一种用于鉴别谷子品种的ssr分子标记方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于鉴别谷子品种的SSR分子标记方法及应用，属于植物品种鉴 别技术领域。
【背景技术】
[0002] 谷子属禾木科狗尾草属作物，具有生育期短、耐旱、耐瘠等生理特性，广泛分布于 亚欧大陆的温带和热带，是中国黄河中上游地区主要栽培作物之一。同时，谷子营养价值极 高，含有丰富的氨基酸、蛋白质、维生素以及妈、铜、铁、锌、硒、碘、镁等微量元素，营养保健 作用也非常显著。多年来，品种鉴定是以形态学标记为依据的。这种方法虽然简单经济，但 周期长，花费大，受季节限制，而且很多性状的表现受栽培措施及环境因子影响，从而制约 了鉴定的准确性。DNA分子标记技术则具有高效、准确、不受环境条件影响、实验操作简单等 优点，已广泛应用于植物品种真实性鉴定及纯度检测研究。SSR标记是近年来发展起来的建 立在PCR基础上的第二代分子标记。由于SSR分子标记具有数量丰富、多态性高、遗传共显 性、谱带扩增稳定、精度高、检测时间短、技术成熟等特点，已应用于作物遗传学研究。
【发明内容】
[0003] 为解决现有技术的不足，本发明提供了一种用于鉴别谷子品种的SSR分子标记方 法，采用的技术方案如下：
[0004] 本发明的目的在于提供一种用于鉴别谷子品种的SSR分子标记方法，该方法是提 取谷子DNA，利用谷子DNA和5对SSR核心引物进行PCR扩增反应，电泳检测后根据电泳检 测结果鉴别谷子；所述5对SSR核心引物的核苷酸序列如SEQID NO. 1-10所示。
[0005] 优选地，所述方法步骤如下：
[0006] 1)提取谷子DNA ;
[0007] 2)利用步骤1)所得谷子DNA和5对SSR核心引物进行PCR扩增反应，然后进行 8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，银染显色；所述SSR核心引物，每对包括一个正向引 物和一个反向引物，5对SSR核心引物的核苷酸序列如SEQID NO. 1-10所示；所述PCR扩增 反应，包括 10XPCR buffer，25mM MgCl2, IOmM dNTP，10mM 正向引物，IOmM 反向引物，5U/yL Taq 酶，50ng/ μ L 模板 DNA 和 ddH20 ;
[0008] 3)观察步骤2)的电泳结果，统计稳定且易于分辨的差异性条带，谱带按0、1系统 记录，有差异性条带时赋值为1，无差异性条带时赋值为〇,根据记录结果计算遗传相似系 数，鉴别谷子品种。
[0009] 优选地，步骤1)所述提取谷子DNA，是取谷子幼芽，液氮冷冻后于-80°c保存备用， 然后利用植物基因组试剂盒提取谷子DNA。
[0010] 更优选地，所述谷子幼芽，为谷子发芽后l〇d-15d的幼芽。
[0011] 优选地，步骤1)所述谷子，品种为勾根红、龙爪、小白谷、钱串、刀把齐、大粒黄、白 沙谷、气死风、老来变、小金苗、大斗黄、老头背、黄粘谷、大粒黄、水红根、盖州红、鸭子嘴、大 头黄、大白毛、糜子亮、友谊谷、黑粘谷、五爪黄粘谷、四玉红、嘎嘎青、钻头白、紫根白、昌平 谷、双桥富兴庄、小旱谷、耧狸秀、小黄谷、大叶黄谷、紫梗刀把齐、钱串紧谷、四寸红根、红根 绳子头、细皮白谷、母鸡嘴、大满谷、干尖糙、六十天还仓、缰绳头、金苗黄、磨里谷。
[0012] 优选地，步骤3)所述PCR扩增反应，包括 10XPCR buffer，25mM MgCl2，10mM dNTP， IOmM正向引物，IOmM反向引物，5U/ μ L Taq酶，50ng/ μ L模板DNA和ddH20。
[0013] 更优选地，步骤3)所述PCR扩增反应，体系总体积为25yL，其中包括10XPCR buffer 2.5yL，25mM MgCl23yL，10mM dNTP 1.25 4 1^，1〇1111正向引物14 1^，1〇1111反向引物 1 μ L，5U/ μ L Taq 酶 0· 2 μ L，50ng/ μ L 模板 DNAl μ L，ddH20 16. 5 μ L。
[0014] 优选地，步骤3)所述PCR扩增反应，程序为：94°C预变性3min ;94°C变性45s，50°C 退火30s，72°C延伸30s，共30个循环；72°C延伸10min，4°C保存。
[0015] 优选地，所述方法具体步骤为：
[0016] 1)谷子DNA的提取：取发芽后10d-15d的谷子幼芽，液氮冷冻后于_80°C保存备 用，利用植物基因组试剂盒提取谷子幼芽的DNA，获得谷子DNA ;
[0017] 2)PCR扩增和电泳检测：利用步骤1)所得谷子DNA和5对核苷酸序列如SEQID NO. 1-10所示的SSR核心引物进行PCR扩增反应；然后对PCR产物进行8%非变性聚丙烯酰 胺凝胶电泳检测，银染显色；
[0018] 所述SSR核心引物，每对包括一个正向引物和一个反向引物；所述PCR扩增反 应，体系总体积为25 4 1^，其中包括10\?〇?131^€612.5 4 1^，2511111%(：123 4 1^，101111(1犯13 I. 25yL，10mM 正向引物 I yL，10mM 反向引物 I yL，5U/yL Taq 酶 0· 2 4 1^，50即/^14莫板 DNAl μ L，CldH2O 16. 5 μ L ;PCR 扩增反应程序为：94°C预变性 3min ;94°C变性 45s，50°C退火 30s，72°C延伸30s，共30个循环；72°C延伸lOmin，4°C保存；
[0019] 3)观察步骤2)的电泳结果，统计稳定且易于分辨的差异性条带，谱带按0、1系统 记录，有差异性条带时赋值为1，无差异性条带时赋值为〇,根据记录结果计算遗传相似系 数，鉴别谷子品种。
[0020] 以上所述任一方法在鉴别谷子品种中的应用。本发明有益效果：
[0021] 1、本发明利用SSR分子标记对45个谷子品种进行鉴别，结果表明：5对谷子SSR 引物共扩增出33个等位基因，平均每对引物6. 6个等位基因；各引物的多态信息指数为 0. 665~0. 830,平均值为0. 761 ;通过NTsys-pc 2. 11进行各品种间遗传相似系数的计算， 各品种间遗传相似系数在〇. 5758~0. 9394之间，45个谷子品种的平均遗传相似系数为 0. 7368 ;选用的5对谷子引物均有良好的多态性及鉴别能来，能有效将45个谷子品种区分， 为进一步鉴别大量谷子品种提供了重要途径。
[0022] 2、本发明仅利用5对谷子引物就能够将谷子品种有效鉴别开，鉴别准确率高达 100%，在进一步鉴别大量谷子品种方面具有很大潜力，与现有专利相比，效果更佳，更节约 时间、成本等。
【具体实施方式】
[0023] 下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
[0024] 以下实施例中谷子品种名称及资源库号均来自于中国作物种质信息网。
[0025] 实施例1 :方法的建立
[0026] 1、准备谷子材料：将狼尾巴、白流沙、押死车1、白沁州黄、老来变、红粘谷、刀把 齐、勾根红、钱串子、大青苗、黄粘谷、红谷子、黄谷、鸭子嘴、大粒黄、红苗谷这15种谷子材 料种植于温室；取发芽后l〇d-15d左右的谷子幼芽，液氮冷冻后放入-80°C超低温冰箱中保 存备用；15种谷子品种的信息如表1所示。
[0027] 表1 15种谷子品种信息
[0029] 2、谷子DNA的提取：用植物基因组试剂盒提取各种谷子材料的DNA，用1%的琼脂 糖凝胶电泳检测DNA纯度；将各材料的DNA浓度稀释至50ng/ μ L后，置于-20°C冰箱中备 用；
[0030] 3、PCR扩增反应、电泳检测：PCR反应总体积为25 μ L，包括10 X PCR buffer 2. 5 μ L, MgC12 (25mM) 3 μ L, dNTP (IOmM) I. 25 μ L,正向引物（IOmM) 1 μ L，反向引物 (IOmM) 1 μ L，Taq 酶（5U/μ L) 0· 2 μ L，模板 DNA (50ng/μ L) 1 μ L，ddH20 16. 5 μ L ;PCR 的反应 程序为：94°C预变性3min ;94°C变性45s，50°C退火30s，72°C延伸30s，共30个循环；72°C 延伸10min，4°C保存；PCR扩增产物中加入6倍的Loading buffer 4 yL，取1.5 yL上样， 用8 %非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，银染显色。
[0031] 4、选用4个来源于不同基因组谷子的参比种质（CS01~CS04)，对本实验中合成 的130对SSR引物进行初筛，根据扩增产物多态性，选出45对在不同基因组谷子之间都有 差异的引物；然后再用11个参比种质材料（FS01~FSll)对这些多态性引物进行复筛，谷 子SSR复筛引物多态性信息见表2 ;最后选出了条带清晰、便于统计，且在不同谷子质间有 良好多态性的5对引物作为SSR核心引物。谷子SSR核心引物扩增的结果参见表3。非核 心引物信息见表4。
[0032] 表2谷子SSR复筛引物扩增结果
[0034] 表3谷子SSR核心引物扩增结果
[0035]
[0037] 表4非核心引物信息
[0038]
[0040] 5、统计分析：观察PCR产物电泳结果，Gel-Pro analyzer软件统计稳定且易于分 辨的差异性条带，谱带按〇、1系统记录，有此带时赋值为" 1"，无此带时赋值为"〇"，构建各 品种相应〇、1字符；记录结果利用NTsys-pc 2. 11计算遗传相似系数。
[0041] 6、结果与分析：
[0042] 6A、采用试剂盒提取的谷子DNA条带清晰明亮，无降解现象，DNA完整性好，分光光 度计检测发现A 26iv2s。比值在1. 8~2. 0之内，均能满足PCR的要求。
[0043] 6B、在所用的130对引物中有效扩增引物有104对，占总扩增引物的77. 0% ;在 不同基因组谷子间具有多态性的引物为45对，占有效扩增引物的43. 3%。根据11个谷子 品种扩增结果（表2)，SiGOl~SiG05的等位基因数较高、多态性良好、PIC值均大于0. 6 ; SiG06~SiG45的多态信息含