细菌细胞如藤黄细球菌的细胞等方面，与P.leteum不同。
因此，K481-B101被断定为粘细菌目、多囊粘菌科的多囊粘菌属中的一个新种，并提议命名为Polyangium brachysporum sp.nov.。典型菌株编号为K481-B101(单细胞分离)，培养物已寄存于美国典型培养物收集中心，登记号为ATCC53080。
表1.K481-B101的形态学营养细胞革兰氏阴性。两端为钝圆头的圆柱体(0.6～0.8×2.0～10微米)。不吸附刚果红。
粘孢子可与营养细胞相区别。收缩得多，变为椭圆体成球形，0.6～0.8×0.6～1.5微米，不可属折。长时间培养产生可屈折的粘孢子。
孢子囊无柄，以单个或成串形式存在。椭圆体、球形、枕形或无固定形状。大小变化很大，12×20至80×120微米。由一层共同的包膜或粘液层包裹。双波状轮廓。包理于琼脂之中。二至十个或更多的孢子囊串总长范围为50至300微米。
小菌落在几丁质琼脂上培养2星期之后。营养细胞链周边为栅栏状或锯齿状排列。可观察到单个细胞的滑动，但看不到细胞群的滑动。
表2.K481-B101菌落在casitone-Mg
琼脂(Mc-Curdy，1969)上于28℃培养6天后的形状形状圆形表面光滑，后期有部分皱折正视隆起边缘完全或部分不规则，没有如舌形、羽毛形或假根形的明显突出光学性质半透明或不透明菌落颜色淡绿黄色可扩散色素无在几丁质琼脂上于28℃下培养3星期以后。
薄的，半透明，淡黄或无色。厚的，不透明，周边白中带黄色。在周边形成同心的孢子囊。在琼脂中蚀刻、侵入和穿透较轻微。
表3.K481-B101的生理性状水解性质可溶淀粉 +土豆淀粉 +羧甲基纤维素钠 +纤维素 -琼脂 -几丁质 +藻酸钠 -聚果胶酸钠 -白明胶 +
酪蛋白 +生长基质Simon氏柠檬酸盐琼脂 -Christensen氏柠檬酸盐琼脂 -葡萄糖铵盐琼脂 -灭冬酰胺铵盐琼脂 +生成产物吲哚 -H2S +3-羟基-2-丁酮(VP-反应) -脲酶 +氧化酶 +过氧化氢酶 +溶解能力藤黄球细菌的PCI1001和 -ATCC9341菌株的活细胞 +高压杀死的酵母细胞 +反应牛奶凝固 -牛奶胨化 +Na Cl耐受力生长1.0%或更少的Na Cl不生长2.0%或更多的Na ClpH耐受力生长范围pH5.5～10.5勉强生长pH5.0不生长pH4.5和11.5生长温度最佳生长37℃
生长范围15℃～42℃不生长10℃和45℃氧化或发酵反应氧化的(Hugh和Leigson培养基)抗生素生产Polyangium brachysporum K481-B101的原种培养物于28℃下斜面琼脂培养基上增殖三灭，培养基组成为0.5%可溶淀粉、0.5%葡萄糖、0.1%肉提取物、0.1%酵母提取物、0.2%Nz-case)、0.2%NaCl、0.1%CaCO3和1.6%琼脂(pH7.0)。将生长良好的琼脂斜面用来给营养培养基接种，该培养基组成为2%玉米淀粉、3%大豆粉、0.3%Mg SO4·7H2O和1%Ca CO3(灭菌前pH7.0)。在旋转摇床(250rpm)上于28℃下培养3天后，将5毫升生长物转移至500毫升的Erlenmeyer氏瓶中，该瓶中含有100毫升与营养培养基组成相同的生产培养基。
用盘状纸片琼脂扩散法监测抗生素的生产，用白色念珠菌(Candidaalbicans)A9540菌株作为测试生物。发酵在旋转摇床上于28℃下持续进行四天后，抗生素生产量达到100微克/毫升的最大值。
还使发酵在搅拌-旋转发酵罐中进行。将通过玻璃瓶发酵得到的原种培养物500毫升，用来给容量为20升的容器中的10升生产培养基接种。发酵在28℃下进行，并伴以250rpm的搅拌和每分钟10升的通气。发酵四十小时后，抗生素生产量达到150微克/毫升的最大值。
抗生素的分离与纯化将发酵肉汤(48升)借助于沙氏离心机进行离心。菌丝沉淀块与7升甲醇进行匀浆，将混合物搅动一小时。通过过滤去除不溶物后，将甲醇提取液蒸发成水溶液，将此水溶液与肉汤过滤液合并并用正丁醇(24升)萃取。萃取液浓缩至0.5升，在搅拌下将其倾入正己烷(3.5升)中以沉淀粗制抗生素(41克)。将此固体在硅胶C-200(760毫升)柱上进行层析，用乙酸乙酯和含量逐渐上升的甲醇(0～50%)进行洗脱。用白色念珠菌A9540菌株作为测试生物通过盘状纸片测试法检测洗脱物的生物活性。合并活性部分并进行蒸发直至产生BU-2867T复合物的浅黄色粉末(13克)。将200毫克此固体在反相柱(C18，100毫升)上进行层析，用乙醇-水(3∶7至5∶5)作为洗脱液。用抗真菌生物测试法和薄层层析法(硅化的，EtoH∶H2O＝55∶45)监测洗脱物。将第一活性部分合并并进行减压蒸发以产生BU-2867 TA的纯白固体(61毫克)，使此固体在含水甲醇中结晶产生无色针状晶体(34毫克)。蒸发第二和第三活性部分分别产生BU-2867 TB(1毫克)和C(11毫克)。BU-2867 TC以细小针状从甲醇中结晶出来。重复上述反相层析过程总共产生3.9克BU-2867 TA、44毫克BU-2867 TB和342毫克的BU-2867 TC。
抗生素的特征鉴定BU-2867 TA和C以无色针状结晶分离出来，而BU-2867 TB是以白色无定形粉末形式得到的。它们易溶于甲醇、乙醇、正丁醇和二甲基亚砜，微溶于氯仿、乙腈和乙酸乙酯，基本上不溶于正己烷和水。它们对于Rydon-Smith测剂呈阳性反应，在薄层层析上喷洒碘或硫酸呈染色反应。它们对于茚三酮、Sakaguchi、蒽酮和Dragendorff反应为阴性。通过质谱分析和微量分析，BU-2867 TA、B和C分别确定为C27H44N4O6、C29H46N4O6和C29H48N4O6。这三种成分在甲醇中的紫外光谱在261nm处显示出单吸收峰，此峰在酸性或碱性溶液中不发生漂移。BU-2867 TA、B和C的物理化学数据概括于表4中。它们在KBr中的红外光谱(图1、2和3)表明在1630和1540cm-1附近有很强的酰胺带，在3300cm处有OH和/或NH吸收带。BU-2867 TA的1H-核磁共振谱(图4)揭示出有六个烯属质子的存在(δ6.16、6.20(2H)、6.28、6.49和7.09ppm)和四个酰胺质子的存在(δ7.49、7.82、7.87和8.72ppm)。图谱中还可观察到二个甲基基团(δ0.93ppm，t和1.07ppm，d)。BU-2867 TA的13C-核磁共振谱(图5)显示出23个以上的碳原子信号，包括四个羰基碳、六个烯属碳和三个甲基碳。BU-2867 TB和C的13C-核磁共振谱与BU-2867 TA的非常相似，只是BU-2867 TB中比BU-2867 TA中多两个烯属碳原子，BU-2867 TC中比BU-2867 TA中多两个亚甲基碳原子。
用6NHCl对BU-2867 TA进行回流加热16小时。通过乙酸乙酯萃取去掉亲脂性产物(V)后，将水解物浓缩成油状残渣并在Dowex50W×4离子交换树脂上进行层析，用吡啶-甲酸-乙酸缓冲液(0.1～0.2M，pH3.1～5.1)展层。通过茚三酮试剂监测，分离依次洗脱的四种氨基酸Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ并以盐酸化物的形式结晶。氨基酸Ⅰ(在5NHCl中，〔α〕25D-12.7°)通过其物理化学性质鉴定为L-苏氨酸。氨基酸Ⅱ的1H-核磁共振谱和电子撞击质谱(EI-MS)(M++1m/z 134)表明它是4-氨基-3-羟基-正戊酸的非对映异构体的混合物，参见Konishi，M.;K.Saito，K.Numata，T.Tsuno，K.Asama，H.Tsukiura，T.Naito和H.KawaguchiTollysomycin，一种与bleomycin相关的新的抗生素复合物Ⅱ.tallysomycin A和B的结构确定J.Antibiotics30∶789～805，1977，通过与真实样品直接比较证实了对它的鉴定。通过元素分析和电子撞击质谱分析(M+m/z 115)，氨基酸Ⅲ的分子式确定为C5H9NO2。它的H1-核磁共振谱显示它含有一个甲基(δ1.50ppm，d，J6.0Hz)、一个次甲基(δ4.0～4.2，m)和两个反式烯属质子(δ6.05ppm，d，J15.0Hz和6.57ppm，d-d，J6.0和15.0Hz)。这些图谱数据清楚表明Ⅲ是4-氨基-2(E)戊烯酸，参见Honore′，T.;H.Hjeds，P.Krogsgaard-Larsen和T.R.Christiansenγ-氨基丁酸(GABA)类似物的合成与结构活性研究Eur.J.Med.Chem.，13429～434，1978。根据Ⅲ的比旋光度(在5NHCl中，〔α〕22.5D-6°)，它被确定为是2(S)-构型。氨基酸Ⅳ根据其元素分析(C6H14N2O3)、电子撞击质谱(M+1m/z 163)、1H-核磁共振谱(δ1.8～2.1ppm 4H，m，3.18ppm，2H，t和3.6～4.3ppm，2H，m)和用6NHC处理后γ-内酯化合物的形成(Vc＝01770cm-1)等确定为4羟基赖氨酸。Izumiya，N.;Y.Fujita，F.Irreverre和B.Witkop叠-γ-羟基-L-赖氨酸的合成及其在胶原蛋白中的缺乏Biochemistry42501～2506，1965中报道了4-羟基-赖氨酸的变旋作用及在Ⅳ中观察到的漂移表明了叠-4-构型。因此，氨基酸Ⅳ的结构被确定为叠-4-羟基-L-赖氨酸。
上述酸水解中得到的亲脂的酸性部分(Ⅴ)用重氮甲烷处理，经过层析纯化后产生油状的甲基酯(Ⅵ)。Ⅵ的紫外光谱(λMe OHmax260nm，ε22，000)、电子撞击质谱(M+m/z 210)和1H-核磁共振谱(四个-CH＝、一个C-CH3和六个-CH2-)表明它是甲基-2，4-十二碳二烯酸酯。偶合常数的幅度清楚地表明两个双键都是反式构型。因此原来的酸Ⅴ是2(E)，4(E)-十二碳二烯酸，参见Burden，R.S.和L.Crom-bie.蔬菜来源的酰胺第Ⅶ部分来自Anacyclus pyrethrum D.C.(菊科Comopsitac)的烷烃-2，4-二烯酸酪胺-酰胺 J.Chem.Soc.(C)，19692477～2481，1969。
ⅠL-苏氨酸
Ⅱ4-氨基-3-羟基-正戊酸
Ⅲ4(S)-氨基-2(E)-戊烯酸
Ⅳ叠-4-羟基-L-赖氨酸
Ⅴ2(E)，4(E)-十二碳二烯酸CH3-(CH2)6-CH＝CH-CH＝CH-COOHBU-2867 TA的分子式为C27H44N4O6，并在13C-核磁共振谱中显示出具有六个烯属碳原子和四个酰胺碳原子。因此很明显，氨基酸Ⅱ是在酸解过程中通过天然氨基酸Ⅲ的水合反应产生的后生物。由于抗生素对茚三酮反应为阴性，并且在电势滴定中不表现滴定功能，因此，它可能是一种环肽。BU-2867 TA在吡啶中进行乙酰化后给出双一氧一乙酰基衍生物(电子撞击质谱M+＝m/z604，1H-核磁共振谱2.02ppm，3H和2.08ppm，3H)的事实进一步支撑此推论。乙酸酯的质谱也在m/z 179和322处表现出较强的离子碎片，这提示在抗生素中含有Ⅴ→Ⅰ→的序列。
使BU-2867 TA在0.01M的磷酸盐缓冲液(pH7.0)中经受无花果蛋白酶的酶解作用。酸化至pH2.2后，用正丁醇萃取反应混合物可得到一种酸性化合物(Ⅶ)。在pH10.0时用正丁醇接着萃取水相给出一种茚三酮阳性物质(Ⅷ)。化合物Ⅶ通过红外光谱(Vc＝01720和1650cm-1)、电子撞击质谱(M+-H2Om/z 297和M+-Thrm/z 179)与1H-核磁共振谱表明是2，4-十二碳二烯基-苏氨酸(Ⅴ→Ⅰ)。Ⅶ在6NHCl中水解后产生Ⅰ和Ⅴ的事实进一步确定了此结构。使化合物Ⅷ在6NHCl中回流后，薄层层析表明它产生氨基酸Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ。在Ⅷ的电子撞击质谱中，在m/z 241处发现的分子离子表示有环肽结构的存在。1H-核磁共振谱(270 MHz，在DMSO-d6中)在7.43ppm(三连峰)和9.10ppm(宽峰)处显示出两个酰胺NH质子，这与上述环式结构是一致的。完全解偶合的实验揭示，Ⅲ的氨基和Ⅳ的ε-氨基与羰基相连形成酰胺，而Ⅳ的α-氨基是游离的。因此，Ⅶ和Ⅷ的结构确定为如下所示
用木瓜蛋白酶或木瓜凝乳蛋白酶使BU-2867 TA进行酶解或水解后也可得到化合物Ⅶ和Ⅷ。使BU-2867 TA(4克)和木瓜蛋白酶(Sigma P-3375，50克)的混合物在20升10%的含水甲醇中于28℃下搅拌22小时。然后，用乙酸将混合物酸化至pH3.3并用乙酸乙酯(10升)萃取。蒸发萃取液给出一油状物(6.3克)，用CH2Cl2和甲醇的混合物(9∶1)使其在硅胶(Wakogel C-200，250毫升)上层析产生半纯化的油状化合物Ⅶ(3.3克)。用葡聚糖凝胶LH-20进一步层析油状物，然后进行结晶，给出纯化Ⅶ的无色针状结晶。1.15克(产率50%)。熔点90～91℃。〔α〕27D+17.4°(C0.5，Me OH)，分析计算得到C16H27NO4·H2OC60.93、H9.27、N4.44。发现C61.34、H9.03、N4.20。电子撞击质谱m/z 279(M+-H2O)。紫外线光谱λMe OHmaxnm(ε)260(28，000)。红外光谱Vmax(KBr)cm-13520、3410、3300、1720、1690、1655、1630等。1H-核磁共振谱(80MHz，DMSO-d6)δ0.88(3H，t)、1.06(3H，d)、6.20(3H，m)、7.00(1H，m)、7.84(1H，d，NH)等。
用乙酸乙酯萃取后，使酸性水相溶液浓缩至干燥。将残渣(36克)溶于50毫升水中，调整pH9.0并上反相二氧化硅柱(C18，Merck，1.6升)，用水展层。合并含有化合物Ⅷ的洗脱部分进行真空浓缩。残渣用50%含水甲醇在葡聚糖凝胶LH-20(250毫升)柱上层析，然后用酸性水(pH3.0的稀释HCl)在反相二氧化硅(C18)柱上层析，这样可产生纯化Ⅷ的盐酸化物。747毫克(产率35%)。熔点190℃(dec.)。〔α〕26D-113°(C0.5，H2O)。电子撞击质谱m/z 241(M+)。紫外光谱末端吸收。红外光谱Vmax(KBr)cm-13400、1660、1620、1530等。1H-核磁共振谱(80MHz，DMSO-d6)δ1.27(3H，d)、1.4～1.8(4H)、2.98(2H，m)、4.52(1H，m)、6.19(1H，d)、6.45(1H，d-d)、7.43(1H，t，NH)、9.46(1H，d，NH)。分析计算得到C11H9N3O3·HCl·H2OC44.67、H7.50、N14.21、Cl 11.99。发现C45.04、H7.82、N13.81、Cl 12.55。
由于BU-2867 TA对茚三酮阴性并且没有表现出任何滴定的基团，则可合理地推断其结构是由Ⅶ和Ⅷ通过肽键连接而构成的。
用6NHCl加热时，BU-2867 TB和C二者都产生与从BU-2867 TA中所得相同的氨基酸复合物。从水解物中萃取出两种抗生素的脂肪酸部分，用重氮甲烷处理并以甲酯Ⅸ(从BU-2867 TB中)和Ⅹ(从BU-2867 TC中)的形式分离出来。它们保留有在其母体抗生素中观察到的特性外吸收峰(λMe OHmax260nm)。Ⅸ的电子撞击质谱在m/z 236处产生一个分子离子，提示有一个具有三个双键的C14-酸性酯。紫外光谱和1H-核磁共振谱清楚地表明分离的Ⅸ中有2(E)，4(E)-二烯酸结构和三个双键。Ⅸ的臭氧分解后跟着进行臭氧化物的还原分解产生正己醛，将其分离后被鉴定是2，4-二硝基苯-腙(电子撞击质谱M+m/z 280)。这些证据确定Ⅸ是甲基2(E)，4(E)，8-十四碳三烯酸酯。发现酯Ⅹ的分子量(电子撞击质谱M+，m/z 238)比Ⅵ的分子量高28个(C2H4)单位，这反映了在BU-2867 TA和C之间观察到的分子式差别。这一点与1H-核磁共振谱和紫外光谱数据相结合，则揭示出Ⅹ是甲基2(E)，4(E)-十四碳二烯酸酯。上述实验结果表明BU-2867 TA、B和C的结构如下示
BU-2867 TA R＝CH3-(CH2)6-BU-2867 TB R＝CH3-(CH2)4-CH＝CH-(CH2)2-BU-2867 TC R＝CH3-(CH2)8-
用假单孢菌(Pseudomonas)酰基转移酶对BU-2867 T进行酶解，得到与上述用无花果蛋白酶或木瓜蛋白酶水解所得到的不同的产物。使假单孢菌Pa-129菌株在10升含有2%可溶淀粉、0.2%葡萄糖、3%大豆粉、1%CaCO3和0.3%MgSO4·7H2O的培养基中于37℃下发酵3天，通过离心收集细胞。用盐水(1升)洗涤两次后，将细胞再悬浮于0.75升的盐水中。将细胞悬浮液与预先用高压灭菌过的藻酸钠(75克)和羧甲基纤维素(75克)的悬浮液(1.5升)混合，混合物在搅拌下倒入30升0.1MCaCl2溶液中。包埋在细胞中的凝胶通过与25%的戊二醛溶液搅拌而硬化，然后装柱(4.0×175厘米)。使BU-2867 TA(1.5克)的20%含水甲醇(30升)的溶液以0.4～0.8升/小时的流速过柱。然后，将合并的流出液连续过Amberlite IRC-50(70%NH+4形式，pH6.7，300毫升)和HP-20(300毫升)的柱。用水洗IRC-50的柱，然后用1.5NNH4OH展层。合并茚三酮阳性部分，浓缩和冷冻干燥后产生淡黄色固体(800毫克)，将此固体上反相二氧化硅(C18，250毫升)柱。在中压下用水使柱展层，合并并浓缩茚三酮阳性洗脱物产生L-苏氨酰环胺的白色固体(Ⅺ，612毫克)。产率62%。熔点170℃，〔α〕27D-157℃(C0.5，H2O)。电子撞击质谱m/z 342(M+)。紫外光谱末端吸收。红外光谱Vmax(KBr)cm-13350、3280、1650、1620、1530等。1H-核磁共振谱(80MHz，DMSO-d6)δ1.05(3H，d)、1.21(3H，d)、1.4～2.2(4H)、4.35(2H，m)、4.47(1H，m，OH)、4.62(1H，d，OH)、6.16(1H，d)、6.42(1H，d-d)、7.36(1H，t，NH)、7.97(1H，d，NH)、8.62(1H，d，NH)。
上述得到的HP-20柱先用水(1升)、然后再用0.1N NaOH和甲醇的混合物(1∶2)展层。合并含有2，4-十二碳二烯酸(Ⅴ)的部分，浓缩至300毫升后酸化至pH2.0。此溶液用乙酸乙酯(300毫升)和正丁醇(100毫升)萃取。蒸发乙酸乙酯萃取液产生一油状残渣，将此残渣在葡聚糖凝胶LH-20柱(800毫升)上层析。用甲醇洗脱时，测定260nm处的紫外吸收以监测洗脱物，使需要部分浓缩产生纯化Ⅴ的无色块状物(259毫克)。产率53%。熔点48～49℃。紫外光谱λMe OHmaxnm(ε)258(24，000)红外光谱Vmax(KBr)cm-11680、1630、1605、1410、1300等。1H-核磁共振谱(80MHz，CD3OD)δ0.89(3H，t)、2.0(10H)、2.12(2H，m)、5.75(1H，d)、6.16(2H，m)、7.21(1H，m)。此化合物与从BU-2867 TA的酸解得到的2，4-十二碳二烯酸一致。使正丁醇萃取液进行真空浓缩和冷冻干燥，以回收起始物质BU-2867 TA(160毫克，11%)。
从上述讨论可以清楚地看出，对于本发明各种抗生素化合物的制备来说，化合物Ⅷ和Ⅺ是很有价值的中间产物。例如，用一种羧酸和一种烷基酸式碳酸酯(HOCOOR)的混合酸酐进行常规乙酰化，可形成必需的肽键，参见《Advanced Organic Chemistry》，Fieser和Fieser，1039～1046页，Reinbold出版公司，纽约，1965。可用任何合适的方法保护羟基，例如，以四氢吡喃基或叔丁基酯类的形式。Ⅷ的胺基与下列羧酸进行乙酰化。
分别产生BU-2867 TA、B和C。例如，通过偶联Ⅶ和Ⅷ制备BU-2867TA。使Ⅶ(15毫克)、N，N′-二环己基碳二亚胺(10毫克)和1-羟基-1，2，3-苯并三唑基(8毫克)的混合物在2毫升二甲基甲酰胺中于室温下搅拌两小时。然后，向混合物中加入化合物Ⅷ(10毫克)，继续搅拌过夜。将溶液浓缩成残渣后上反相二氧化硅(C18，40毫升)柱层析，用80%甲醇洗脱。蒸发活性洗脱物，残渣通过制备高效液相层析(柱SSD-ODS-842，移动相90%含水甲醇)纯化。蒸发活性峰部分产生BU-2867 TA(7.4毫克，产率28%)，它在所有方面都与天然抗生素一致。薄层层析(硅化的，Et OH-H2O＝55∶45)Rf值0.45。高效液相层析(Lichrosorb RP-18，Et OH-H2O＝65∶35)保留时间6.43分钟。
BU-2867 TA也能通过偶联Ⅴ和Ⅺ来制备。使Ⅴ(3.4毫克)、N，N′-二环己基碳二亚胺(3.7毫克)和1-羟基-1，2，3-苯并三唑(2.8毫克)的二甲基甲酰胺溶液(1毫升)在室温下搅拌2小时。向溶液中加入Ⅺ(5毫克)，使混合物继续保持在搅拌下3小时，然后进行真空浓缩。将残渣溶于甲醇中，然后通过制备高效液相层析纯化，使用的柱和移动相与上述相同。BU-2867 TA4毫克，产率45%。通过直接比较确定了它与天然BU-2867 TA的一致性。
利用常规方法可从化合物Ⅷ制备化合物Ⅺ。向搅动着的N-t-丁氧基羰基-L-苏氨酸(44毫克)、N，N′-二环己基碳二亚胺(40毫克)和1-羟基-1，2，3-苯并三唑(30毫克)的二甲基甲酰胺混合溶液(4毫升)中于室温下加入Ⅷ(40毫克)。混合物在真空中浓缩至残渣，将残渣上反相二氧化硅(C18，40毫升)柱进行层析，用甲醇和水的混合物(比例1∶9至2∶3)洗脱。合并需要部分，进行真空浓缩和冷冻干燥后产生N-丁氧基羰基-L-苏氨酰-Ⅷ(二丁氧基羰基-Ⅺ)。51毫克，产率69%。VKBrc＝01690和1640cm-1。1H-核磁共振谱(80MHz，在DMSO-d6中)δppm1.00(3H，d)、1.22(3H，d)、1.35(9H，S)、6.11(1H，d)、6.33(1H，d-d)等。将丁氧基羰基-Ⅺ(36毫克)和甲酸(1毫升)的混合物于室温下搅拌1小时。将其浓缩，用水(1毫升)稀释，调整pH到10.0后上反相二氧化硅(C18，20毫升)柱。用水展层时，以茚三酮测试法监测洗脱物，合并需要的洗脱物进行冰冻干燥，产生白色固体Ⅺ。25毫克，产率88%。VKBrc＝01650cm-1。在DMSO-d6中的1H-核磁共振谱δppm1.04(3H，d)、1.22(3H，d)、6.14(1H，d)、6.42(1H，d-d)、7.35(1H，t，NH)、7.98(1H，d，NH)、8.65(1H，d，NH)等。电子撞击质谱M+m/z 342。
因此，有可能使化合物Ⅷ和Ⅺ与合适的羧酸反应而制备本发明的抗生素化合物，不管它们的来源如何。而且，利用化合物Ⅷ和Ⅺ，即根据本发明的、尤其是那些通过较高产率产生的化合物，可用来制备本发明的其它化合物。例如，通过发酵以较高的产率得到的BU-2867 TA，可用来通过酶促水解作用和与合适羧酸的偶联如上述制备BU-2867 TB和BU-2867TC。
如上述通过发酵得到的BU-2867 T的产率及A、B和C的分布，可通过向正在培养Polyangium brachysporum K481-B101的培养基中加入各种油脂和某种表面活性剂加以改变。例如，加入大豆油、玉米油、橄榄油、氢化植物油、猪脂和牛脂可提高所获BU-2867 T的总产率，牛脂的提高程度稍小一些。亚油酸(C18∶2)含量较高的油脂，如大豆油、玉米油和猪脂，提高BU-2867 TB的生成比例。油酸(C18∶1)含量较高的油如橄榄油，提高BU-2867 TC的生成比例。氢化植物油富含硬脂酸(C18∶0)，它仅提高BU-2867 TA的生成量。
抗微生物活性通过一系列琼脂稀释的方法，确定了BU-2867 TA、B和C对于各种微生物的最小抑菌浓度(MICs)。细菌使用营养琼脂(Eiken)，真菌使用Sabouraud葡萄糖琼脂(Difco)。细菌接种物的浓度调整至104CFU/毫升，真菌的则调整至105～107CFU/毫升。
表5给出了BU-2867 TA、B和C的离体抗菌活性。组分A和C在50微克/毫升时不抑制革兰氏阳性和阴性细菌的生长，而组分B对于某些革兰氏阳性细菌显示出适中的抑制活性。
BU-2867 T各组分的抗真菌活性示于表6中。组分C对于具有临床重要性的病原真菌表现出很强的抗真菌活性，如白色念珠菌、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、须发癣菌(Trichophyton mentagrophytes)和刺囊毛霉(Mucor spin-osus)。组分A和B比组分C的活性稍低，但它们的抗真菌谱与组分C的相似。
表5.BU-2867 T各组分的抗菌谱MIC(微克/毫升)BU-2867 TA BU-2867 TB BU-2867 C革兰氏阳性生物
209P ＞50 25 ＞50金黄色酿脓葡萄球菌
(Staphylococcus aureus)″ ″ Smith ＞50 3.1 ＞50″ ″ Bx-1633 ＞50 50 ＞50表皮葡萄球菌 D153 ＞50 6.3 ＞50(Staphylococcus epidermidis)″ ″ A22152 ＞50 50 ＞50粪链球菌 A9612 ＞50 ＞50 ＞50(Staphylococcus faecalis)藤黄细球菌 PCI-1001 ＞50 50 ＞50枯草杆菌 PCI-219 ＞50 50 ＞50(Bacillus subtilis)革兰氏阴性生物大肠埃希氏杆菌 HIHJ ＞50 ＞50 ＞50(Escherichia coli)肺炎杆菌 D-11 ＞50 ＞50 ＞50(Klebsiella pneumoniae)奇异变形杆菌 A9554 ＞50 ＞50 ＞50(Proteus mirabilis)普通变形杆菌 A94336 ＞50 ＞50 ＞50(Proteus vulgaris)Morganella morganii A9553 ＞50 ＞50 ＞50
粘质沙雷氏菌 A20222 ＞50 ＞50 ＞50(Serratia marcescens)Enterobacter cloacae A9659 ＞50 ＞50 ＞50绿脓假单孢菌 A9930 ＞50 ＞50 ＞50(Pseudomonas aeruginosa)培养基营养琼脂表6.BU-2867 T各组分的抗真菌谱MIC(微克/毫升)测试生物 BU-2867 A BU-2867
BU-2867白色念珠菌 IAM4888 3.1 3.1 1.6白色念珠菌 A9540 1.6 1.6 0.8新型隐球菌 D49 25 25 3.1新型隐球菌 IAM4514 25 25 3.1烟曲霉 IAM2530 1.6 3.1 0.8烟曲霉 IAM2034 1.6 3.1 0.8黄曲霉 FA21436 25 25 50(Aspergillus flavus)串珠镰孢 A2284 ＞50 ＞50 ＞50(Fusarium mopiligorme)稻梨孢 D91 ＞50 ＞50 ＞50(Piricularia oryzae)须发癣菌 D155 25 12.5 1.6须发癣菌 ＃4329 25 12.5 6.3皮炎牙生菌 IFO8144 50 50 ＞50(Blastomyces dermaditis)申克氏孢子丝菌 IFO8158 ＞50 ＞50 ＞50(Sporothrix schenckii)Petriellidium boydii IFO8073 ＞50 ＞50 50刺囊毛霉 IFO5317 1.6 0.8 0.2培养基Sabouraud葡萄糖琼脂抗肿瘤活性利用雌性CDF1和雄性BDF1小属确定了BU-2867 TA、B和C的抗肿瘤活性。通过分别给每只小鼠腹膜内注射0.8毫升含有106和105个细胞的稀释腹水，给小鼠接种淋巴细胞性白血病P388(CDF1和BDF1小鼠)和淋巴性白血病L1210(BDF小鼠)。在腹膜内植入0.5毫升10%的黑素瘤B16肿瘤浆液(BDF小鼠)。测试物质溶于含有10%二甲基亚砜的0.9%的盐水中，在植入肿瘤24小时后给小鼠腹膜内施用剂量依次变化的测试物质。在实验中用橄榄霉素(NSC38270)或丝裂霉素C作为参照化合物进行比较测试。
进行第一方案处理(在第1、4和7天每天一次)时，BU2867TA和C对P388白血病都表现出抗肿瘤活性。表7给出了所得到的结果，以百分比值的形式表示了试验(T)和对照(C)动物对于各种摄取剂量的存活期中值(MST)的上升。125或更高的百分比值表明具有显著的抗肿瘤效应。
表7.BU-2867 T各组分对于P388白血病的抗肿瘤活性MST的T/C%剂量为毫克/公斤/天，腹膜内施用3 1 0.3 0.1BU-2867 TA 140 130 120BU-2867 TB 165 140 120BU-2867 TC 155 130橄榄霉素 A 140 135 100进行第二方案处理(从第一至第九天每天一次)时，BU-2867 TA和C对于抗P388白血病具有很高的活性;BU-2867 TA对于抗L1210白血病和B16黑素瘤活性较低。表8给出了所得到的结果，也是以百分比值的形式表示了对于各种摄取剂量的存活期中值的上升，125或更高的数值表示具有显著的抗肿瘤效应。
表8.BU-2867 TA和C的抗肿瘤活性MST的T/C%剂量为毫克/公斤/天，腹膜内施用2 1 0.5 0.25 0.13 0.063 0.031P388白血病BU-2867 TA 67 228 186 156 147 136 109BU-2867 TC 234 189 175 159 153 123 100丝裂霉素 C 290 240 170 150 130 115L1210白血病BU-2867 TA 129 118 118 106丝裂霉素 C 140 141 129 129 106B16黑素瘤BU-2867 TA 毒性 125 116 113 100丝裂霉素 C 63 181 163 141 131通过对雄性ddY小鼠腹膜内一次性注射BU-2867 TA和C，测定了它们的急性毒性。LD50的数值分别为8.1毫克/公斤和25毫克/公斤。
本发明具有药理效应的化合物可通过常规的草本药剂学方法加工成药物制剂，以用于口服或非肠道施用，例如用于包括人类在内的哺乳动物。常规赋形剂包括作为药物接受的有机或无机载体物质，它们适于非肠道的、肠道的或局部的应用，而且不与活性化合物发生有害反应。可作为药物接受的合适的载体包括(但不限于此)水、盐溶液、醇类、阿拉伯树胶、植物油类、聚乙烯二醇、白明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、凡士林、芳香油、脂肪酸单酸甘油酯和二酸甘油酯、季戊四醇脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。可以对药物制剂进行灭菌，而且，如果需要，可与下列佐剂混合，例如润滑剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、影响渗透压的盐类、缓冲剂、着色、调味和/或芳香物质及其类似物，它们不与活性化合物发生有害反应。
对于非肠道应用来说，特别适用的是可注射的灭菌溶液，最好是油状液或水溶液，也可是悬浮液、乳化液，或植入物，包括栓剂。安瓿瓶是合适的单位剂量。
对于肠道应用来说，特别适用的是药片、糖衣药丸、栓剂或具有滑石和/或碳水化合物载体或粘合剂或其类似物的胶囊，载体最好是乳糖和/或玉米淀粉和/或土豆淀粉。在制备糖化药用混合物时可使用糖浆、剂或其类似物。可以配制持续释放的组合物，包括那些其中的活性化合物用降解度不同的包膜如微型胶囊、多层包膜等保护的组合物。
一般地说，本发明的化合物以单位剂量的形式配制于包含必需剂量的可作为药物接受的载体中。用药于例如重75公斤的病人时，根据本发明的化合物的剂量一般为5～250毫克/天。对于一给定的受体来说，可以利用常规方法确定合适的剂量和摄取方式，例如，通过有关化合物和已知抗生素或抗肿瘤药物的不同活性的惯常比较，例如，借助于合适的、常规药理学规范的手段。
从前面的描述中，一个本领域的普通专业人员可以很轻易地确定本发明的本质特征，并且，不偏离这些本质特征的要领和范围，他就能对本发明作出各种变化和修饰，使其适应于各种应用和条件。
权利要求
1.结构式为
的化合物，其中R代表CH3-(CH2)6、CH3-(CH2)4-CH=CH-(CH2)2或CH3-(CH2)8。
2.根据权利要求
1的化合物，其中R代表CH3-(CH2)6。
3.根据权利要求
1的化合物，其中R代表CH3-(CH2)4-CH＝CH-(CH2)2。
4.根据权利要求
1的化合物，其中R代表CH3-(CH2)8。
5.一种制备结构式为
的化合物的方法，其中R代表CH3-(CH2)6、CH3-(CH2)4-CH＝CH-(CH2)2或CH3-(CH2)8，该方法包括在好氧条件下，在含有可同化碳源和氮源的营养培养基中培养Ployangium brachysporum sp.nov.，分离生成的菌丝体和从营养培养基中回收该化合物。
6.根据权利要求
5的方法，其中Polyangium brachysporum sp.v.是K481-B101菌株。
7.根据权利要求
6的方法，其中K481-B101菌株进一步以ATCC53080号菌株为特征。
8.根据权利要求
5的方法，其中营养培养基中加入一种脂或油。
9.根据权利要求
5的方法，其中在回收化合物之前用一种有机溶剂萃取分离的菌丝体，然后将萃取液与营养培养基合并。
10.根据权利要求
5的方法，其中通过用一种有机溶剂萃取营养培养基而从中回收化合物。
11.根据权利要求
5的方法，其中利用白色念珠菌(Candida albicans)作为测试生物监测化合物的生产。
12.微生物Polyangium brachysporum sp.nov.。
13.Polyangium brachysporum K481-B101菌株。
14.微生物Polyangium brachysporum sp.nov.的生物纯的培养物。
15.结构式为
的化合物。
16.一种制备结构式为
的化合物的方法，其中该方法包括在无花果蛋白酶、木瓜蛋白酶或木瓜凝乳蛋白酶的存在下水解结构式为
的化合物，其中R代表CH3-(CH2)6、CH3-(CH2)4-CH＝CH-(CH2)2、或CH3-(CH2)8。
17.结构式为
的化合物。
18.一种制备结构式为
的化合物的方法，其中该方法包括在假单孢菌(Pseudomonas)酰基转移酶的存在下水解结构式为
的化合物，其中R代表CH3-(CH2)6、CH3-(CH2)4-CH＝CH-(CH2)2或CH3-(CH2)8。
19.一种抗真菌组合物，它至少包含一种所含剂量对于抗真菌来说是有效的结构式为
的化合物，其中R代表CH3-(CH2)6、CH3-(CH2)4-CH＝CH-(CH2)2或CH3-(CH2)8，还含有一种可作为药物的载体。
20.一种抗肿瘤组合物，它至少包含一种一定数量的结构式为
的化合物，其中R代表CH3-(CH2)6、CH3-(CH2)4-CH＝CH-(CH2)2或CH3-(CH2)8，该化合物作为有效的抗肿瘤药剂包含在一种可作为药物的载体中。
专利摘要
通过培养新微生物Dolyangium brachyspor-um，制备了具有抗生素和抗肿瘤活性的结构式为
文档编号C07K5/00GK86105469SQ86105469
公开日1987年6月10日 申请日期1986年8月29日
发明者小西正隆, 富田康二, 冈正久, 沼田蕙一 申请人:布里斯托尔-米尔斯公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan