检测博来霉素的双环发夹探针介导免标记链置换扩增方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种博来霉素的检测方法，尤其涉及一种检测博来霉素的双环发夹探 针介导免标记链置换扩增方法。
【背景技术】
[0002] 博来霉素是由链霉素轮枝杆菌分泌产生的一类糖肽类抗生素。临床上，博来霉素 是一种重要的抗癌药物，主要用于治疗鳞状细胞癌以及巨噬细胞瘤等多种疾病（R. H. Blum， S.K.Carter and K.Agre，Cancer，1973,31，903 ;Μ·Froudarakis，E. Hatzimichael， L. Kyriazopoulou，Κ· Lagos，Ρ· Pappas，A. G. Tzakos，V. Karavasilis，D. Daliani， C. Papandreou and E. Briasoulis，Critical Reviews in Oncology/Hematology，2013， 87,90 ;Y.Akiyama，Q. Ma，E.Edgar，A.Laikhter and S. Hecht，Journal of the American Chemical Society?2008?130?9650 ；R. A. Giroux and S. M. Hecht? Journal of the American Chemical Society，2010,132,16987 ;Z.Yu，R. Schmaltz，T. Bozeman，R. Paul， M. Rishel? K. Tsosie and S. Hecht，Journal of the American Chemical Society，2013， 135, 2883.)。但是，应用博来霉素治疗多种癌症，常常伴随产生剂量限制性毒性，比如肾毒 性，肺毒性以及肺纤维化等（S. Slei jfer，Chest，2001，120,617;J. Hay，S. Shahzeidi and G. Laurent，Archives of Toxicology，1991，65,81.) D 因此，为了监测博来霉素浓度，降低 毒性，获得最好的治疗效果，如何构建一种博来霉素检测方法成为分析工作者研究的主要 内容。目前，研究者们建立了多种检测方法用于博来霉素的定量分析，比如高效液相色谱 法（R. P. Klett，J. P. Chovana and I. H. Danse，Journal of Chromatography:Biomedical Sciences and Application?1984? 310? 361 ；G. K. Shiu and T.J.Goehl? Journal of Chromatography B:Biomedical Sciences and Applications，1980,181，127.)，酉每免疫分 析法（K.Fujiwara，M. Yasuno and Τ· Kitagawa，Cancer Research，1981，41，4121)、放射 免疫分析法（J.Teale，J. Clough and V. Marks，British Journal of Cancer，1977, 35， 822 ;A. Broughton and J. E. Strong，Cancer Research，1976, 36,1418.)、以及微生物分析 、法（T. Ohnuma，J. F. Holland，H. Masuda，J. A. Waligunda and G. A. Goldberg，Cancer，33， 1230.)等。但是，这些方法通常具有费时，费力，危害人体健康以及成本较高等缺点。因此， 需要建立一种新的、灵敏的、特异的检测方法，为临床博来霉素浓度监测提供一种更加简单 便捷的分析方案。
[0003] 据报道，在氧气以及具有氧化还原活性的金属离子存在时，博来霉素能够通过氧 化脱氧核苷酸的方法切割DNA链，其主要识别位点为5'-GT-3'以及5'-GC-3'（Q.Ma， Y. Akiyama? Z. D. Xu? K. Konishi and S. M. Hecht? Journal of the American Chemical Society，2009，131，2013;J.Chen，M.K.Ghorai，G. Kenney and J.Stubbe，Nucleic Acid Research，2008, 36, 3781.)。基于博来霉素切割DNA链这一性质，研究者们设计了各种识 别博来霉素的DNA分子探针，以构建一种简单灵敏的博来霉素检测方法。目前，这些DNA 分子探针主要分为两类。第一类是信号分子结合或标记的单链或发夹DNA (B.C. Yin，DJu and B. C. Ye, Analytical Chemistry, 2010,82,8272 ；Y. Li, C. C. Huang, J. B. Zheng, H. L. Qi, ff. Cao and Y. M. Wei, Biosensors and Bioeletronics，2013,44,177 ;Y. F. Qin，Y. F. Ma， X. Jin, L. L. Zhang, G. J. Ye and S. L. Zhao, Analytica Chimica Acta，2015,866,84 ;F. Li， Y. Feng，C. Zhao, P. Li and B. Tang，Chemical Communications，2012,48,127·)。这类探针与 博来霉素作用以后，能够释放信号分子，并产生相应的信号响应。第二类是具有触发序列的 功能颈 _环DNA结构（F.L.Gao，J.P.Lei and H.X.Ju，Chemical Communications，2013,49， 7561.)。这类探针与博来霉素作用以后，能够释放触发序列并触发信号扩增反应，将一次裂 解事件表达为多次重复的信号产生事件。因此，这类DNA分子探针更有利于提高检测方法 的信号强度和灵敏度。Gao等人设计了一个颈部带有两个5' -GC-3'识别位点，环部为一 段触发序列的功能发夹探针，用于博来霉素的高灵敏检测（F.L.Gao，J.P.Lei and H.X.JU， Chemical Communications，2013,49, 7561.)。然而，由于触发序列位于探针的环部，未被切 割的DNA分子探针与后续反应链之间的非特异性杂交，会引起相对较高的背景信号以及假 阳性信号，这在一定程度上限制了该探针的应用。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的就是为了解决上述问题，提供一种检测博来霉素的双环发夹探针介 导免标记链置换扩增方法。
[0005] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0006] -种识别和检测博来霉素的双环发夹探针，所述双环发夹探针包括：两个环部、识 别位点和触发位点，所述两个环部为：具有一个DNA臂的末端环和具有两个DNA臂的颈凸 环，所述识别位点位于双环发夹的颈部，所述触发序列用于触发后续扩增放大反应，所述触 发序列中的碱基参与构成双环发夹探针的DNA臂和颈凸环。
[0007] -种检测博来霉素的双环发夹探针介导免标记链置换扩增方法，当目标物博来霉 素存在时，双环发夹探针在识别位点处发生断裂，并释放触发序列；然后，触发序列与信号 探针的环部相结合，并在聚合酶和切刻酶的作用下，发生链置换扩增反应，产生大量的荧光 染料结合序列，与此同时，引物链延伸将信号探针打开，信号探针颈部封存的荧光染料结合 序列得以暴露，最后，荧光染料结合序列绑定荧光分子，产生荧光信号，通过检测到的荧光 信号对博来霉素进行定量；所述双环发夹探针如权利要求1中所述。
[0008] 优选：所述信号探针颈部的荧光染料结合序列为G-四链体序列，所述荧光分子为 NMM0
[0009] 优选：所述识别位点为5' -GTGC-3'。
[0010] 优选：所述触发序列为 5' -GAGGAAGAAGAGAGGGAAGGA-3'（如 SEQ ID No :1 所示）。
[0011] 优选：所述双环发夹探针的序列为TCC TTC CCT CTC AAA ACC TCG CAC CAA AAG GTG CGA GGA AGA AGA GAG GGA AGG A(如 SEQ ID No :2 所示）。
[0012] 荧光探针的序列为 CCC MC CCG CCC TAC CCT TTT TGA TCC TTC CCT CTC TTC TTC CTC CCT CAA AAA GGG TAG GGC GGG TTG GG (如 SEQ ID No : 3 所示）。
[0013] 优选：链置换扩增反应的具体步骤为：取I yL 2mM dNTPs，lU KF聚合酶，4U Nt. AlwI,3yL 0.75 μ M SP and 2yL 10XNEB buffer2(10mM Tris-HCl, IOmM MgCl2, 50mM NaCl，1.0mM dithiothreitol，pH 7. 9)加入上述反应体系，37°C下反应40分钟，即可。
[0014] 优选：所述扩增方法中，双环发夹探针为ΙΟΟηΜ，信号探针为75nM，DNA聚合酶为 1U，切刻内切酶为4U，NMM浓度为6 μΜ。
[0015] -种检测博来霉素的试剂盒，包括双环发夹探针和信号探针，所述双环发夹探 针如权利要求1中所述；所述信号探针为发夹结构，所述信号探针的颈部具有荧光染料 结合序列；所述双环发夹探针的触发序列与信号探针的环部序列配对，荧光分子，DNA 聚合酶，切刻内切酶，10ΧΝΕΒ buffer2(10mM Tris-HCl，10mM MgCl2,50mM NaCl，1.0mM dithiothreitol，pH 7·9)〇
[0016] 本发明的有益效果：
[0017] 本发明构建了一种双环发夹探针，用于博来霉素的识别和检测。双环发夹探 针主要包含两个区域：博来霉素5' -GTGC-3'识别位点和触发序列。此外，双环发夹探 针具有两个环部，其中具有两个DNA臂的环称为颈凸环。与现有技术中的功能发夹探 针不同，双环发夹探针的触发序列以半封闭的模式封存在探针的颈部，有效避免了非特 异性杂交。半封闭模式，即触发序列中大部分碱基参与构成颈凸环两侧的DNA臂，仅有 一小部分碱基构成颈凸环（例如本发明实施例中用到的双环发夹探针的触发序列为： 5'-GAGGAAGAAGAGAGGGAAGGA-3'，仅仅下划线的部分参与颈凸环，其余构成两侧的DNA臂）。 这种设计模式具有两个突出优势。一方面，双环发夹探针利用分子内杂交的方式沉默触发 序列，有效避免非特异性杂交。另一方面，双环发夹探针发生切割反应以后，生成一个中间 带有颈凸环的双螺旋结构；由于颈凸环降低了双螺旋结构的稳定性，触发序列与其不完全 互补链发生解旋，然后以足够多的碱基数与后续反应链生成稳定的双螺旋，最终产生明显 的阳性信号。基于这一双环发夹探针，并结合链置换扩增（SDA)反应，本发明构建了一个新 型荧光传感平台用于博来霉素检测。该方法通过链置换扩增反应产生大量DNA单链以及 G-四链体/NMM复合物发射荧光，首次实现了基于扩增技术的博来霉素免标记检测。通过单 链DNA产物以及打开的信号探针绑定NMM染料分子产生增强的荧光信号，该方法表现出优 越的灵敏度。方法的检测限为〇. 34nM，该方法具有操作简单，免标记以及特异性好的优势。 此外，实验进行了人血清回收率实验，结果表明该检测方法具有较大的临床应用潜能。
【附图说明】
[0018] 图1为基于双环识别探针以及链置换扩增反应构建的BLM检测体系实验原理图， A.博来霉素切割双环发夹探针，释放触发序列，并在聚合酶的作用下将信号探针打开，暴露 出一段G-四链体序列，B.触发序列与信号探针结合以后，再聚合酶和切刻酶的作用下触发 链置换扩增反应；
[0019] 图2㈧为聚丙烯酰氨凝胶电泳验证博来霉素裂解以及链置换扩增放大反 应；M:DNA ladder ; (I)BHP ; (2)SP ; (3)fflP+BLM ; (4)BHP+