一种杆菌肽及其锌盐的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于工业微生物技术领域，具体涉及一种杆菌肽及其锌盐杆菌肽锌的制备 方法。
【背景技术】
[0002] 杆菌肽(Baci tracin)最初是Johnson从患者伤口污染物中分离出的一株枯草芽孢 杆菌，经培养得到的多肽类抗生素。可由枯草芽孢杆菌(baci 1 lus sabti 1 is)和地衣芽孢杆 菌(Bacillus licheniformis)产生。由于其对革兰氏阳性菌有较强的抗菌作用，与金属离 子络合后稳定性增强，抗菌活性更高。该药局部应用刺激小，过敏反应少见，耐酶，细菌对其 产生耐药性又较慢，获得耐药性菌株极为罕见。而且其活性不受脓液、痰液、血液、渗出液和 坏死组织的影响，故迄今常作为局部抗感染药而广泛使用。
[0003] 杆菌肽是由12个氨基酸组成的多肽类抗生素，其中含有一个7个氨基酸构成的环 肽。杆菌肽中含有杆菌肽A、B、C、D、E、F等多个组分，其中杆菌肽A生物活性最强。
[0004] 美国药典对药用杆菌肽各组分含量有严格的规定;其中杆菌肽A(HPLC相对保留时 间为1.0RT)含量不小于40%，杆菌肽Bl、B2、B3、A( 0.7RT，0.7RT，0.8RT，1.0RT)的峰面积之和 不小于70%，杆菌肽BU0.7RT)之前的峰面积之和不得大于20%，杆菌肽F(2.4RT)的峰面积不 大于6%。
[0005] 杆菌肽为多组分产品，美国药典对各组分含量有严格的规定。国内产品由于达不 到国外药典标准多为兽用制品，本产品的提取技术路线国内研究很少，郭淑琴、魏景新发表 的《树脂吸附法提取杆菌肽的研究》(沈阳化工1985.03.02)，使用离子交换法提纯杆菌肽， 可得到纯度54U/mg的杆菌肽，天津大学化工学院研究生刘咏的论文《抗生素杆菌肽锌脱色 提纯工艺研究》利用膜分离技术对杆菌肽锌盐进行纯化精制，最终可使产品效价提高到 50U/mg以上。这两种方法所获得产品的生物活性均不是很高。
[0006] 国外对该产品纯化工艺研究较多，US2,457,887以活性氧化铝或活性炭吸附杆菌 肽进行提取，由于无机介质对活性物质的吸附量很低，该法不适合工业化。US2，498，165和 US2，609，324使用大量有机溶剂多级萃取，有些溶剂毒性较大，该法收率较低，纯化效果也 不明显。US2，739，063以沉淀剂将杆菌肽沉淀到无机载体上，该法收率较低，产品稳定性差。 GB782，999采用羧酸型阳离子交换树脂提取，解析液经溶媒萃取提纯后制备杆菌肽锌，产品 效价可到55U/mg，总收率35%左右，无论产品效价还是总收率均处于较低水平。US2,915， 432使用低交联度羧酸型阳离子交换树脂提取，辅以无机盐沉淀法纯化制备出高效价杆菌 肽锌总收率51%，产品效价可达76U/mg。该法需要使用大量无机盐，回收困难，该法总收率也 偏低。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种操作简便、高效、适合工业化生产的高活性杆菌肽及其 盐杆菌肽锌的制备方法。
[0008] 本发明所提供的杆菌肽的制备方法，包括以下步骤： 1)杆菌肽发酵液以水稀释、加入酸化剂调节pH值为3.0-4.0，过滤，得到杆菌肽滤液。
[0009] 2)将滤液调节PH为6.0-9.0,通过大孔强酸型阳离子交换树脂吸附，再以碱性解吸 剂解吸，得杆菌肽解吸液。
[0010] 3)解吸液通过大孔阳离子交换树脂脱盐，再通过脱色树脂进行脱色，得到脱色液。
[0011] 4)将脱色液以有机溶剂萃取，得萃取液。
[0012] 5 )向萃取液中加入沉淀剂沉淀，经过滤、干燥，得到杆菌肽。
[0013] 其中步骤1)所述酸化剂为盐酸、草酸、醋酸、硫酸中任意一种。其中以草酸和醋酸 更优;调节pH值为3.0-4.0之间，以3.0-3.5为更优。过滤之前加入助滤剂，常用的助滤剂有 硅藻土、珍珠岩等，有助于过滤操作。
[0014] 其中步骤2)所述大孔强酸型阳离子交换树脂为D00UHD8树脂中的任意一种。所用 解吸剂为弱碱性水溶液，该弱碱性水溶液以2%_4%的氨水为优。
[0015] 其中步骤3)所述阳离子交换树脂为001X2、001X7、001X8中的一种。
[0016] 其中步骤3)所述脱色树脂为D315、D304、D301中的任意一种。
[0017]其中步骤4)中所述有机溶剂为正丁醇、异丁醇、乙酸丁酯中的一种，萃取pH为6.0- 8.0。优选萃取pH为6.0-6.5。
[0018] 其中步骤5)所述沉淀剂为丙酮，用量为萃取液体积的5-8倍。
[0019] 本发明还提供了一种由杆菌肽制备杆菌肽锌的制备方法，所述方法由步骤1)到步 骤5)制得的萃取液加入水，加酸化剂调节pH为3.0-5.0,萃取得水相，水相调节pH为7.5-9.0，向水相中加入硫酸锌沉淀，经过滤、干燥制得。
[0020] 其中加酸化剂调节pH为3.5-4.0，其中所述酸化剂为盐酸、草酸、醋酸、硫酸中任意 一种。
[0021 ] 其中萃取得到的水相调节pH为8.0-8.5。
[0022]本发明有效除去了微生物发酵代谢中产生的杂蛋白、色素、多糖等，使杆菌肽的纯 度大幅提高，各种活性组分得到很好的保留，各组分比例达到美国药典标准。整条工艺简便 易行、适合工业化生产。所制备的杆菌肽生物效价到达78U/mg，杆菌肽锌生物效价到达76U/ mg，杆菌肽总收率可达60%以上。杆菌肽锌收率可达到60%，各组分比例符合美国药典标准。 工艺中所用溶剂毒性小、易回收利用，方便工业化生产。
[0023] 具体实施例
[0024] 下述实例仅用于阐述实现本发明的方法，不应理解为对本发明的限制。所有基于 本发明思路做出的修改和变化都应归于本发明的保护范围。
[0025] 本发明所使用的杆菌肽发酵液由华北制药集团新药研究开发有限责任公司提供。 大孔强酸型阳离子交换树脂D001、HD8，上海华震科技有限公司生产；阳离子交换树脂为凝 胶型阳离子交换树脂001乂8、001乂7、001乂2，南开树脂厂生产。大孔弱碱性阴离子交换树脂 D315、D304、D301上海华震科技有限公司生产。正丁醇、乙醇、硫酸锌等试剂均为市售。本发 明使用的高效液相色谱仪为996型检测器，515栗(Waters公司）。
[0026] 实施例1 杆菌肽发酵液15L，发酵单位840U/ml。加入冰醋酸调pH值至4.0，加入珍珠岩助滤剂800 克，过滤，得到杆菌肽滤液。滤液加3%氢氧化钠溶液调节pH6.0后通入大孔阳离子交换树脂 柱HD8进行吸附，树脂装量1L，树脂柱高径比为8:1，流速1.5L/hr。以2%氨水解吸，流速0.5L/ h，当解吸出口有杆菌肽流出时，串联001X8树脂柱和D315树脂柱进行脱盐、脱色，脱盐和脱 色树脂的装量均为500ml。收集含有杆菌肽的脱色液。
[0027] 将上述脱色液以3%氢氧化钠溶液调节pH值至6.0,用正丁醇800 ml分两次萃取， 得到正丁醇萃取液，正丁醇萃取液在50摄氏度下真空浓缩，浓缩液200 ml，加入1600ml丙 酮，杆菌肽沉淀析出。将其过滤、50摄氏度下真空干燥得到杆菌肽精粉98克，生物效价78U/ mg，收率60.7%。杆菌肽A的峰面积占总面积的76.638%，杆菌肽B1之前的峰面积占总面积的 10.998%，杆菌肽 F占 3.446%。
[0028] 实施例2 杆菌肽发酵液8L，发酵单位893U/ml。加入草酸调pH值至3.0，加入珍珠岩助滤剂400克， 过滤，得到杆菌肽滤液。滤液调PH6.5通入大孔阳离