尼罗罗非鱼种质纯度鉴定用引物及pcr鉴定方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物检测鉴定技术，具体的说涉及对尼罗罗非鱼种质纯度进行PCR鉴定的引物及使用该引物的PCR鉴定方法。
【背景技术】
[0002]尼罗罗非鱼属于鲈形目，丽鱼科，罗非鱼属，原产于约旦的坦噶尼喀湖，我国于1978年从泰国引进并推广养殖，现在我国已是世界上最大的罗非鱼生产国和出口国。我国主要养殖的罗非鱼品种有尼罗罗非鱼，奥利亚罗非鱼和奥尼杂交罗非鱼等。由于不同品种的罗非鱼有很大的形态特征重叠，这使仅从形态上鉴别不同罗非鱼品种非常困难。另外，罗非鱼品种间很容易杂交，且杂交种可育，杂交种形态又与亲本性状很相似，因此，很容易造成罗非鱼种质混杂，导致优良经济性状退化，这也是目前制约我国罗非鱼养殖业发展的突出问题。在养殖过程中雌雄罗非鱼生长差异明显，雄鱼比雌鱼生长快，常常导致出池规格相差悬殊，从而降低了商品鱼的质量，减少了经济效益。
【发明内容】
[0003]解决的技术问题:为了快速、准确鉴定尼罗罗非鱼种质纯度，防止优良经济性状退化，本发明提供一种尼罗罗非鱼种质纯度鉴定用引物及PCR鉴定方法。
[0004]技术方案:一种尼罗罗非鱼种质纯度PCR鉴定用引物，所述引物能够对尼罗罗非鱼的MyoD基因进行扩增，生成一条长度为229bp的特异性扩增片段。
[0005]MyoD基因是成肌分化抗原基因Myogenic Differentiat1n Antigen的缩写，其在Gene bank数据库中的序列号为:⑶246722。
[0006]优选的，所述鉴定用引物的核苷酸序列为:
[0007]正向:5，-CATGGTGAGTTCAAGGAGCAC-3，
[0008]反向:5，-GAGAAAGTTACACACACAGGCAGCT-3，。
[0009]一种尼罗罗非鱼种质纯度PCR鉴定方法，该方法以尼罗罗非鱼血液样品中提取的基因组DNA为模板，采用引物进行PCR扩增，并根据1.5%的琼脂糖凝胶电泳判定结果。
[0010]优选的，所述鉴定方法中的PCR的反应体系为:10X反应MIX液5 yL，正反向引物各0.25 μ L，50ng/ μ L?lOOng/ μ L的DNA模板1 μ L，用灭菌双蒸水补足至10 μ L。
[0011]优选的，所述鉴定方法中的PCR的反应程序为:预变性94°C、2min ;94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸30s，30个循环；最后72°C延伸5min，4°C保存。
[0012]—种尼罗罗非鱼种质纯度PCR鉴定用试剂盒，包括权利要求1或2所述的引物。
[0013]有益效果:(1)使用本发明的引物对尼罗罗非鱼的基因组DNA进行扩增，生成一条229bp的特异性扩增片段，与奥利亚罗非鱼的1条264bp条带，奥尼罗非鱼的2条分别为229bp和264bp的条带，能够明显区分，因而可以简单、精确地对尼罗罗非鱼的种质纯度进行鉴定；(2)本发明所述引物特异性强，不会对目标片段以外的其它片段扩增；(3)本发明公开了使用所述引物的PCR鉴定方法，该方法操作快捷、结果准确，避免了采用传统形态学方法鉴定不同品种的罗非鱼带来的结果不稳定的缺陷。
【附图说明】
[0014]图1是尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼及奥尼罗非鱼种质鉴定结果；
[0015]其中，Μ为DL1000 ;1_3、11，12，17-19为尼罗罗非鱼；4，7为奥利亚罗非鱼；5,6,8, 10，13-16:奥尼罗非鱼；
[0016]图2是纯种尼罗罗非鱼种质鉴定结果；
[0017]其中，Μ为DL1000 ;1-23为尼罗罗非鱼。
【具体实施方式】
[0018]以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0019]实施例1
[0020]第1步、引物设计
[0021]根据尼罗罗非鱼的MyoD基因序列，利用引物设计软件Primer 5.0设计引物，引物序列为:
[0022]正向:5’-CATGGTGAGTTCAAGGAGCAC-3’
[0023]反向:5’-GAGAAAGTTACACACACAGGCAGCT-3’。
[0024]第2步、基因组DNA提取
[0025](1)取待检样品19尾，样品均由中国水产科学研究院淡水渔业研究中心宜兴渔场米得;
[0026](2)尾静脉采血，使用Axygen生产的AxyPrep血基因组DNA小量试剂盒，并按照说明书步骤抽提基因组DNA。
[0027]第3步、PCR鉴定方法建立
[0028](l)PCR的反应体系为:10X反应MIX液5 μ L，正反向引物各0.25 μ L，DNA模板1 μ L，用灭菌双蒸水补足至10 μ L ;
[0029](2)PCR的反应程序为:预变性94°C、2min ;94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸30s，30个循环；最后72°C延伸5min，4°C保存；
[0030](3)PCR反应结束后，产物用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳分析，采用凝胶成像仪拍照记录电泳结果。
[0031]如图1所示，电泳检测发现，尼罗罗非鱼都只有1条229bp的条带；奥利亚罗非鱼都只有1条264bp的条带；奥尼罗非鱼有2条条带，1条为229bp，另1条为264bp，由电泳图谱可将尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼以及奥尼罗非鱼区别开来。
[0032]从图中可知，采用本发明所述的尼罗罗非鱼种质纯度PCR鉴定用引物扩增基因组DNA时，无其他杂带出现，因此本发明设计的引物能够特异性的扩增目标序列。
[0033]实施例2
[0034]采用实施例1所述步骤鉴定尼罗罗非鱼的种质纯度。其中，待检尼罗罗非鱼23尾，中国水产科学研究院淡水渔业研究中心宜兴渔场采得。如图2所示，电泳检测发现，23尾待检鱼均有1条229bp条带，均为纯种尼罗罗非鱼。
【主权项】
1.一种尼罗罗非鱼种质纯度PCR鉴定用引物，其特征在于，所述引物能够对尼罗罗非鱼的MyoD基因进行扩增，生成一条长度为229bp的特异性扩增片段。2.根据权利要求1所述的一种尼罗罗非鱼种质纯度PCR鉴定用引物，其特征在于，引物的核苷酸序列为:正向:5’ -CATGGTGAGTTCAAGGAGCAC-3’反向:5’ -GAGAAAGTTACACACACAGGCAGCT-3’。3.权利要求1或2所述的一种尼罗罗非鱼种质纯度PCR鉴定方法，其特征在于，该方法以尼罗罗非鱼血液样品中提取的基因组DNA为模板，采用引物进行PCR扩增，并根据1.5%的琼脂糖凝胶电泳判定结果。4.根据权利要求3所述的一种尼罗罗非鱼种质纯度PCR鉴定方法，其特征在于，PCR的反应体系为:10X反应MIX液5 μ L，正反向引物各0.25yL，浓度为50ng/yL?100ng/yL的DNA模板1 μ L，用灭菌双蒸水补足至10 μ Lo5.根据权利要求3所述的一种尼罗罗非鱼种质纯度PCR鉴定方法，其特征在于，PCR的反应程序为:预变性94°C、2min ;94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸30s，30个循环；最后72°C延伸5min，4°C保存。6.一种尼罗罗非鱼种质纯度PCR鉴定用试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的引物。
【专利摘要】本发明公开了一种尼罗罗非鱼种质纯度鉴定用引物及PCR鉴定方法，所述引物能够对尼罗罗非鱼的MyoD基因进行扩增，生成一条229bp的特异性扩增片段。(1)使用本发明的引物对尼罗罗非鱼的基因组DNA进行扩增，生成一条229bp的特异性扩增片段，与奥利亚罗非鱼的1条264bp条带，奥尼罗非鱼的2条分别为229bp和264bp的条带，能够明显区分，因而可以简单、精确地对尼罗罗非鱼的种质纯度进行鉴定；(2)本发明所述引物特异性强，不会对目标片段以外的其它片段扩增；(3)本发明公开了使用所述引物的PCR鉴定方法，该方法操作快捷、结果准确，避免了采用传统形态学方法鉴定不同品种的罗非鱼带来的结果不稳定的缺陷。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105385759
【申请号】CN201510853041
【发明人】李红霞, 俞菊华, 唐永凯, 李建林, 于凡, 何杰
【申请人】中国水产科学研究院淡水渔业研究中心
【公开日】2016年3月9日
【申请日】2015年11月30日