一种与胆管癌相关的分子标记物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体地涉及LY6H基因在胆管癌诊断、治疗中的用途。
【背景技术】
[0002] 胆管癌是一种来源于肝内或肝外胆管上皮的恶性肿瘤，发生率较低，约占所有人 类恶性肿瘤的2%以下，消化道肿瘤的3%左右，但恶性程度很高，五年生存率大约5%。该 病发病没有悬殊的性别差异，男性发病率约为女性的1.5倍。全世界胆管癌病人的平均发 病年龄约在50岁，西方人平均发病年龄大于65岁。胆管癌的发病率在世界范围内差异很 大，其中东南亚发病率最高，非洲发病率最低。近年来，胆管癌的发病率有所提高，但是其高 恶性程度以及发病机制还不确定。早期预防、早期发现、早期治疗是提高人胆管癌手术根治 率和5年生存率的关键。
[0003] 胆管癌预后很差，5年生存率大约在5%。胆管癌对放疗化疗均不敏感，唯一治愈 性治疗为外科手术切除或肝移植，但大多数的病例在确诊时都已是晚期，失去了切除的机 会，病程多在12个月内，尤其是确诊后的三个月内死亡率极高。胆管癌的姑息性治疗可以 有旁路内引流术、置管引流术、支撑管放置术、光动力疗法等，对晚期胆管癌的生活质量有 所改善。早期外科手术可以提高胆管癌的生存率，但是目前仍然缺乏一种特异的和敏感的 诊断方法。
【发明内容】
[0004] 为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可用于胆管癌早期诊断的 分子标志物。相比传统的胆管癌的诊断方法，使用基因标志物来诊断胆管癌的具有及时性、 特异性和灵敏性，从而使患者在癌症早期就能知晓癌症风险，针对风险高低，采取相应的预 防和治疗措施。
[0005] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0006] 本发明提供了一种LY6H基因及其表达产物在制备诊断胆管癌的产品中的应用。
[0007] 进一步，上面所提到的诊断产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位 杂交或芯片检测LY6H基因及其表达产物的表达水平以诊断胆管癌的产品。
[0008] 进一步，所述用RT-PCR诊断胆管癌的产品至少包括一对特异扩增LY6H基因的引 物；所述用实时定量PCR诊断胆管癌的产品至少包括一对特异扩增LY6H基因的引物；所述 用免疫检测诊断胆管癌的产品包括：与LY6H蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断 胆管癌的产品包括：与LY6H基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断胆管癌的产品包 括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与LY6H蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包 括与LY6H基因的核酸序列杂交的探针。
[0009] 优选地，所述产品包括芯片、试剂盒。
[0010] 本发明提供了一种诊断胆管癌的产品，所述的产品能够通过检测胆管组织中LY6H 基因的表达水平来诊断胆管癌。
[0011] 进一步，所述产品包括芯片、或试剂盒。其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯 片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针 包括用于检测LY6H基因转录水平的针对LY6H基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括 固相载体以及固定在固相载体的LY6H蛋白的特异性抗体；所述试剂盒包括基因检测试剂 盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测LY6H基因转录水平的试剂； 所述蛋白免疫检测试剂盒包括LY6H蛋白的特异性抗体。
[0012] 进一步，所述试剂包括使用RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片方 法检测LY6H基因表达水平过程中所需的试剂。优选地，所述试剂包括针对LY6H基因的引 物和/或探针。根据SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列信息设计出可以用于检测LY6H基因 表达水平的引物和探针。
[0013] 与LY6H基因的核酸序列杂交的探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它 衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合， 任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针 的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度 对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一 般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自 身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。
[0014] 进一步，所述LY6H蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述LY6H蛋 白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰，例如，嵌合抗体、scFv、Fab、 F(ab'）2、Fv等。只要所述片段能够保留与LY6H蛋白的结合能力即可。用于蛋白质水平的 抗体的制备时本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体。
[0015] 本发明还提供了 LY6H基因及其表达产物在制备治疗胆管癌的药物中的应用。
[0016] -方面，本发明所述的"治疗胆管癌的药物"包括能够括抑制胆管癌细胞生长、促 进胆管癌细胞凋亡、抑制胆管癌细胞粘附、抑制胆管癌细胞迀移和侵袭。
[0017] 另一方面，本发明所述的"治疗胆管癌的药物"包含LY6H基因和/或其表达产物 的抑制剂。所述抑制剂包括抑制LY6H基因表达的物质、抑制LY6H基因表达产物稳定性的 物质、和/或抑制LY6H基因表达产物活性的物质。
[0018] 进一步，本发明所述的治疗胆管癌的药物包括：通过干扰RNA抑制LY6H基因表达 的双链核糖核酸，或基于LY6H抗原蛋白的肿瘤疫苗，或用于抑制LY6H蛋白活性的蛋白质。
[0019] 本发明还提供了一种用于治疗胆管癌的药物，所述药物包含LY6H基因和/或其表 达产物抑制剂。所述抑制剂包括抑制LY6H基因表达的物质、抑制LY6H基因表达产物稳定 性的物质、和/或抑制LY6H基因表达产物活性的物质。
[0020] 进一步，本发明所述抑制剂包括：通过干扰RNA抑制LY6H基因表达的双链核糖核 酸，或基于LY6H抗原蛋白的肿瘤疫苗、或用于抑制LY6H蛋白活性的蛋白质。
[0021] 本发明还提供了上述LY6H基因和/或其表达产物抑制剂在制备治疗胆管癌药物 中的应用。
[0022] 在本发明中，所述RNA干扰（RNA interference，RNAi)是指在进化过程中高度保 守的、由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现 象。使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，该技术已被广泛用于探索基因 功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。以细胞为基础的RNAi筛选在功能基因学 研究方面具有许多优势，主要表现在大多数细胞类型都能使用RNAi方法，并且相对较容易 下调或沉默任何目的基因的表达。
[0023] 为了确保LY6H基因能够被高效剔除或沉默，根据LY6H基因的mRNA序列设计 了 siRNA特异性片段。siRNA的设计根据已发表的通用设计原则（Elbashir et.al2001， Schwarz et. al 2003, Khvorova et. al 2003, Reynolds et. al 2004, Hsieh et. al 2004, Ui-Tei et. al 2004)，通过在线工具完成设计，该在线工具为：siRNASelectionProgram of Whitehead Institute (BingbingYuan et.al 2004, http://jura.wi.mit.edu/ bioc/siRNAext/)和 BLOCK-iTTM RNAi Designer ofINVITROGEN(winner of the 2004Frost&SulIivan Excellence in Research Award, https ://rnaidesigner. invitrogen. com/sirna/)。为了进一步提高siRNA片断的有效性，综合两个在线设计工具 的优点来设计用于筛选的siRNA片断。最后，通过同源性比对（NCBI BLAST)来过滤siRNA 序列，以提高siRNA片断的特异性并减少RNAi干扰的脱靶效应。
[0024] 本发明的药物还可与其他治疗胆管癌的药物联用，多种药物联合使用可以大大提 高治疗的成功率。
[0025] 本发明的药物还包括药学上可接受的载体，这类载体包括（但并不限于）：稀释 剂、赋形剂如乳糖、氯化钠、